專利名稱：大黃素、蘆薈大黃素提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從大黃中提取大黃素和蘆薈大黃素的方法及大黃素和蘆薈大黃素在抗腦缺血損傷方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蓼科植物大黃或其他變種的植物根莖中含有大黃素、蘆薈大黃素。大黃素異名朱砂蓮甲素(Frangula emodin，Rheum emodin，Archin，F(xiàn)rangulic acid)，化學(xué)名9，10-Anthracenedione，1，3，8-thihydroxy-6-methyl，結(jié)構(gòu)式為 分子式為C15H10O5，分子量270.33；為橙色針狀結(jié)晶(乙醇或12毫米以下減壓升華)，熔點256-257℃，幾乎不溶于水，溶于乙醇及堿溶液。其植物來源為廖科植物掌葉大黃根莖、齒果酸模、齒果酸模根和葉、皺葉酸模的根、羊蹄根、杠板歸根和根莖、豆科植物決明新鮮種子、望江南根。蘆薈大黃素異名蘆薈瀉素(Rhabarberone)，化學(xué)名9，10-Anthracenedione，1，8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)，結(jié)構(gòu)式為 分子式為C15H10O5，分子量270.23；為橙色針狀結(jié)晶(甲苯)，熔點223-224℃，易溶于熱乙醇，在乙醚及苯中呈黃色、氨水及硫酸中呈緋紅色。其植物來源為廖科植物掌葉大黃根莖、藥物大黃根莖、巴天酸模根、齒果酸模葉、決明種子、望江南種子、豆科植物山扁豆根、鼠李科植物鼠李的果實。
藥理研究表明，大黃素(1)體外可抑制金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌等各種細菌、還可抑制胃幽門螺桿菌。(2)可抑制不同有絲分裂原(Con A，LPS)刺激的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)；抑制Con A誘導(dǎo)脾細胞IL2的產(chǎn)生，其抑制作用與大黃素的濃度成正比。(3)30mg/kg于家兔灌胃有利尿作用。(4)體外對艾氏腹水癌細胞的50％的抑制濃度為20mg/kg。(5)42mg/kg連續(xù)7天于小鼠腹腔注射，使肝微粒體細胞色素瘤的抑制率為75％[15]；10ug/kg的濃度對肺癌A-549細胞的分裂和DNA的生物合成有抑制作用；42mg/kg連續(xù)7天小鼠腹腔注射，使肝微粒體細胞色素P-450含量較對照組下降41.7％；使戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間比對照組延長18.7％。(6)對淋巴細胞外鈣內(nèi)流有明顯的促進作用，對淋巴細胞免疫功能有抑制作用；也可促進細胞內(nèi)鈣釋放。(7)100mg/kg給大鼠腹腔注射，可使腸梗阻所致腸粘膜降低了的組胺水平恢復(fù)到正常。(8)體外18.5umol/L可使NE和高鉀誘導(dǎo)的主動脈條收縮的量效曲線左移，可能與鈣激動作用有關(guān)，92.5umol/L可抑制主動脈條的收縮作用是量效曲線右移，可能與大黃素絡(luò)合鈣離子作用有關(guān)。(9)可抑制正常動脈硬化的動脈及球囊損傷動脈壁血管平滑肌細胞增殖，主要機制為抑制細胞從G0期向G5期轉(zhuǎn)化，并呈劑量相關(guān)性。(10)在5×10-7-5×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，可抑制大鼠腹腔巨嗜細胞白三烯的生物合成，量效關(guān)系明顯。(11)將大黃素純品直接加入細胞培養(yǎng)液可抑制細胞增殖，25mg/L可抑制腎小管原癌基因mRNA的表達；還可抑制平滑肌細胞增殖。蘆薈大黃素(1)體外可抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、白喉桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌等各種細菌、對胃幽門螺桿菌有抑制生長作用。(2)70mg/kg連續(xù)7天腹腔注射于小鼠，對免疫系統(tǒng)有不同程度的抑制作用。(3)為一種強的平滑肌細胞抑制劑，對平滑肌細胞有抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法及大黃素、蘆薈大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用。
為達上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加熱回流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用無機酸水溶液水解，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用乙醇水溶液洗脫除去雜質(zhì)，繼用乙醇與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，回收溶劑，濃縮至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素。
步驟(1)中粉碎后的大黃藥材加藥材重量6-16倍的重量百分比濃度40％-80％的乙醇水溶液常溫浸泡0.5-4小時，加熱回流提取3-6次，每次0.5-3小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏。
步驟(2)中浸膏用其重量5-20倍的重量百分比濃度5％-20％的無機酸水溶液水浴加熱水解0.5-1.5小時，酸水液濾過去渣。
