專利名稱：：雞志賀氏菌滅活油乳疫苗及其研制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型獸用生物制品及其研制方法，特別是涉及一種雞志賀氏菌滅活油乳疫苗及其研制方法。二
背景技術(shù)：
：雞志賀氏菌病是由雞志賀氏菌引起的雞的一種新發(fā)急性傳染病。該病主要特征為拉稀、痢疾和明顯的腸道病變。早期調(diào)查顯示在同一個養(yǎng)雞場發(fā)病率可高達(dá)100%，死亡率達(dá)3.8433.5%。耐過雞表現(xiàn)消瘦，生長發(fā)育緩慢。由于該病是雞的一種新發(fā)傳染病，人們對其知之甚少，常常被誤診為雞白痢或雞球蟲病等，給該病防治工作造成很大困難，結(jié)果導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明人除首次發(fā)現(xiàn)雞志賀氏菌病，近年還利用發(fā)明的雞志賀氏菌診斷液和微量平板凝集試驗快速檢測方法，對我國河南、山東等不同地區(qū)35家雞場具有拉稀病史的670只雞血清滅活樣品進(jìn)行了檢測。通過檢測對雞志賀氏菌病的發(fā)病率、流行地區(qū)、品種、日齡及有無混合感染等進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)査。調(diào)查結(jié)果表明目前我國部分地區(qū)存在有雞志賀氏菌感染，其血清抗體陽性率較高，達(dá)28.333.7%，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過雞白痢。目前國內(nèi)外教科書均指出志賀氏菌具有高度的傳染性，可引起人的腸炎痢疾，并以14歲兒童發(fā)病率和死亡率較高。國內(nèi)外多篇報道指出志賀氏菌可感染猴子，還可感染犢牛、仔豬、家兔、小白鼠、豚鼠等。所有痢疾桿菌均能產(chǎn)生內(nèi)毒素、細(xì)胞毒素、腸毒素(外毒素)。痢疾桿菌對腸道的致病作用主要依靠菌毛對粘膜上皮細(xì)胞的粘附，繼而穿入粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)及粘膜固有層內(nèi)繁殖而引起炎癥。為了有效預(yù)防雞志賀氏菌的感染，降低該病的發(fā)病率和死亡率，防止人禽交叉感染，減少因該病造成的環(huán)境污染，本發(fā)明人開展了雞志賀氏菌滅活疫苗的研制，這對提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)和社會效益具有重要的意義和價值。由查新報告得知，以前雞志賀氏菌病在國內(nèi)外均未見有報道，2003年初該病由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，并于2003年和2005年在國內(nèi)外重要專業(yè)學(xué)術(shù)會議上及2004年國內(nèi)重要專業(yè)刊物上公開發(fā)表，"雞志賀氏菌病在我國的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究"一文，不僅公開發(fā)表于2004年第4期《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》，而且還于2003年10月獲得第10次全國家畜傳染病學(xué)術(shù)會議大會優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文。此外，該論文英文摘要還被收錄于2005年8月在土耳其舉辦的第14屆世界禽病學(xué)術(shù)大會論文集。為了對多種動物有效預(yù)防該病的發(fā)生，本發(fā)明人利用分離到的雞志賀氏菌研制出該菌滅活疫苗，并利用本發(fā)明產(chǎn)品對雞進(jìn)行免疫接種，同時進(jìn)行了疫苗免疫功能和免疫保護(hù)力的測定，為有效預(yù)防該病提供了可靠依據(jù)和重要條件。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效預(yù)防雞志賀氏菌感染的滅活油乳疫苗及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，含有有效劑量的滅活雞志賀氏菌和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。所述的佐劑為費氏佐劑、礦物油、植物油乳化佐劑中的任一種；所述的滅活雞志賀氏菌為雞痢疾志賀氏菌，或雞鮑氏志賀氏菌，或雞福氏志賀氏菌，或雞宋內(nèi)氏志賀氏菌中的任一種滅活菌；所述的疫苗中含滅活雞志賀氏菌數(shù)為5億~7.5億/ml。一種雞志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)菌種傳代和復(fù)壯將純化的雞志賀氏菌用1%葡萄糖肉湯進(jìn)行接種，在37士0.5-C條件下培養(yǎng)2430h,然后用血液平板培養(yǎng)復(fù)壯；(2)細(xì)菌接種和擴(kuò)大培養(yǎng)將復(fù)壯的雞志賀氏菌接種1%葡萄糖肉湯進(jìn)行一代培養(yǎng)，然后將一代培養(yǎng)物用大量1%葡萄糖肉湯進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并用滅菌棉球蘸取培養(yǎng)好的雞志賀氏菌菌液，均勻涂抹于SS瓊脂平板上，置37i0.5'C培養(yǎng)2430h;(3)收集細(xì)菌在長滿雞志賀氏菌菌苔的SS平板上，每平板傾入0.85%滅菌生理鹽水35ml，刮取SS平板上的雞志賀氏菌菌苔，然后將刮取的菌液移入無菌瓶中；(4)細(xì)菌計數(shù)和濃度調(diào)整將1%葡萄糖肉湯的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，并用SS平板上刮取的雞志賀氏菌菌液對肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌濃度調(diào)整，調(diào)整菌數(shù)為20-30億/ml;(5)細(xì)菌滅活向調(diào)整好細(xì)菌濃度的1%葡萄糖肉湯細(xì)菌培養(yǎng)物中加入甲醛進(jìn)行滅活，搖勻，使甲醛的最終濃度為0.5%，37士0.5'C條件下作用2430h;(6)加入佐劑向制備好的細(xì)菌滅活肉湯中加入佐劑，肉湯與佐劑的體積比為1:3，混合均勻后制成疫苗。