專利名稱：β2－微球蛋白的抗原表位及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及β2-微球蛋白的抗原表位及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β2-微球蛋白是由99個氨基酸組成的單鏈多肽低分子蛋白。其氨基酸序列為Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-Cys-Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Glu-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe-Ser-Lys-Asp-Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-Cys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met在Cys 25和Cys 80有一個二硫鍵，平均分子量為11729.1694，單同位素分子量11721.7718。
β2-微球蛋白是Berggard于1968年首先從腎小管病變患者尿中分離出來的。β2-微球蛋白是有核細胞分泌的一種低分子球蛋白，可自由透過腎小球濾過99.0％在近曲小管重吸收，由99個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量為11800，它廣泛存在于人的血漿、尿和腦脊液等各種體液中及有核細胞膜的表面在正常情況，細胞表面上的β2-微球蛋白跟體液中游離的β2-微球蛋白反復(fù)結(jié)合解離，維持動態(tài)平衡。
β2-微球蛋白近年來受到相當重視，因為多種腫瘤病人的血清β2-微球蛋白水平上升。很多學(xué)者對其生物性能、病理生理及臨床意義進行了深入的研究。在臨床上有多種腫瘤如肺癌、腎癌、乳腺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤血、尿的β2-微球蛋白均有異常變化，一般是高于正常水平。因此，β2-微球蛋白已用于多種惡性腫瘤早期血清學(xué)診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供β2-微球蛋白的一個抗原表位及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之二是提供β2-微球蛋白的一個抗原表位的應(yīng)用。
本發(fā)明提供β2-微球蛋白的一個抗原表位，位于(61-67)位點，是氨基酸序列為SFYLLYY的多肽。
為了實現(xiàn)本發(fā)明提供β2-微球蛋白的抗原表位。我們利用親和質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF/MS)，將免疫親和提取方法與現(xiàn)代軟電離質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，系統(tǒng)的研究β2-微球蛋白與其抗體的特異性反應(yīng)，進而確定其抗原決定簇的位點和氨基酸序列，并對對抗原-抗體反應(yīng)的影響條件進行詳細的研究，探索活性蛋白質(zhì)固定載體上的最佳實驗條件建立微量快速靈敏的免疫學(xué)的新方法。實驗結(jié)果表明質(zhì)譜作為一種快速而有效的分析方法，是分析抗原決定簇的強有力的手段。
首先將其用蛋白酶水解產(chǎn)生一系列肽段，然后與固定在瓊脂糖珠上的單克隆抗體發(fā)生免疫親和反應(yīng)。反應(yīng)后收集珠子并用適當?shù)木彌_液沖洗多次。未與抗體結(jié)合的肽段則被沖洗掉，而含有抗原決定簇的肽段與抗體結(jié)合形成復(fù)合物同珠子一起保留下來，最后直接進行質(zhì)譜分析，得到和抗體結(jié)合的肽段質(zhì)譜數(shù)據(jù)。實驗中我們分別運用了Endoproteinase Lys-C、Glu-C和Trypsin三種不同切割位點的蛋白酶，并采取合成肽段的方式確定抗原與抗體結(jié)合部位即表位的位點為肽段(61-67)SFYLLYY。
抗原表位作為免疫細胞識別的靶結(jié)構(gòu)和激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于免疫反應(yīng)的相關(guān)研究具有重要意義。
本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY，可以刺激人體產(chǎn)生針對β2-微球蛋白的抗體。β2-微球蛋白能夠與其相對應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，因此本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY產(chǎn)生的抗體可以用作探針，識別β2-微球蛋白并與之發(fā)生免疫沉降反應(yīng)。因此本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY以及相對應(yīng)的抗體可用于疾病的早期血清學(xué)診斷、治療與預(yù)后的判斷。
本發(fā)明的小分子多肽可以通過化學(xué)合成或基因工程重組表達的方法制得。
實驗表明本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY能夠與β2-微球蛋白競爭，參與多抗特異性的結(jié)合；能夠有效的抑制抗體的功能，與合適的載體耦聯(lián)后具有與β2-微球蛋白相似的免疫原性。這就為用于制備新型疫苗和藥物提供了科學(xué)的依據(jù)。
結(jié)合一些生物技術(shù)，PCR、ELISA技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片，利用本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY可以用于開發(fā)新的診斷試劑盒和做為診斷芯片的靶蛋白，都有臨床應(yīng)用前景。
本發(fā)明的β2-微球蛋白的一個抗原表位為多種腫瘤，如肺癌、腎癌、乳腺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期血清學(xué)診斷和治療奠定了基礎(chǔ)；并開辟了新的技術(shù)途徑和新的應(yīng)用，為用于制備新型疫苗和藥物提供了科學(xué)的依據(jù)。
具體實施例方式
