專利名稱：一種適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒dna的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA疫苗、基因治療、DNA檢定等技術(shù)，尤其是大規(guī)模生產(chǎn)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的藥用級(jí)質(zhì)粒DNA產(chǎn)品，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)90年代開(kāi)始質(zhì)粒DNA作為基因治療和基因免疫主體得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，科研人員發(fā)現(xiàn)在給小鼠注射質(zhì)粒DNA后，小鼠可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力，隨之科研人員開(kāi)展了基因治療和基因疫苗的研究，開(kāi)發(fā)了病毒載體和非病毒載體(質(zhì)粒DNA)，他們均可以將外源基因有效的轉(zhuǎn)化至靶細(xì)胞從而可以產(chǎn)生治療作用和免疫保護(hù)作用。但病毒載體安全性方面存在問(wèn)題，已經(jīng)通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一點(diǎn)，因此它的應(yīng)用受到限制。然而非病毒載體(質(zhì)粒DNA)不存在安全方面的問(wèn)題，可以作為基因治療和DNA疫苗的優(yōu)良載體。白1995年以后，質(zhì)粒載體系統(tǒng)的研究每年以指數(shù)形式增加，大部分都用于基因治療和DNA疫苗，如癌癥、心血管疾病、艾滋病疫苗和乙肝疫苗等。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至靶細(xì)胞后，能夠影響靶細(xì)胞的生理狀態(tài)，會(huì)表達(dá)一些異源蛋白質(zhì)。質(zhì)粒DNA攜帶病原基因表達(dá)的蛋白會(huì)引起機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗此種病原的保護(hù)作用。從原理上講，此種免疫保護(hù)作用要強(qiáng)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)疫苗或菌苗，因?yàn)橘|(zhì)粒DNA注射后，轉(zhuǎn)化至靶細(xì)胞后，會(huì)持續(xù)表達(dá)目的蛋白，因而從理論上講注射一次DNA疫苗就可以達(dá)到終生免疫保護(hù)作用。然而質(zhì)粒DNA載體與病毒載體相比，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率比較低，據(jù)推測(cè)僅有干分之一的質(zhì)粒DNA會(huì)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞核而表達(dá)相應(yīng)的蛋白，因此注射用質(zhì)粒DNA必須達(dá)到毫克級(jí)才能滿足需求。
由于需要大量藥用級(jí)質(zhì)粒DNA，所以建立一套符合GMP的質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝是基因治療和基因免疫的保證。但目前小規(guī)模純化質(zhì)粒DNA只是實(shí)驗(yàn)室中一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，最常用的方法就是堿裂解法，通過(guò)氫氧化鈉和SDS作用將質(zhì)粒DNA從細(xì)胞溶質(zhì)中釋放出來(lái)，隨后通過(guò)酚氯仿抽提、乙醇沉淀得到質(zhì)粒DNA或通過(guò)氯化銫梯度超速離心的方法得到質(zhì)粒DNA，這些方法涉及到有機(jī)溶劑(例如酚氯仿)、有毒試劑(氯化銫)、外源性的酶(例如Rnase)及沉淀步驟(例如乙醇沉淀)，無(wú)法建立符合藥用級(jí)質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝，也不符合質(zhì)粒DNA的藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所以這些實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法只能得到適合于科學(xué)實(shí)驗(yàn)少量樣品制備，而不能作為工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，以解決目前的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法不適合工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的時(shí)存在的純化問(wèn)題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括以下步驟