步驟(3)中去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用4-12倍層析柱體積的重量百分比濃度10％-50％乙醇水溶液洗脫除去雜質(zhì)，繼用重量百分比濃度60％-95％乙醇水溶液與丙酮混合液梯度洗脫，乙醇水溶液與丙酮體積比為1∶30～30∶1，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取3-6次，減壓回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，乙酸乙酯與丙酮體積比為1∶20～20∶1，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素。
大黃素、蘆薈大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，以大黃素或者蘆薈大黃素為有效成分。
本發(fā)明以在國內(nèi)廣泛種植的大黃藥材為原料，原料價廉易得；以乙醇水溶液作為提取溶劑進行提取，原料成本低，提取效果好，且生產(chǎn)過程中無三廢產(chǎn)生，環(huán)保效益好；提取并經(jīng)無機酸(鹽酸或者硫酸)水解后采用層析純化，所得提取物中大黃素、蘆薈大黃素含量高，可達80-98％。
下面通過大黃素、蘆薈大黃素抗腦缺血損傷的動物實驗研究證明大黃素、蘆薈大黃素的抗腦缺血損傷作用[材料與方法]
(1)實驗材料SD大鼠，3～4月齡，90只，雌雄各半，體重300±50g，由河南省實驗動物中心提供(編號2003LA-130，合格證號0001012號)。大黃素、蘆薈大黃素注射劑(均由河南中醫(yī)學(xué)院藥物分析學(xué)學(xué)科提供)，川芎嗪注射液(山東濰坊制藥有限公司；規(guī)格2ml，40mg；批號030314)。
(2)分組與處理大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、川芎嗪組、大黃素組，蘆薈大黃素組，其中后2組又各分為低、中、高3個劑量組。每組10只大鼠。各組大鼠均于造模前3天腹腔注射用藥川芎嗪注射液(7.2mg·kg-1·d-1)、大黃素(1.40mg·kg-1·d-1、2.80mg·kg-1·d-1、5.60mg·kg-1·d-1)，蘆薈大黃素(0.04mg·kg-1·d-1、0.08mg·kg-1·d-1、0.16mg·kg-1·d-1)，每日用藥一次，造模前2h加用藥一次。注射液體積為1ml/100g，假手術(shù)組和模型組分別腹腔注射同等體積的生理鹽水。所有實驗大鼠均于術(shù)前12h禁食不禁水。造模后6h依神經(jīng)癥狀八級評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分。
(3)模型制備采用改良的Longa法制備局灶性腦缺血模型(MCAO)，假手術(shù)組不插入栓線。實驗過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃、室溫(26±1)℃。
(4)取材與樣品制備術(shù)后6小時冰盤上取出全腦，用冷生理鹽水(4℃)沖洗3遍，除去積血，用濾紙吸去表面水份，去除嗅球、小腦和腦干。于冰盤上迅速分離大腦半球，取左側(cè)半球，從額極向后4mm處冠狀切取腦組織3mm，待側(cè)腦組織含水量；再向后冠狀切取腦組織2mm，放入2％四氮唑，進行TTC染色，待測腦梗塞面積。
(5)觀察指標(biāo)①神經(jīng)癥狀評分。造模后6h觀察大鼠神經(jīng)癥狀體征，參照評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分，記錄分值；②腦組織含水量測定。切取的用于測定含水量的腦組織迅速用電子天平稱取濕重(精確度為0.1mg)后放入干燥箱中干燥(100℃±2℃)，24h后稱取干重。計算公式腦組織含水量＝(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100；③腦梗塞面積測定。切取腦組織2mm，放入2％四氮唑，37℃水浴鍋溫孵30min后放入10％甲醛溶液，15min后取出腦組織，數(shù)碼相機分別對腦片額側(cè)和枕側(cè)進行拍照，應(yīng)用計算機軟件測定腦組織梗塞面積與相應(yīng)側(cè)總面積，計算面積比值。計算公式面積比值＝梗塞面積/總面積。
(6)統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料以(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，進行單因素方差分析。
(1)神經(jīng)癥狀評分腦缺血大鼠的神經(jīng)癥狀評分增高(5.75±0.57)；大黃素高(4.50±0.52)、中(3.90±0.99)、低(2.70±0.48)劑量組大鼠的神經(jīng)癥狀評分降低；蘆薈大黃素高(3.10±0.73)、中(4.30±0.48)、低(5.20±0.91)劑量組的神經(jīng)癥狀評分降低；其中大黃素低劑量組(1.40mg·kg-1·d-1)和蘆薈大黃素高劑量組(0.16mg·kg-1·d-1)降低尤為顯著。
(2)腦組織含水量腦缺血大鼠腦組織含水量明顯增高(83.42±1.50)；大黃素高(80.98±4.31)、中(79.11±1.22)、低(76.55±1.08)劑量組大鼠的腦組織含水量明顯降低；蘆薈大黃素高(76.86±1.43)、中(81.75±1.22)、低(83.02±1.39)劑量組的腦組織含水量降低；其中大黃素低劑量組(1.40mg·kg-1·d-1和蘆薈大黃素高劑量組(0.16mg·kg-1·d-1)降低尤為顯著。
(3)腦梗塞面積腦缺血大鼠腦梗塞面積明顯增高(34.87±1.33)；大黃素高(32.90±2.92)、中(32.75±1.24)、低(27.70±1.28)劑量組大鼠的腦梗塞面積明顯降低；蘆薈大黃素高(29.00±1.59)、中(30.95±1.10)、低(33.33±1.67)劑量組的腦梗塞面積降低；其中大黃素低劑量組(1.40mg·kg-1·d-1)和蘆薈大黃素高劑量組(0.16mg·kg-1·d-1)腦梗塞面積降低尤為顯著。
通過研究，我們發(fā)現(xiàn)從大黃中提取的大黃素、蘆薈大黃素可以改善腦缺血后的神經(jīng)癥狀，減輕腦組織水腫，減小腦梗塞面積，對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用，其中以大黃素低劑量(1.40mg·kg-1·d-1)和蘆薈大黃素高劑量(0.16mg·kg-1·d-1)對腦缺血損傷的保護作用尤為明顯。