所述的油乳疫苗中含滅活雞志賀氏菌數(shù)為5~7.5億/ml;所述的雞志賀氏菌為雞痢疾志賀氏菌，或為雞鮑氏志賀氏菌，或為雞福氏志賀氏菌，或為雞宋內(nèi)氏志賀氏菌中的任一種；所述的佐劑為費氏佐劑、礦物油、植物油乳化佐劑中的任一種；所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗在預(yù)防雞志賀氏菌感染方面的應(yīng)用。本發(fā)明的積極有益效果(1)利用本發(fā)明的油乳疫苗，結(jié)合本發(fā)明人的另一發(fā)明滅活鋁膠苗對雞進(jìn)行免疫接種，可有效預(yù)防雞的志賀氏菌感染。經(jīng)測定，免疫動物的細(xì)胞免疫和體液免疫水平顯著提高，免疫保護(hù)率達(dá)85.1100%以上，從而達(dá)到有效預(yù)防雞志賀氏菌感染的目的。(2)本發(fā)明疫苗具有性能穩(wěn)定、易保存、無毒、無污染、簡便易行等優(yōu)點；雞免疫后產(chǎn)生免疫作用快、免疫力強、保護(hù)率高等特點。(3)由査新得知，利用雞志賀氏菌發(fā)明的"雞志賀氏菌滅活油乳疫苗"產(chǎn)品，目前在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)。本發(fā)明產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中，使雞志賀氏菌感染率大大減少，在有效預(yù)防和控制雞志賀氏菌感染方面發(fā)揮了積極的重要作用。(4)本發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，對有效控制雞志賀氏菌感染，保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和綠色食品安全，防止人和動物交叉感染具有重要意義。大量試驗已證明，志賀氏菌可引起人禽交叉感染，故本發(fā)明產(chǎn)品和技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅在獸醫(yī)方面，而且在醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生方面，均具有重要的理論和現(xiàn)實意義。(5)我國是一個養(yǎng)殖大國，要生產(chǎn)出更多優(yōu)質(zhì)安全的畜禽產(chǎn)品，該疫苗具有十分廣闊的應(yīng)用前景，可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。四圖l兩組E—花環(huán)形成率變化規(guī)律圖，圖2各組抗體效價消長規(guī)律曲線圖，圖3免疫組和未免疫組抗體效價水平曲線圖，圖4免疫組和未免疫組E-花環(huán)形成率規(guī)律曲線圖。五具體實施方式-發(fā)明原理利用分離鑒定的雞志賀氏菌經(jīng)加工研制成疫苗，可用于該病的免疫預(yù)防接種。其原理是根據(jù)免疫學(xué)中疫苗抗原能夠刺激機體產(chǎn)生抗體和細(xì)胞因子，二者可分別提高機體的體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能，從而使機體獲得抵抗志賀氏菌感染的能力。該原理屬于免疫學(xué)基本原理的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。實施例一雞鮑氏志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備1、制備步驟(1)菌種傳代和復(fù)壯將純化的雞志賀氏菌接入1%葡萄糖肉湯中，在37'C條件下培養(yǎng)24h，然后用血液平板培養(yǎng)復(fù)壯；(2)細(xì)菌接種和擴(kuò)大培養(yǎng)將復(fù)壯的雞志賀氏菌接種1%葡萄糖肉湯進(jìn)行一代培養(yǎng)，然后將一代培養(yǎng)物用大量1%葡萄糖肉湯進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用滅菌棉球蘸取培養(yǎng)好的雞志賀氏菌菌液，均勻涂抹于SS瓊脂平板上，置37。C培養(yǎng)24h;(3)收集細(xì)菌在長滿志賀氏菌菌苔的SS平板上，每平板傾入35ml0.85%滅菌生理鹽水，刮取SS平板上的志賀氏菌菌苔，然后將菌液移入無菌瓶中；(4)細(xì)菌計數(shù)和濃度調(diào)整將1%葡萄糖肉湯的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，并用SS平板上刮取的志賀氏菌菌液對肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌濃度調(diào)整，調(diào)整菌數(shù)為20億/ml;(5)細(xì)菌滅活向調(diào)整好細(xì)菌濃度的1%葡萄糖肉湯細(xì)菌培養(yǎng)物中加入甲醛進(jìn)行滅活，搖勻，使甲醛的最終濃度為0.5%，37'C條件下作用24h;(6)滅活效果檢驗將滅活細(xì)菌肉湯分別接種三管1%葡萄糖無菌肉湯，每管0.2ml;接種的三管1。^葡萄糖肉湯，經(jīng)37。C24h培養(yǎng)，若均無細(xì)菌生長視為滅活合格；(7)細(xì)菌滅活肉湯的保存置于28t:保存?zhèn)溆茫?8)加入佐劑將制備好的細(xì)菌滅活肉湯，按肉湯與礦物油佐劑1:3的體積比加入礦物油油乳(IO號白油，杭州產(chǎn))，充分混合后制成油乳疫苗，每毫升油乳苗中含菌數(shù)為5億/ml。(9)各項檢驗疫苗制成后，按要求分別進(jìn)行成品無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。①無菌檢驗按國家獸用生物制品質(zhì)量檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。②安全檢驗用1月齡健康小雞5只，每只胸肌注射2ml油乳疫苗，觀察IO天均應(yīng)健活。用2月齡以上的健康雞5只，每只胸肌注射4ml油乳疫苗，觀察10天均應(yīng)健活。