、在含有5-20kb質(zhì)粒DNA的裂解液中，加入氯化鈣或硫酸銨溶液，使終濃度為0.2-2M/L鹽析沉淀，過(guò)孔徑1.0um濾膜得到澄清的裂解液；二、使含有質(zhì)粒DNA的裂解液經(jīng)過(guò)超濾裝置而過(guò)濾，截留分子量100-750KD之間，除去大部分RNA，并通過(guò)合適的透濾液進(jìn)行透濾；三、將超濾獲得的濃縮裂解液上樣到離子交換層析介質(zhì)柱子后，經(jīng)過(guò)濃度為0.1-0.5M的氯化鈉洗脫液洗去雜質(zhì)，用濃度為0.5-1M的氯化鈉洗脫液洗脫后，得到含有質(zhì)粒DNA的洗脫液；四、將步驟三中得到的含有質(zhì)粒DNA的洗脫液，用硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為100-300ms/cm，上樣到預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)柱子后收集流穿峰；五、將疏水流穿峰樣品上樣到分子篩層析介質(zhì)柱子，收集第一個(gè)峰；六、將步驟五得到的分子篩樣品，經(jīng)過(guò)過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置使樣品在無(wú)菌的條件下更換合適的緩沖液及使質(zhì)粒DNA濃度濃縮到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中步驟二中的超濾裝置包括中空纖維超濾器或膜包式超濾器。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中步驟二中的超濾裝置所采用的超濾膜的截留分子量在100-750KD之間。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中步驟三中的平衡離子交換層析緩沖液為醋酸鉀，濃度為0.1M-1M/L；其中EDTA的濃度為10-100mM，pH值為5.0-6.5，用于洗脫雜質(zhì)的濃度為0.1-0.5M/L的氯化鈉洗脫液和濃度為0.5-1M/L的氯化鈉洗脫液的EDTA濃度為10-100mM、Tris濃度為10-100mM，該兩種洗脫液的PH值為7.0-8.0。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中步驟四中平衡疏水層析緩沖液硫酸銨濃度為0.5M-4M/L；該平衡疏水層析緩沖液EDTA濃度為10-100mM，該平衡疏水層析緩沖液Tris濃度為10-100mM，該平衡疏水層析緩沖液的PH值為7.0-8.0。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中步驟六中過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置的結(jié)構(gòu)為樣品容器經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵連接到過(guò)濾器，過(guò)濾器的孔徑為0.22um，過(guò)濾器連接一個(gè)無(wú)菌密閉容器連接蠕動(dòng)泵，連接超濾器，超濾器包括中空纖維式超濾器和膜包式超濾器，超濾器所采用的超濾膜的截留分子量在100-750KD。
傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA純化工藝，去除RNA的方法是加入牛Rnase來(lái)降解RNA，但是并不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，原因在于既增加了成本又有傳播瘋牛病的可能。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，代替Rnase去除RNA最常用的方法之一是含有質(zhì)粒DNA的裂解液調(diào)節(jié)電導(dǎo)后，直接上離子交換層析，來(lái)去除RNA。方法之二是直接上分子篩，通過(guò)分子量大小差異來(lái)去除RNA。但這兩種方法都存在問(wèn)題方法一中純化出的質(zhì)粒DNA含有高分子RNA，還需要進(jìn)一步去除，原因在于陰離子層析介質(zhì)的無(wú)選擇性和大分子物在介質(zhì)孔徑中的擴(kuò)散抑制。所以通過(guò)離子交換很難將RNA徹底去除，還需要加入緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)電導(dǎo)，使上樣體積增大，生產(chǎn)周期變長(zhǎng)。而且目前商業(yè)化的層析介質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)藥物吸附容量較大，針對(duì)于核酸這樣的大分子來(lái)說(shuō)，吸附容量較低，如果將裂解液直接上樣，高分子RNA會(huì)被離子交換層析介質(zhì)吸附，降低質(zhì)粒DNA的吸附，嚴(yán)重影響離子交換層析介質(zhì)效率。通過(guò)分子篩的確能去除RNA，但上樣量太小(柱體積的5％)，流速慢，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本發(fā)明在質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝中并沒(méi)有加入專門(mén)的去除RNA的步驟，而是通過(guò)高鹽沉淀，超濾濃縮，離子交換三個(gè)步驟達(dá)到去除RNA的目的。其優(yōu)點(diǎn)在于高鹽沉淀來(lái)去除高分子RNA，超濾濃縮進(jìn)一步去除低分子RNA，并減少體積更換緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)裂解液的電導(dǎo)率，適合于上離子交換層析柱。前兩步去除95％的RNA，最后在通過(guò)離子交換層析柱完全去除RNA。通過(guò)高鹽沉淀與超濾濃縮的聯(lián)合運(yùn)用，同時(shí)也去除大部分的蛋白質(zhì)和部分內(nèi)毒素、宿主DNA。