從大黃中提取的大黃素、蘆薈大黃素可以改善腦缺血后的神經(jīng)癥狀，減輕腦組織水腫，減小腦梗塞面積，對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用，其中以大黃素低劑量(1.40mg·kg-1·d-1)和蘆薈大黃素高劑量(0.16mg·kg-1·d-1)對腦缺血損傷的保護作用尤為明顯。結(jié)合目前腦缺血的治療研究進展和大黃素、蘆薈大黃素的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明關(guān)于大黃素及蘆薈大黃素的提取方法以及所提取的大黃素及蘆薈大黃素在抗缺血性腦損傷方面的研究結(jié)果，為臨床治療腦缺血及其他缺血性腦血管疾病的防治提供了直接依據(jù)。
具體實施例方式
實施例1、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥材重量10倍的重量百分比濃度60％的乙醇水溶液常溫浸泡2小時，加熱回流提取4次，每次1小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量10倍的重量百分比濃度15％的鹽酸水溶液水浴加熱水解1小時，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液用等量三氯甲烷提取4次，減壓回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液(體積比1∶20～1∶1)洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，得到蘆薈大黃素；用乙酸乙酯與丙酮混合液(體積比1∶1～20∶1)洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例2、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥材重量12倍的重量百分比濃度70％的乙醇水溶液常溫浸泡4小時，加熱回流提取3次，每次40分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量8倍的重量百分比濃度20％的硫酸水溶液水浴加熱水解40分種，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用30％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，繼用80％乙醇與丙酮(體積比1∶30～1∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到蘆薈大黃素，繼用80％乙醇與丙酮(體積比1∶1～30∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例3、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥材重量8倍的重量百分比濃度50％的乙醇水溶液常溫浸泡3小時，加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比濃度15％的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用40％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶30～1∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到蘆薈大黃素；繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶1～30∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例4、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥材重量6倍的重量百分比濃度40％的乙醇水溶液常溫浸泡3小時，加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比濃度15％的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用40％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶30～1∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到蘆薈大黃素；繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶1～30∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例5、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥材重量16倍的重量百分比濃度80％的乙醇水溶液常溫浸泡3小時，加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用其重量6倍的重量百分比濃度15％的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用40％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶30～1∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到蘆薈大黃素；繼用70％乙醇與丙酮(體積比1∶1～30∶1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例6、大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，以其制備大黃素注射劑。制法提取所得大黃素用乙醇溶解，緩緩加入丙三醇液中，攪拌均勻后，加注射用水至近總量時，用重量百分比濃度1％的氫氧化鈉水溶液調(diào)PH值至3.5～4.5，加入注射用水至總量，混合均勻，0.45μm微孔濾膜濾過，通氮氣灌封于2ml安瓿中，100℃滅菌30min，即得。規(guī)格2ml；組成大黃素50mg、8％乙醇、20％丙三醇、蒸餾水；用法用量每日一次，每次1支，肌肉注射。