③效力檢驗免疫組為10只23日齡固始雞，用雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗首次免疫，每只胸肌注射lml，首免后第4周用雞鮑氏志賀氏菌滅活油乳苗二免，每只胸肌注射2ml。同時設(shè)立未免疫對照組10只。二免后第21天，兩組均用雞鮑氏志賀氏菌肉湯培養(yǎng)物(菌數(shù)為7.32億個/ml)進(jìn)行攻毒，每只灌服lml，同時腹腔注射lml。攻毒后連續(xù)觀察10天，若免疫攻毒組有1/10雞只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀，未免疫攻毒組有10/10雞只出現(xiàn)典型腹瀉癥狀，疫苗判為合格。2、性狀雞志賀氏菌油乳劑滅活苗為乳白色稍粘液體，靜置久貯時上面可能浮有少量清油，底層出現(xiàn)微量肉湯液體，但振搖后呈均勻乳白色稍粘液體。3、作用及用途該疫苗可用于預(yù)防雞和其它動物的志賀氏菌感染。利用本發(fā)明人的另一發(fā)明雞志賀氏菌鋁膠滅活疫苗首免后2周產(chǎn)生免疫力，免疫期1個月左右；鋁膠滅活苗首免后28天，再用雞志賀氏菌油乳劑滅活疫苗進(jìn)行二免，免后l周產(chǎn)生免疫力，免疫期達(dá)56個月。4、用法及用量用時搖勻，每只成雞肌肉注射2ml;每只雛雞肌肉注射0.5-1ml。利用雞志賀氏菌鋁膠滅活疫苗作基礎(chǔ)免疫，用雞志賀氏菌油乳劑滅活苗作加強免疫。5、貯藏置41(TC避光保存，有效期為1年；室溫避光保存，有效期半年。6、注意事項及說明防凍結(jié)，用前需恢復(fù)至室溫。實施例二雞痢疾志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備1、制備步驟(1)菌種傳代和復(fù)壯將純化的雞痢疾志賀氏菌接入1%葡萄糖肉湯中，在37X:條件下培養(yǎng)30h，然后用血液平板培養(yǎng)復(fù)壯；(2)細(xì)菌接種和擴(kuò)大培養(yǎng)將復(fù)壯的雞痢疾志賀氏菌接種1%葡萄糖肉湯進(jìn)行一代培養(yǎng)，然后將一代培養(yǎng)物用大量1%葡萄糖肉湯進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用滅菌棉球蘸取培養(yǎng)好的雞痢疾志賀氏菌菌液，均勻涂抹于SS瓊脂平板上，置37。C培養(yǎng)30h;(3)收集細(xì)菌在長滿志賀氏菌菌苔的SS平板上，每平板傾入35ml0.85%滅菌生理鹽水，刮取SS平板上的志賀氏菌菌苔，然后將菌液移入無菌瓶中；(4)細(xì)菌計數(shù)和濃度調(diào)整將1%葡萄糖肉湯的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，并用SS平板上刮取的雞痢疾志賀氏菌菌液對肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌濃度調(diào)整，調(diào)整菌數(shù)為30億/ml;(5)細(xì)菌滅活向調(diào)整好細(xì)菌濃度的1%葡萄糖肉湯細(xì)菌培養(yǎng)物中加入甲醛進(jìn)行滅活，搖勻，使甲醛的最終濃度為0.5%，37"C條件下作用30h;(6)滅活效果檢驗將滅活細(xì)菌肉湯分別接種三管1%葡萄糖無菌肉湯，每管0,2ml;接種的三管1%葡萄糖肉湯，經(jīng)37'C24h培養(yǎng)，若均無細(xì)菌生長視為滅活合格；(7)細(xì)菌滅活肉湯的保存置于28-C保存?zhèn)溆茫?8)加入佐劑將制備好的細(xì)菌滅活肉湯，按肉湯與礦物油1:3的體積比加入油乳佐劑，充分混合后制成油乳疫苗，每毫升油乳苗中含菌數(shù)為7.5億/ml。(9)各項檢驗疫苗制成后，按要求分別進(jìn)行成品無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。無菌檢驗及安全檢驗同實施例一、不再詳述。效力檢驗用2月齡以上健康雞5只，每只胸肌注射2ml油乳滅活疫苗，經(jīng)21天，連同條件相同的未免疫對照雞5只，用雞痢疾志賀氏菌對免疫組和未免疫對照組同時進(jìn)行攻毒(雞痢疾志賀菌攻毒菌數(shù)為1.36億/只)，攻毒方法均為口腔灌服。攻毒后連續(xù)觀察10天，未免疫對照組5只雞均出現(xiàn)拉稀癥狀(5/5);免疫組攻毒后無拉稀癥狀出現(xiàn)(0/5)，即臨床免疫保護(hù)率達(dá)100%(5/5)，疫苗判為合格。其它步驟及說明同實施例一，不再詳述。在雞志賀氏菌滅活油乳疫苗制備的實施例中，肉湯培養(yǎng)物細(xì)菌濃度調(diào)整后細(xì)菌數(shù)在2030億/ml的變化范圍內(nèi)可任意選擇，這些變化都是本發(fā)明實施例的常見變化，不再一一列舉。實施例三雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗的研究——免疫功能及免疫保護(hù)力的測定為了檢測雞鮑氏志賀氏菌滅活苗的免疫功能，用鋁膠滅活苗給免疫組進(jìn)行首免，一免后第四周用油乳滅活苗進(jìn)行二免，并設(shè)立未免疫對照組。在首免和二免后每周同時對免疫組和未免疫組采血，分別進(jìn)行E—玫瑰花環(huán)試驗、微量平板凝集試驗和攻毒試驗。免疫試驗結(jié)果顯示免疫組的E-花環(huán)形成率和免疫抗體效價均明顯高于未免疫對照組。由此表明，雞鮑氏志賀氏菌滅活苗可顯著提高機體的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。攻毒試驗結(jié)果顯示免疫組進(jìn)行攻毒，其免疫保護(hù)指數(shù)明顯高于未免疫對照組。由此表明，雞鮑氏志賀氏菌滅活苗能夠顯著提高動物機體的免疫保護(hù)力，可使動物有效預(yù)防鮑氏志賀氏菌的感染。1材料與方法1.1試驗地點、時間2003.8.92004.1.10于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108重點開放實驗室。