內(nèi)毒素的去除是整個(gè)質(zhì)粒DNA純化工藝的瓶頸之一，原因在于內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA相比，分子量和電荷密度很接近。內(nèi)毒素的分子量從數(shù)十萬(wàn)到數(shù)千萬(wàn)，帶有大量的負(fù)電荷，這就意味著，用分子篩和離子交換層析技術(shù)很難將內(nèi)毒素降到很低的水平。QIAGEN公司的內(nèi)毒素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為小于100EU/mg。此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)是足夠的，但是臨床試驗(yàn)中，通常每劑量要達(dá)到數(shù)毫克，所以藥用質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)是小于10EU/mg，甚至更低。為了解決此難題，我們引入了疏水層析來(lái)去除內(nèi)毒素，得到了明顯的效果。疏水層析的原理是在較高鹽濃度下，生物大分子會(huì)通過(guò)疏水作用吸附在疏水介質(zhì)的疏水基團(tuán)上，當(dāng)逐漸降低洗脫液濃度時(shí)，生物大分子會(huì)按疏水性強(qiáng)弱依次洗脫，達(dá)到純化的目的。質(zhì)粒DNA由于有很強(qiáng)的親水性，上樣后不與疏水基團(tuán)相結(jié)合，形成了流穿峰。而內(nèi)毒素等污染物有較強(qiáng)的疏水性，與疏水基團(tuán)結(jié)合，當(dāng)逐漸降低洗脫液濃度時(shí)，被洗脫下來(lái)。從而達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。但由于疏水層析純化質(zhì)粒DNA屬于負(fù)吸附，內(nèi)毒素等污染物都被吸附在介質(zhì)上，所以前期需要通過(guò)高鹽沉淀超濾濃縮離子交換來(lái)大幅度降低樣品中的污染物的濃度，以達(dá)到良好的效果。疏水層析得到的樣品含有較高的鹽，通過(guò)分子篩來(lái)更換合適的緩沖液并進(jìn)一步去除污染物。
質(zhì)粒DNA不同于蛋白質(zhì)分子，其分子量可達(dá)數(shù)百萬(wàn)。在電鏡照片下顯示，與0.22um無(wú)菌濾膜大小相仿，如果質(zhì)粒DNA高濃度過(guò)濾，剪切力過(guò)大，勢(shì)必會(huì)造成超螺旋DNA變成開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)且產(chǎn)率降低。本發(fā)明通過(guò)“過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置”，先將低濃度的分子篩樣品進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，在無(wú)菌的環(huán)境下無(wú)菌超濾達(dá)到藥用級(jí)濃度。乙醇沉淀是實(shí)驗(yàn)室濃縮質(zhì)粒DNA的方法，但其并不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)樾枰褂秒x心機(jī)，耗時(shí)費(fèi)力，無(wú)菌操作不易控制，并使用有機(jī)試劑，需要進(jìn)一步完全去除。
本發(fā)明純化的質(zhì)粒DNA總回收率可達(dá)到50％以上，其產(chǎn)品各項(xiàng)檢定項(xiàng)目均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是適合工業(yè)化大生產(chǎn)的質(zhì)粒DNA純化方法。


圖1、離子交換層析圖譜1.0.3NaCl洗脫峰，2.質(zhì)粒DNA洗脫峰，3.CIP峰圖2、離子交換層析電泳圖譜1.上樣，2.流穿峰，3.0.3NaCl洗脫峰，4.質(zhì)粒DNA洗脫峰。
圖3、疏水層析圖譜1.疏水流穿峰，2.水峰。
圖4、疏水層析電泳圖譜1.樣品，2.疏水流穿峰，3.水峰。
圖5、分子篩層析圖譜1.樣品，2.質(zhì)粒DNA。
圖6、分子篩電泳圖譜1.樣品，2.質(zhì)粒DNA。
圖7過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例12000g含有5kb質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌體通過(guò)分子克隆指南所述方法進(jìn)行裂解，加入氯化鈣或硫酸銨溶液，使其終濃度為0.2M，鹽析沉淀通過(guò)1.0um濾芯過(guò)濾得到澄清裂解液為60L，經(jīng)過(guò)超濾裝置而過(guò)濾，超濾膜截留分子量100KD，除去大部分RNA，并通過(guò)0.5MKAC進(jìn)行透濾，濃縮到1/5體積12L，DNA濃度為200ug/ml；將超濾獲得的濃縮液上樣到離子交換層析介質(zhì)柱子后，緩沖液為醋酸鉀，濃度為0.1M/L；其中EDTA的濃度為10mM，pH值為5.0，經(jīng)過(guò)濃度為0.1M的氯化鈉洗脫液洗去雜質(zhì)，再用濃度為0.5M氯化鈉洗脫液洗脫后，用于洗脫雜質(zhì)的濃度為0.1M/L的氯化鈉洗脫液和濃度為0.5M/L的氯化鈉洗脫液的EDTA濃度為10mM、Tris濃度為10mM，該兩種洗脫液的PH值為7.0；得到含有質(zhì)粒DNA的洗脫液樣品6L，DNA濃度為290ug/ml；樣品用硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為100ms/cm，該緩沖液硫酸銨濃度為0.5M/L；該平衡疏水層析緩沖液EDTA濃度為10mM，該平衡疏水層析緩沖液Tris濃度為10mM，該平衡疏水層析緩沖液的PH值為7.0，上樣到預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA樣品體積7L，DNA濃度為250ug/ml；疏水樣品經(jīng)分子篩(Sepharose 4Fast Flow)層析更換緩沖液為PBS得到DNA體積12L，DNA濃度為150ug/ml。