實施例7、大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，以其制備大黃素片。制法提取所得大黃素粉碎成細粉，加淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉混合均勻，制成顆粒，壓片，包薄膜衣，即得。規(guī)格0.25g；組成蘆薈大黃素20mg、淀粉0.2g、硬脂酸鎂0.02g、滑石粉適量；用法用量口服，一日3次，每次1片。
實施例8、蘆薈大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，以其制備蘆薈大黃素膠囊。制法提取所得蘆薈大黃素粉碎成細粉，加淀粉、滑石粉混合均勻，制成顆粒，干燥后裝入膠囊殼，即得。規(guī)格0.15g；組成蘆薈大黃素0.5mg、淀粉0.14g、滑石粉適量；用法用量口服，一日3次，每次1粒。
實施例9、蘆薈大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，以其制備蘆薈大黃素注射劑。制備方法提取所得蘆薈大黃素用乙醇溶解，緩緩加入丙三醇液中，攪拌均勻后，加注射用水至近總量時，用重量百分比濃度1％的氫氧化鈉水溶液調(diào)PH值至3.5～4.5，加入注射用水至總量，混合均勻，0.45μm微孔濾膜濾過，通氮氣灌封于2ml安瓿中，100℃滅菌30min，即得。規(guī)格1ml；組成蘆薈大黃素1mg、5％乙醇、10％丙三醇、蒸餾水；用法用量每日一次，每次1支，肌肉注射。
權(quán)利要求
1.從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，其特征在于，依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加熱回流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用無機酸水溶液水解，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用乙醇水溶液洗脫除去雜質(zhì)，繼用乙醇與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，回收溶劑，濃縮至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素。
2.如權(quán)利要求1所述的從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，其特征在于，步驟(1)中粉碎后的大黃藥材加藥材重量6-16倍的重量百分比濃度40％-80％的乙醇水溶液常溫浸泡0.5-4小時，加熱回流提取3-6次，每次0.5-3小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏。
3.如權(quán)利要求1或2所述的從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，其特征在于，步驟(2)中浸膏用其重量5-20倍的重量百分比濃度5％-20％的無機酸水溶液水浴加熱水解0.5-1.5小時，酸水液濾過去渣。
4.如權(quán)利要求3所述的從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，其特征在于，步驟(3)中去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用4-12倍層析柱體積的重量百分比濃度10％-50％乙醇水溶液洗脫除去雜質(zhì)，繼用重量百分比濃度60％-95％乙醇水溶液與丙酮混合液梯度洗脫，乙醇水溶液與丙酮體積比為1∶30～30∶1，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取3-6次，減壓回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，乙酸乙酯與丙酮體積比為1∶20～20∶1，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素。
5.大黃素、蘆薈大黃素在制備抗腦缺血損傷藥物方面的應(yīng)用，其特征在于，以大黃素或者蘆薈大黃素為有效成分。
全文摘要
從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、加熱回流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用無機酸水溶液水解，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚酰胺層析柱，用乙醇水溶液洗脫除去雜質(zhì)，繼用乙醇與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，回收溶劑，濃縮至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通過硅膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，分別得到蘆薈大黃素、大黃素。利用本發(fā)明得到的大黃素、蘆薈大黃素可用于制備抗腦缺血損傷藥物。
文檔編號A61P9/10GK1887837SQ20061001774
公開日2007年1月3日 申請日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者李建生, 梁生旺, 鄭曉珂, 劉敬霞, 劉軻 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院