1.2實驗動物1.2.1動物來源及詞養(yǎng)管理80只普通雞購自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場1日齡固始雞，淘汰8只弱雛，保留72只外觀健康雛雞，按正常飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)和免疫程序進(jìn)行；未免疫對照組的1日齡SPF雞10只，購自北京梅里亞維通實驗技術(shù)公司，嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)至3周。1.2.2動物分組免疫組為40只23日齡固始雞，用雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗首次免疫，每只胸肌注射lml，首免后第4周用雞鮑氏志賀氏菌滅活油乳苗二免，每只胸肌注射2ml。未免疫組分為固始雞32只，SPF雞10只，均未經(jīng)雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗免疫接種。1.3疫苗(1)雞鮑氏志賀氏菌滅活油乳苗，簡稱油乳苗或油苗。(2)本發(fā)明人的另一發(fā)明產(chǎn)品雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗，簡稱鋁膠苗或膠苗。兩種疫苗批號均為030420，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108微生物重點實驗室研制。1.4待測樣品的采集和處理各組試驗雞每周進(jìn)行翼下靜脈釆血兩份，一份新鮮抗凝血隨即進(jìn)行E-花環(huán)試驗；另一份新鮮血液進(jìn)行血清分離，將分離血清一2(TC凍存，待測時先將冷凍血清融解，并進(jìn)行56X:30min滅活。1.5主要藥品試劑和儀器設(shè)備1.5.1E—花環(huán)形成試驗所需試劑肝素鈉(效價》160單位/毫克，批號為020509)由上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，用前配制成200單位/毫升溶液；淋巴細(xì)胞分層液(P=1.077±0.002,pH=6.5—7.5)由上海恒信化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(原上海試劑二廠)；綿羊血采于鄭州北郊路寨正常成年羊；小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，用前進(jìn)行56。C30min滅活；50%戊二醛溶液，由天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心生產(chǎn)(批號為020716)，用前配制成2.5%溶液;pH二6.4PBS，pH^7.4無鈣鎂Hank's液，瑞氏染液和姬姆薩染液，pH=7.2阿氏液。1.5.2E—花環(huán)形成試驗所需儀器臺式水平離心機(型號TDL-40B)，由上海安亭科學(xué)儀器廠制造；800型離心機由上海手術(shù)器械廠制造；電熱恒溫水溫箱(型號:HH.W21.600-C)，由北京長源實驗設(shè)備廠制造；真空干燥箱(型號DZF一IB型)，由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡為日本進(jìn)口。1.5.3免疫抗體測定所需主要試劑雞鮑氏志賀氏菌微量凝集監(jiān)測抗原，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108微生物重點實驗室制備，菌種由該室分離保存。鮑氏志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(批號040401)，由蘭州生物制品研究所生產(chǎn)；陰性血清用SPF雞制備；0.5%石炭酸滅菌生理鹽水自備。1.5.4免疫抗體測定所需主要儀器設(shè)備50孔U型有機玻璃板，由江蘇姜堰市容飛器械廠制造；20200ul單道可調(diào)式移液器和50300ul多道可調(diào)式移液器(型號Y32979和Y34540)，由上海雷勃分析儀器有限公司制造；電熱恒溫水溫箱(型號HH.W21.600-C)，由北京長源設(shè)備廠制造；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號-PYX-DHS-50X65-B)，由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造。臺式離心機(型號為TDL-40B)由上海安亭科學(xué)儀器廠制造；755B型紫外可見光分光光度計由上海精密科學(xué)儀器有限公司制造。1.6E—玫瑰花環(huán)形成試驗簡稱"E-花環(huán)試驗"，操作方法按常規(guī)法進(jìn)行，具體內(nèi)容參見王世若等主編的第二版《現(xiàn)代動物免疫學(xué)》(2001年吉林科學(xué)出版社出版)第518519頁。1.7微量平板凝集試驗試驗方法首先在50孔U型有機玻璃板上做好標(biāo)記，橫向共五排，每排IO孔。每排第1孔均加入0.5%石炭酸滅菌生理鹽水930yL，而其它各孔均加入50uL。然后每排第一孔加入已滅活處理的待檢血清30uL，吹打三次混勻，棄去860uL，然后再從第l孔內(nèi)吸出50uL加入第2孔，依次類推至第10孔，混勻后棄去50uL。用帶乳膠頭的滴管每孔加1滴(50tiL)混勻的雞鮑氏志賀氏菌凝集抗原。同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清和抗原三個對照。搖動U型板使孔內(nèi)加樣充分混勻，反應(yīng)溫度為2035°C,反應(yīng)時間為3040min。結(jié)果判定方法當(dāng)有少量凝集顆粒，液體不甚透明時，即出現(xiàn)50%抗原凝集(用"++"表示)，此時血清最高稀釋倍數(shù)為該待檢血清的抗體效價。1.8免疫攻毒保護(hù)試驗在首免后第16天、第28天用分離的雞鮑氏志賀氏菌接種于1%葡萄糖肉湯中，經(jīng)37°C24h培養(yǎng)，對免疫組和未免疫組進(jìn)行攻毒，同時對細(xì)菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行計數(shù)(首免后第16天攻毒鮑氏志賀菌肉湯培養(yǎng)物為3.72億個/ml，首免后第28天和二免后攻毒鮑氏志賀菌肉湯培養(yǎng)物均為7.32億個/ml)，每組每只灌服lml，同時腹腔注射lml。