分子篩樣品，經(jīng)過(guò)“過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置”使樣品在無(wú)菌的條件下更換緩沖液為PBS及使質(zhì)粒DNA濃度濃縮到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)超濾濃縮濃度為2mg/ml，DNA體積800ml，過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置的結(jié)構(gòu)為樣品容器經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵連接到過(guò)濾器，過(guò)濾器的孔徑為0.22um，過(guò)濾器連接一個(gè)無(wú)菌密閉容器連接蠕動(dòng)泵，連接超濾器，超濾器包括中空纖維式超濾器和膜包式超濾器，超濾器所采用的超濾膜的截留分子量在100KD。
實(shí)施例22000g含有13kb質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌體通過(guò)分子克降指南所述方法進(jìn)行裂解，加入氯化鈣或硫酸銨溶液，使其終濃度為0.5M，鹽析沉淀通過(guò)1.0um濾芯過(guò)濾得到澄清裂解液為60L，經(jīng)過(guò)超濾裝置而過(guò)濾，超濾膜截留分子量300KD，除去大部分RNA，并通過(guò)0.5MKAC進(jìn)行透濾，濃縮到1/5體積12L，DNA濃度為200ug/ml；將超濾獲得的濃縮液上樣到離子交換層析介質(zhì)柱子后，經(jīng)過(guò)濃度為0.3M的氯化鈉洗脫液洗去雜質(zhì)，再用濃度為0.7M氯化鈉洗脫液洗脫后，該兩種洗脫液的EDTA濃度為50mM、Tris濃度為50mM，該兩種洗脫液的PH值為7.5；得到含有質(zhì)粒DNA的洗脫液樣品6L，DNA濃度為290ug/ml。離子交換層析圖譜見(jiàn)圖1，離子交換層析電泳圖譜見(jiàn)圖2，樣品用硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為200ms/cm，該緩沖液EDTA濃度為50mM，該平衡疏水層析緩沖液Tris濃度為50mM，該平衡疏水層析緩沖液的PH值為7.5；上樣到預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA樣品體積7L，DNA濃度為250ug/ml，疏水層析圖譜見(jiàn)圖3，疏水層析電泳圖譜見(jiàn)圖4。疏水樣品經(jīng)分子篩(Sepharose 4Fast Flow)層析更換緩沖液為PBS得到DNA體積12L，DNA濃度為150ug/ml。分子篩層析圖譜見(jiàn)圖5，分子篩層析電泳圖6。將得到的分子篩樣品，經(jīng)過(guò)“過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置”使樣品在無(wú)菌的條件下更換緩沖液為PBS及使質(zhì)粒DNA濃度濃縮到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)超濾濃縮濃度為3mg/ml，DNA體積500ml。過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置的結(jié)構(gòu)為，見(jiàn)圖7樣品容器經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵連接到過(guò)濾器，過(guò)濾器的孔徑為0.22um，過(guò)濾器連接一個(gè)無(wú)菌密閉容器連接蠕動(dòng)泵，連接超濾器，超濾器包括中空纖維式超濾器和膜包式超濾器，超濾器所采用的超濾膜的截留分子量在100KD。
實(shí)施例32000g含有20kb質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌體通過(guò)分子克隆指南所述方法進(jìn)行裂解，加入氯化鈣溶液，使其終濃度為2M，鹽析沉淀通過(guò)1.0um濾芯過(guò)濾得到澄清裂解液為60L，經(jīng)過(guò)超濾裝置而過(guò)濾，超濾膜截留分子量750KD，除去大部分RNA，并通過(guò)0.5MKAC進(jìn)行透濾，濃縮到1/5體積12L，DNA濃度為200ug/ml；將超濾獲得的濃縮液上樣到離子交換層析介質(zhì)柱子后，經(jīng)過(guò)濃度為0.5M的氯化鈉洗脫液洗去雜質(zhì)，再用濃度為1M氯化鈉洗脫液洗脫后，該兩種洗脫液的EDTA濃度為100mM、Tris濃度為100mM，該兩種洗脫液的PH值為8.0；得到含有質(zhì)粒DNA的洗脫液樣品6L，DNA濃度為290ug/ml；樣品用硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為300ms/cm，該緩沖液EDTA濃度為100mM，該平衡疏水層析緩沖液Tris濃度為100mM，該平衡疏水層析緩沖液的PH值為8.0；上樣到預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)(Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)柱子后收集流穿峰，得到DNA樣品體積7L，DNA濃度為250ug/ml；疏水樣品經(jīng)分子篩(Sepharose 4Fast