實施例1本實施例為β2-微球蛋白的抗原表位測定(1)試劑的配制稱取10mgCHCA溶于50％ACN+0.1％TFA中配制成10mg/ml的基質(zhì)溶液。5μg Endoproteinase Lys-C溶解在20μLMillpore超純水中，配制成濃度為0.25μg/μL的溶液。50μgEndoproteinase Glu-C溶解在200μL Millpore超純水中配制成濃度為0.25μg/μL的溶液。100μg的Trypsin溶解在200μL Millpore超純水中配制成濃度為0.5μg/μL的溶液。
(2)β2-微球蛋白的酶解反應(yīng)在1.5mL離心管中加入60μLEndoproteinase Glu-C(酶解緩沖溶液50mM的乙酸銨溶液，pH＝4.5)實驗按酶/底物為1∶20的比例加入到酶解緩沖溶液中，于37℃反應(yīng)2h，再置于-20℃終止酶解反應(yīng)。酶解液按ZiptipC18使用說明進行脫鹽處理。吸取1μL脫鹽后的酶解液與1μL CHCA基質(zhì)溶液點靶，于空氣中室溫自然干燥后做MALDI-TOF-MS分析。Trypsin(50mMTris-HCl 1mM CaCl2pH8.0)和Endoproteinase Lys-C(酶解緩沖溶液50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH＝8.0)按照Endoproteinase Glu-C酶解β2-微球蛋白的操作步驟進行。
(3)免疫親和在酶解混合肽段溶液中再加100μL TSO(75mMTris-HCl，200mM NaCl，0.5％N-octyl glucoside，pH＝8.0)緩沖溶液和10μg單克隆抗體(CloneGJ14，mouse IgG1)于4℃反應(yīng)4小時。取4μL Protein G/Protein AAgarose于溶液中混合均勻于4℃反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后于14000r/min離心，去上清液并收集瓊脂糖珠。每次用200μL TSO緩沖溶液洗3次瓊脂糖珠，再接著用200μL TSMK緩沖溶液(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM β-巰基乙醇，pH＝8.0)。取4μL基質(zhì)溶液與洗后的瓊脂糖珠混合均勻，最終取1.5μL混合液點靶，于空氣中室溫自然干燥，待干燥后做MALDI-TOF-MS分析。
采用Endoproteinase Glu-C所得到的β2-微球蛋白的連續(xù)表位范圍是肽段(51-69)，氨基酸序列為HSDLSFSKDWSFYLLYYTE；Endoproteinase Lys-C得到β2-微球蛋白的連續(xù)表位范圍為肽段(59-75)，氨基酸序列為DWSFYLLYYTEFTPTEK；Trypsin得到β2-微球蛋白的連續(xù)表位范圍為肽段(59-75)，氨基酸序列為DWSFYLLYYTEFTPTEK。得知β2-微球蛋白的表位范圍在肽段(59-69)之內(nèi)，即DWSFYLLYYTE。
(4)合成肽段的親和質(zhì)譜分析01--SFYLLYYTE，02---DWSFYLLYY，03---SFYLLY，04---FYLLYY；這四個肽段分別與單克隆抗體免疫共沉淀，并進行質(zhì)譜分析結(jié)果表明，01和02樣品能與抗體相結(jié)合，而03和04則不與抗體發(fā)生免疫共沉淀反應(yīng)。01和02樣品能與抗體相結(jié)合，那么兩者的相同序列的肽段—SFYLLYY可以與抗體結(jié)合，所以對01和02樣品的親和質(zhì)譜分析得到的結(jié)論是SFYLLYY含有β2-微球蛋白抗原決定簇。03合成的肽段序列則是SFYLLYY在C末端少了一個氨基酸殘基Y，即SFYLLY。04合成的肽段序列則是SFYLLYY在它N末端少了一個氨基酸殘基S，對03和04所做的親和質(zhì)譜分析可知03和04則不與抗體發(fā)生免疫共沉淀反應(yīng)，不和抗體相結(jié)合。
因此通過01、02、03和04樣品的親和譜分析得到的結(jié)果的是β2-微球蛋白抗原決定簇的氨基酸序列為SFYLLYY實施例2利用本發(fā)明的抗原表位肽從患者血清中篩選出了陽性血清，制備相對應(yīng)的抗體，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測了抗原表位SFYLLYY的相應(yīng)抗體在患者血清中與健康者的血清之間的滴度水平，50例樣本證實患者的血清滴度水平明顯高于健康者，統(tǒng)計學(xué)差異p＜0.01。
將β2-微球蛋白表位肽植入小鼠體內(nèi)免疫小鼠，免疫2次后，運用ELISA和Westen Blot檢測特異性的抗體的產(chǎn)生。實驗證明產(chǎn)生的抗體血清能夠與β2-微球蛋白特意性結(jié)合。此實驗結(jié)果表明β2-微球蛋白的一個抗原表位肽SFYLLYY與合適的載體耦聯(lián)后具有與β2-微球蛋白相似的免疫原性，進一步就可以將其用于制備新型疫苗和藥物。
序列表<110>中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所<120>β2-微球蛋白的抗原表位及應(yīng)用<160>1<210>1<211>7<212>PRT<400>1Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr1 權(quán)利要求
1.β2-微球蛋白的抗原表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列位于(61-67)位點，氨基酸序列為SFYLLYY。
2.如權(quán)利要求1所述的β2-微球蛋白的抗原表位的多肽的應(yīng)用，其特征在于以任何形式用于制備新型的抗多種腫瘤，如肺癌、腎癌、乳腺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤疫苗或藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的的β2-微球蛋白的抗原表位的多肽的應(yīng)用，其特征在于做為靶蛋白用于開發(fā)新的藥物和診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜與親和分離方法研究β2－微球蛋白的抗原表位。該抗原表位的氨基酸序列位于第61－67位點，序列為SFYLLYY。本發(fā)明的抗原表位可用于研發(fā)新的肽段疫苗，也可用作治療靶點，可以用于腫瘤相關(guān)疾病的診斷與預(yù)后的判斷提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號A61P35/00GK1831011SQ20061001676
公開日2006年9月13日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者劉淑瑩, 黎根, 劉志強, 劉寧, 宋鳳瑞, 萬翠紅 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所