攻毒后連續(xù)觀察10天，每天觀察2次，記錄免疫組和未免疫組雞的癥狀表現(xiàn)，且免疫組攻毒后前7天每天解剖1只雞，未免疫組攻毒后前3天每天解剖1只雞，剩余雞第10天觀察癥狀表現(xiàn)并全部進(jìn)行剖檢。2結(jié)果2.1免疫組和未免疫組E—花環(huán)形成率測定結(jié)果詳見表l,E-花環(huán)形成率變化規(guī)律詳見附圖l。表l免疫組和未免疫組E—花環(huán)形成率測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3免疫攻毒保護(hù)試驗結(jié)果用雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗首免后，分別于第16天和第28天對免疫組和未免疫組雞群進(jìn)行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒組有1/10雞只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀和剖檢病變；首免后第28天，免疫攻毒組有4/10雞只出現(xiàn)拉稀癥狀和剖檢病變，剖檢可見脾臟和腸道輕微病變；二免后第21天，免疫攻毒組有1/10雞只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀和剖檢病變。而未免疫攻毒組攻毒后10多小時，多數(shù)雞只開始出現(xiàn)典型拉稀癥狀，重者為膿血便。據(jù)統(tǒng)計，未免疫攻毒組于首免后第16天，攻毒后17天有3/6雞只出現(xiàn)典型拉稀癥狀，3/6出現(xiàn)典型剖檢病變，主要病變?yōu)槠⒂傺[大和腸道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒組有5/6雞只出現(xiàn)典型拉稀癥狀和剖檢病變；二免后第21天，未免疫攻毒組有10/10雞只出現(xiàn)典型腹瀉癥狀和剖檢病變?？傊?，.免疫攻毒組與未免疫攻毒組相比，免疫攻毒組發(fā)病率低，免疫保護(hù)率高，剖檢病變少而輕，癥狀和剖檢病變陽性率均明顯低于未免疫攻毒組。有關(guān)癥狀和剖檢病變陽性率統(tǒng)計結(jié)果詳見表3和表4。表3攻毒雞癥狀陽性率及免疫保護(hù)指數(shù)單位只，％<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注表3中分母為觀察只數(shù)，分子為觀察到相應(yīng)癥狀的只數(shù)。免疫保護(hù)指數(shù)計算公式PI=(攻毒對照陽性率一免疫陽性率)/攻毒對照陽性率。表4攻毒雞病變陽性率及免疫保護(hù)指數(shù)單位只，％<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注表4中分母為觀察只數(shù)，分子為觀察到相應(yīng)病變的只數(shù)。免疫保護(hù)指數(shù)計算公式PI=(攻毒對照陽性率一免疫陽性率)/攻毒對照陽性率。3討論與小結(jié)3.1雞鮑氏志賀氏菌滅活苗對細(xì)胞免疫功能的影響試驗結(jié)果表l和圖l顯示膠苗一免后3周E-花環(huán)形成率達(dá)到高峰，為24.8±1.80%，第4周下降至23.6士0.60%;用油苗二免后l周E-花環(huán)形成率上升到25.5±0.80%，油苗二免后2周E-花環(huán)形成率達(dá)高峰，為28.8±1.58%;油苗二免后第12周E-花環(huán)形成率開始緩慢下降(28.1±1.17%)，第13周下降至27.3±0.53%,維持高峰期10周左右。隨著疫苗免疫次數(shù)的增多，免疫組雞的E-花環(huán)形成率也就相對越高。由此可以看出，首免膠苗雞的細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生慢，維持時間短；用油苗二免后，雞的細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生快，免疫力高，維持時間長，下降速度慢。由試驗結(jié)果還可以看出，無論用膠苗還是用油苗進(jìn)行免疫接種，免疫組雞的E-花環(huán)形成率均明顯高于同期的未免疫對照組，說明鋁膠苗和油乳苗均可顯著提高雞的細(xì)胞免疫功能。3.2雞鮑氏志賀氏菌滅活苗對體液免疫功能的影響試驗結(jié)果表2和圖2顯示:膠苗一免后3周免疫抗體效價達(dá)到高峰，為ll.7±0.431og2，第4周下降至10.7士0.431og2;用油苗二免后l周免疫抗體效價上升到12.0士01og2，油苗二免后2周免疫抗體效價達(dá)高峰，為13.0土01og2;油苗二免后第10周免疫抗體效價開始緩慢下降(12.5土0.501og2)，第13周下降至11.3土0.431og2，維持高峰期9周左右。隨著疫苗免疫次數(shù)的增多，免疫組雞的免疫抗體效價也就相對越高。由此可以看出，首免膠苗雞的體液免疫功能產(chǎn)生慢，維持時間短；用油苗二免后，雞的體液免疫功能產(chǎn)生快，免疫力高，維持時間長，下降速度慢。未免疫組中的普通雞抗體效價水平始終維持在81og2左右，而未免疫組的SPF雞三次免疫抗體效價測定值均為O，這說明未免疫組雞(普通雞)幼齡時曾有雞鮑氏志賀氏菌的隱性感染。盡管如此，但仍可看出無論用膠苗還是油苗進(jìn)行免疫接種，免疫組雞的免疫抗體效價均明顯高于同期的未免疫對照組，說明鋁膠苗和油乳苗均可顯著提高雞的體液免疫功能。此外，測得SPF雞的抗體效價三次均為0，表明該雞符合試驗標(biāo)準(zhǔn)要求未曾感染志賀氏菌，同時進(jìn)一步證明本試驗測得的各組抗體效價數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。3.3雞鮑氏志賀氏菌滅活苗的免疫保護(hù)作用用雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗首免后，分別于第16天和第28天對免疫組和未免疫組雞群進(jìn)行攻毒。