Flow)層析更換緩沖液為PBS得到DNA體積12L，DNA濃度為150ug/ml，分子篩樣品，經(jīng)過(guò)“過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置”使樣品在無(wú)菌的條件下更換緩沖液為PBS及使質(zhì)粒DNA濃度濃縮到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)超濾濃縮濃度為2.5mg/ml，DNA體積650ml，過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置的結(jié)構(gòu)為樣品容器經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵連接到過(guò)濾器，過(guò)濾器的孔徑為0.22um，過(guò)濾器連接一個(gè)無(wú)菌密閉容器連接蠕動(dòng)泵，連接超濾器，超濾器包括中空纖維式超濾器和膜包式超濾器，超濾器所采用的超濾膜的截留分子量在750KD。
質(zhì)粒DNA生產(chǎn)各環(huán)節(jié)質(zhì)量表(以13kb質(zhì)粒為例)

權(quán)利要求
1.一種適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，包括以下步驟一、在含有5-20kb質(zhì)粒DNA的裂解液中，加入氯化鈣或硫酸銨溶液，使終濃度為0.2-2M/L鹽析沉淀，過(guò)孔徑1.0um濾膜得到澄清的裂解液；二、使含有質(zhì)粒DNA的裂解液經(jīng)過(guò)超濾裝置而過(guò)濾，截留分子量100-750KD之間，除去大部分RNA，并通過(guò)合適的透濾液進(jìn)行透濾；三、將超濾獲得的濃縮裂解液上樣到離子交換層析介質(zhì)柱子后，經(jīng)過(guò)濃度為0.1-0.5M的氯化鈉洗脫液洗去雜質(zhì)，用濃度為0.5-1M的氯化鈉洗脫液洗脫后，得到含有質(zhì)粒DNA的洗脫液；四、將步驟三中得到的含有質(zhì)粒DNA的洗脫液，用硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率為100-300ms/cm，上樣到預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)柱子后收集流穿峰；五、將疏水流穿峰樣品上樣到分子篩層析介質(zhì)柱子，收集第一個(gè)峰；六、將步驟五得到的分子篩樣品，經(jīng)過(guò)過(guò)濾器和超濾器聯(lián)動(dòng)裝置使樣品在無(wú)菌的條件下更換合適的緩沖液及使質(zhì)粒DNA濃度濃縮到符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，其特征在于步驟二中的超濾裝置包括中空纖維超濾器或膜包式超濾器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，其特征在于步驟二中的超濾裝置所采用的超濾膜的截留分子量在100-750KD之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，其特征在于步驟三中的平衡離子交換層析緩沖液為醋酸鉀，濃度為0.1M-1M/L；其中EDTA的濃度為10-100mM，pH值為5.0-6.5，用于洗脫雜質(zhì)的濃度為0.1-0.5M/L的氯化鈉洗脫液和濃度為0.5-1M/L的氯化鈉洗脫液的EDTA濃度為10-100mM、Tris濃度為10-100mM，該兩種洗脫液的PH值為7.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，其特征在于步驟四中平衡疏水層析緩沖液硫酸銨濃度為0.5M-4M/L；該平衡疏水層析緩沖液EDTA濃度為10-100mM，該平衡疏水層析緩沖液Tris濃度為10-100mM，該平衡疏水層析緩沖液的PH值為7.0-8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化方法，其特征在于步驟六中過(guò)濾器與超濾器聯(lián)動(dòng)裝置的結(jié)構(gòu)為樣品容器經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵連接到過(guò)濾器，過(guò)濾器的孔徑為0.22um，過(guò)濾器連接一個(gè)無(wú)菌密閉容器連接蠕動(dòng)泵，連接超濾器，超濾器包括中空纖維式超濾器和膜包式超濾器，超濾器所采用的超濾膜的截留分子量在100-750KD。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的純化工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。通過(guò)對(duì)堿裂解后的產(chǎn)品進(jìn)行超濾、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析、除菌過(guò)濾、無(wú)菌濃縮最終得到符合藥用濃度的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明純化的質(zhì)粒DNA總回收率可達(dá)到50％以上，其產(chǎn)品各項(xiàng)檢定項(xiàng)目均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1876820SQ200610016880
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者孔維, 殷玉和, 孫博 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)