首免后第16天，免疫攻毒組有1/10雞只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀和剖檢病變；首免后第28天，免疫攻毒組有4/10雞只出現(xiàn)拉稀癥狀和剖檢病變，剖檢可見脾臟和腸道輕微病變；二免后第21天，免疫攻毒組有1/10雞只出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀和剖檢病變。而未免疫攻毒組攻毒后10多小時，多數(shù)雞只開始出現(xiàn)典型拉稀癥狀，重者為膿血便。據(jù)統(tǒng)計，未免疫攻毒組于首免后第16天，攻毒后l7天有3/6雞只出現(xiàn)典型拉稀癥狀，3/6出現(xiàn)典型剖檢病變，主要病變?yōu)槠⒂傺[大和腸道出血等；首免后第28天，未免疫攻毒組有5/6雞只出現(xiàn)典型拉稀癥狀和剖檢病變；二免后第21天，未免疫攻毒組有10/10雞只出現(xiàn)典型腹瀉癥狀和剖檢病變。首免后16天和二免后21天，免疫組的免疫保護(hù)指數(shù)分別為80%和90%。總之，免疫攻毒組與未免疫攻毒組相比，免疫攻毒組發(fā)病率低，免疫保護(hù)率高，剖檢病變少而輕，癥狀和剖檢病變陽性率均明顯低于未免疫攻毒組。由此表明，雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗和油乳苗均對預(yù)防該菌的感染起到了顯著的免疫保護(hù)作用。實施例四雞痢疾志賀氏菌滅活苗研究——免疫功能和免疫保護(hù)力的測定用研制出的雞痢疾志賀氏菌滅活苗對雞進(jìn)行免疫，并測定其免疫功能和免疫保護(hù)力。先利用本發(fā)明人的另一發(fā)明雞痢疾志賀氏菌滅活鋁膠苗對雞首免，首免后第4周用本發(fā)明的雞痢疾志賀氏菌滅活油乳苗進(jìn)行二免，并于二免后第28周用油乳苗進(jìn)行三免。對免疫組和未免疫組雞只定期進(jìn)行翼靜脈采血，用微量平板凝集試驗進(jìn)行免疫抗體效價測定以了解機體的體液免疫功能，并用E—花環(huán)形成試驗測定機體的T細(xì)胞數(shù)目，從而了解機體的細(xì)胞免疫功能。1材料與方法1.1試驗時間、地點2004年2月2日2005年1月30日于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108微生物重點實驗室進(jìn)行。1.2試驗動物1.2.1動物來源及詞養(yǎng)管理普通雞購自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場l日齡固始雞IOO只，淘汰弱小者，保留外觀正常強壯雞82只，按正常標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理和免疫。l曰齡SPF雞10只，購自北京梅里亞維通實驗技術(shù)公司，嚴(yán)格隔離詞養(yǎng)至3周。1.2.2動物分組①免疫膠油組固始雞飼養(yǎng)至23日齡用雞痢疾志賀氏菌滅活鋁膠苗首免45只，每只胸肌注射lml;鋁膠苗首免后第4周用雞痢疾志賀氏菌滅活油乳苗二免，二免后第28周(196天)用油苗進(jìn)行三免，二免和三免每只雞均胸肌注射2ml。②未免疫對照組未免疫雞痢疾志賀氏菌疫苗的固始雞37只，作陰性血清對照SPF雞10只。1.3疫苗(1)雞痢疾志賀氏菌滅活油乳苗，簡稱油乳苗或油苗。(2)本發(fā)明人的另一發(fā)明產(chǎn)品雞痢疾志賀氏菌滅活鋁膠苗，簡稱鋁膠苗或膠苗。兩種疫苗批號均為040502，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108微生物重點實驗室研制。1.4待測樣品的采集和處理同實施例一。1.5主要藥品試劑和儀器設(shè)備1.5.1免疫抗體測定所需主要試劑雞痢疾志賀氏菌微量凝集監(jiān)測抗原，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程樓1108微生物重點實驗室制備，菌種由該室分離保存。痢疾志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(批號040401)，由蘭州生物制品研究所生產(chǎn)；陰性血清用SPF雞制備；0.5%石炭酸滅菌生理鹽水自備。1.5.2免疫抗體測定所需主要儀器設(shè)備同實施例一。1.5.3E-花環(huán)形成試驗所需主要試劑同實施例一。1.5.4E-花環(huán)形成試驗所需主要儀器設(shè)備同實施例一。1.6微量平板凝集試驗以雞痢疾志賀氏菌代替雞鮑氏志賀氏菌進(jìn)行試驗，試驗方法及結(jié)果判定方法同實施例一。1.7E-玫瑰花環(huán)形成試驗簡稱"E-花環(huán)試驗"，操作方法同實施例一。1.8免疫攻毒保護(hù)試驗在試驗雞群首免、二免和三免后的不同時間內(nèi)，用雞痢疾志賀氏菌肉湯培養(yǎng)物經(jīng)活菌計數(shù)，對免疫組和未免疫組雞群進(jìn)行攻毒，每只雞均同時口腔灌服和腹腔注射。首免后第16天和第28天每只雞攻毒菌數(shù)分別為1.098千萬個和6.56千萬個；二免后第21天和第189天每只雞攻毒菌數(shù)分別為7.63千萬個和8.28千萬個；三免后第108天每只雞攻毒菌數(shù)為1.36億個。首免后第16天和第28天、二免后第21天和第189天，免疫組攻毒后前7天每天解剖1只雞，未免疫組攻毒后前3天每天解剖1只雞，其余雞只觀察癥狀至第10天全部進(jìn)行剖檢。三免后108天對免疫組和未免疫組攻毒后，連續(xù)觀察10天，并全部剖檢。2結(jié)果2.1免疫組和未免疫組抗體水平測定結(jié)果雞痢疾志賀氏菌滅活疫苗免疫組和未免疫組抗體效價測定結(jié)果詳見表5，抗體水平曲線詳見附圖3。表5免疫組和未免疫組抗體效價測定結(jié)果單位1og2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表5中利用雙因素?zé)o重復(fù)數(shù)據(jù)方差分析可知膠苗一免，油苗二免，油苗:免與未免疫組相比可極顯著(p〈0.01)提高機體體液免疫功能。2.2免疫組和未免疫組E-花環(huán)形成率測定結(jié)果雞痢疾志賀氏菌滅活疫苗免疫組和未免疫組E-花環(huán)形成率測定結(jié)果詳見表6，其形成規(guī)律曲線詳見附圖4。表6免疫組和未免疫組E—花環(huán)形成率測定結(jié)果單位％分組一免組未免組二免組未免組三免組未免組120.50±2.2817.90±0.5728.21±1.1823.37±2.38免223.40±2.3120.66±2.6828.41±1.4323.51±0.39后324.93±3.5421.50±1.1728.40±2.0523.75±2.66423.20±2.9422.67±1.4428.21±1.6323.80±2.77釆528.03±1.2223.63±0.69628.15±1.9022.77±1.84血727.90±2.4623.68±1.84時8928.01±1.0328.12±1.2823,75±1.4323.60±3.14間1028.05±0.9523.75±2.661128.23土1.0924.82±2.2636.69±2.2435.1±3.291227.83±2.5624.83±2.12周13141527.20±1.9125.11±1.8538.04±2.9735.5±2.49表6中利用雙因素?zé)o重復(fù)數(shù)據(jù)方差分析可知膠苗一免，油苗二免，油苗三免與未免疫組相比可極顯著(P<0.05)提高機體細(xì)胞免疫功能。2.3免疫攻毒保護(hù)試驗結(jié)果對免疫組和未免疫組試驗雞群攻毒后，兩組出現(xiàn)明顯不同的結(jié)果。免疫組首免后第16天和二免后第21天攻毒，個別雞只(1/10)在觀察期間出現(xiàn)輕微拉稀癥狀，剖檢可見個別雞只(1/10)出現(xiàn)脾臟和腸道的輕微病變；免疫組首免后第28天和二免后第189天攻毒，部分雞只(4/10)在觀察期間出現(xiàn)拉稀癥狀，剖檢可見部分雞只(4/10或2/10)出現(xiàn)脾臟和腸道病變；免疫組三免后108天攻毒后雞只(5/5)糞便均正常，剖檢未見脾臟和腸道明顯病變。未免疫組于首免后第16天和第28天攻毒，絕大多數(shù)雞只(4/65/6)出現(xiàn)典型拉稀癥狀和剖檢病變；未免疫組二免后第21天和第189天攻毒，雞只均出現(xiàn)(10/10)典型拉稀癥狀和剖檢病變。典型剖檢病變主要表現(xiàn)為脾淤血腫大和腸道出血。此外，剖檢可見部分雞腹腔內(nèi)出現(xiàn)纖維素性炎癥、心包膜有膠凍樣物質(zhì)，肝臟發(fā)生脂肪變性等。三免后108天攻毒，未免疫組雞群(5/5)于攻毒后24h可見不成形糞便，48h后均出現(xiàn)水樣稀糞，剖檢均可見脾臟淤血腫大、部分雞腸道出血等。總之，免疫組與未免疫組相比，攻毒后免疫組癥狀陽性率和剖檢病變陽性率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未免疫組，而免疫保護(hù)指數(shù)在免疫雞的高水平免疫期內(nèi)均較高，可達(dá)85.1%100%。由此說明，免疫組雞群免疫保護(hù)力顯著增強。免疫組和未免疫組攻毒后，試驗雞癥狀陽性率和免疫保護(hù)指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果詳見表7，剖檢病變陽性率和免疫保護(hù)指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果詳見表8。表7攻毒雞癥狀陽性率及免疫保護(hù)指數(shù)統(tǒng)計單位只，％<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注表8中數(shù)字分母均為攻毒雞只數(shù)，分子為剖檢病變雞只數(shù)。免疫保護(hù)指數(shù)計算公式PI=(攻毒對照陽性率一免疫陽性率)/攻毒對照陽性率。3討論與小結(jié)3.1雞痢疾志賀氏菌滅活苗對體液免疫功能的影響抗體水平測定結(jié)果表5和圖3表明免疫組的抗體水平明顯高于未免疫組，由此說明雞痢疾志賀氏菌滅活鋁膠苗和油乳苗均可顯著提高機體的免疫抗體水平。從表5和圖3中可以看出鋁膠苗一免后第3周抗體效價上升至高峰達(dá)11.5k)g2，第4周開始下降。油苗二免后第2周抗體水平上升至高峰達(dá)12.41og2，并維持較長時間，第13周開始緩慢下降，第15周下降至11.51og2，第28周降至9.51og2。油苗三免后第l周即上升至高峰達(dá)141og2，并一直維持至第6周，第7周下降至12.751og2，并一直維持至第13周不變，第15周下降至12.51og2，但與二免后第15周抗體效價(11.51og2)相比仍高出一個滴度。由此可見，二免和三免均可使抗體產(chǎn)生速度更快，數(shù)量更多，效價維持時間更長。此外，測定未免疫組SPF雞第1周至第3周的三次抗體效價值均為0，這說明未免疫組SPF雞是符合試驗標(biāo)準(zhǔn)的；而普通雞(固始雞)未免疫組抗體水平始終維持在81og2左右，這說明試驗雞(固始雞)早期幼齡時曾有痢疾志賀氏菌的隱性感染，但即使在這種情況下仍可以看出，經(jīng)滅活苗免疫雞的抗體效價均明顯高于隱性感染雞的抗體水平。總之，上述抗體測定試驗結(jié)果數(shù)據(jù)表明，雞痢疾志賀氏菌滅活苗能顯著提高動物機體的體液免疫功能，并進(jìn)一步表明用本試驗測定動物機體的免疫抗體其方法是標(biāo)準(zhǔn)可行的。3.2雞痢疾志賀氏菌滅活苗對細(xì)胞免疫功能的影響從E-花環(huán)形成試驗結(jié)果表6和圖4可以看出，免疫組E-花環(huán)形成率明顯高于未免疫組，由此說明雞痢疾志賀氏菌滅活鋁膠苗和油乳苗均可顯著提高機體的E-花環(huán)形成率。從表6和圖4中可看出鋁膠苗首免后第3周E-花環(huán)形成率上升至高峰達(dá)24.93±3.54%，第4周下降至23.20±2.94%;油苗二免后第2周上升至高峰達(dá)28.41±1.43%，比一免后高峰(24.93±3.54%)高出3.48%，至第ll周后緩慢下降，第13周下降至27.20±1.91%;由三免后第ll周和第15周的E-花環(huán)測定結(jié)果可知，三免后第11周E-花環(huán)形成率36.69士2.24X明顯高于二免后第11周的28.23±1.09%，而15周的E-花環(huán)形成率則更高，可達(dá)38.04±2.97%。此外，由表6和圖4還可看出，未免疫組E-花環(huán)形成率隨雞的日齡增長而增長，但達(dá)一定年齡時未免疫組雞的E-花環(huán)形成率保持一定水平而不再升高?？傊?，E-花環(huán)形成試驗結(jié)果表明，雞痢疾志賀氏菌滅活苗能顯著提高動物機體的細(xì)胞免疫功能，同時表明用E-花環(huán)形成試驗測定動物機體的細(xì)胞免疫功能是行之有效的。3.3雞痢疾志賀氏菌滅活苗的免疫保護(hù)作用本研究免疫攻毒試驗充分證明未免疫組攻毒后短時間內(nèi)均出現(xiàn)了典型癥狀，表現(xiàn)拉稀，重者膿血便。剖檢后均出現(xiàn)典型的脾臟淤血腫大、腸出血等病理變化。免疫組免疫后進(jìn)行攻毒，雖然攻毒菌數(shù)偏高，但免疫組僅有少數(shù)雞只發(fā)生輕微的癥狀和病變，且免疫組動物機體的免疫保護(hù)力隨著免疫次數(shù)的增多而不斷加強，攻毒動物的免疫保護(hù)指數(shù)由85.1%至100%。由此表明，雞痢疾志賀氏病滅活苗對預(yù)防該菌感染起到了顯著的免疫保護(hù)作用。用鋁膠苗首免后動物機體免疫力明顯增強，免疫組免疫抗體水平和E—花環(huán)形成率比未免疫組雞群顯著升高，首免后16天攻毒雞群臨床免疫保護(hù)指數(shù)可達(dá)85.1%;當(dāng)使用油乳苗進(jìn)行二免時，隨著免疫抗體水平和E—花環(huán)形成率的不斷升高，動物機體免疫保護(hù)力不斷加強，二免后21天攻毒雞群臨床免疫保護(hù)指數(shù)可達(dá)90%;使用油乳苗三免后動物機體免疫保護(hù)力大大加強，三免后108天攻毒免疫保護(hù)指數(shù)可達(dá)100%。權(quán)利要求1、一種雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，其特征是含有有效劑量的滅活雞志賀氏菌和獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，其特征是所述的佐劑為費氏佐劑、礦物油、植物油乳化佐劑中的任一種。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，其特征是所述的滅活雞志賀氏菌為雞痢疾志賀氏菌，或雞鮑氏志賀氏菌，或雞福氏志賀氏菌，或雞宋內(nèi)氏志賀氏菌中的任一種滅活菌。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，其特征是所述的疫苗中含滅活雞志賀氏菌數(shù)為5億~7.5億/ml。5、一種雞志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)菌種傳代和復(fù)壯將純化的雞志賀氏菌用1%葡萄糖肉湯進(jìn)行接種，在37士0.5'C條件下培養(yǎng)2430h，然后用血液平板培養(yǎng)復(fù)壯；(2)細(xì)菌接種和擴(kuò)大培養(yǎng)將復(fù)壯的雞志賀氏菌接種1%葡萄糖肉湯進(jìn)行一代培養(yǎng)，然后將一代培養(yǎng)物用大量1%葡萄糖肉湯進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并用滅菌棉球蘸取培養(yǎng)好的雞志賀氏菌菌液，均勻涂抹于SS瓊脂平板上，置37士0.5'C培養(yǎng)2430h;(3)收集細(xì)菌在長滿雞志賀氏菌菌苔的SS平板上，每平板傾入0.85%滅菌生理鹽水35ml，刮取SS平板上的雞志賀氏菌菌苔，然后將刮取的菌液移入無菌瓶中；(4)細(xì)菌計數(shù)和濃度調(diào)整將1%葡萄糖肉湯的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計數(shù)，并用SS平板上刮取的雞志賀氏菌菌液對肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌濃度調(diào)整，調(diào)整菌數(shù)為20~30億/ml;(5)細(xì)菌滅活向調(diào)整好細(xì)菌濃度的1%葡萄糖肉湯細(xì)菌培養(yǎng)物中加入甲醛進(jìn)行滅活，搖勻，使甲醛的最終濃度為0.5%，37士0.5"C條件下作用2430h;(6)加入佐劑向制備好的細(xì)菌滅活肉湯中加入佐劑，肉湯與佐劑的體積比為1:3，混合均勻后制成疫苗。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備方法，其特征是:所述的油乳疫苗中含滅活雞志賀氏菌數(shù)為5億~7.5億/ml。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗的制備方法，其特征是:所述的雞志賀氏菌為雞痢疾志賀氏菌，或為雞鮑氏志賀氏菌，或為雞福氏志賀氏菌，或為雞宋內(nèi)氏志賀氏菌中的任一種。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗，其特征是所述的佐劑為費氏佐劑、礦物油、植物油乳化佐劑中的任一種。9、權(quán)利要求1所述的雞志賀氏菌滅活油乳疫苗在預(yù)防雞志賀氏菌感染方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種獸用生物制品及其研制方法，特別是涉及一種雞志賀氏菌滅活油乳苗及其研制方法。雞志賀氏菌滅活油乳苗是利用雞志賀氏菌經(jīng)菌種傳代、大量培養(yǎng)、調(diào)整濃度、滅活、按適當(dāng)比例加入佐劑制備而成，疫苗中含滅活雞志賀氏菌數(shù)為5億～7.5億/ml。利用本發(fā)明的油乳疫苗，結(jié)合雞志賀氏菌滅活鋁膠苗對雞進(jìn)行免疫接種，可有效預(yù)防雞的志賀氏菌感染。經(jīng)測定，免疫動物的細(xì)胞免疫和體液免疫水平顯著提高，免疫保護(hù)率達(dá)85.1～100％以上；本發(fā)明疫苗具有性能穩(wěn)定、易保存、無毒、無污染等優(yōu)點；雞免疫后產(chǎn)生免疫作用快、免疫力強、保護(hù)率高，簡便易行等特點。本發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，對有效控制雞志賀氏菌感染，防止人和動物交叉感染具有重要的意義。文檔編號A61P31/00GK101095949SQ200610018020公開日2008年1月2日申請日期2006年6月26日優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日發(fā)明者康相濤,王川慶,許蘭菊申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)