專利名稱：磁性聚乳酸－羥基乙酸氧化酚砷納米微球及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型藥物劑型及其用途，具體為磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球及其在治療肝癌方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌仍是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬于晚期，一年與五年的成存率均較低。近十余年來(lái)，不能手術(shù)的肝癌治療已取得一些進(jìn)展，包括栓塞化療、局部無(wú)水酒精注射治療等，但臨床應(yīng)用有一定的局限性；新的化療藥物雖已得以開(kāi)發(fā)，由于全身應(yīng)用效果不理想且副作用大，缺乏肝靶向性，目前臨床基本不采用。
新近Konig和Koshiuka等人分別報(bào)道有機(jī)砷類藥物在體內(nèi)外對(duì)于抑制白血病和乳腺癌具有較好的治療效果，且毒副作用較少，但迄今未見(jiàn)有機(jī)砷制劑用于肝癌治療的研究報(bào)道。
最近，基于納米技術(shù)發(fā)展起來(lái)的納米載體介導(dǎo)的磁性載藥系統(tǒng)，在外加磁場(chǎng)的作用下，能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異的靶向給藥目的，有利于提高病灶部位的局部藥物濃度，同時(shí)使非治療部位的藥物濃度降低，從而進(jìn)一步提高療效，減少毒副作用，該磁性給藥系統(tǒng)具有體外可控性，是肝癌靶向治療的研究方向。
本發(fā)明通過(guò)超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，用于抗肝癌治療研究，在外加磁場(chǎng)的條件下，可較好的提高局部氧化酚砷的藥物濃度，增強(qiáng)治療效果，且可極大的減少全身毒副作用，迄今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于運(yùn)用磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，在肝癌病變區(qū)外加磁場(chǎng)，可較好的提高病變區(qū)的藥物溶度，增強(qiáng)治療效果，減少全身毒副反應(yīng)。
本發(fā)明提出的上述磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備合成，其組成包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、四氧化三鐵、氧化酚砷(PAO)，其特征在于以四氧化三鐵、氧化酚砷為內(nèi)核，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹層為殼層，氧化酚砷與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶50至25∶50，微球粒徑在20℃時(shí)為140-500納米。
具體制備步驟如下將氧化酚砷和聚乳酸-羥基乙酸共聚物按一定重量比例，完全溶解在二氯甲烷中，再加入無(wú)機(jī)磁性四氧化三鐵納米顆粒，超聲分散形成油相。將油相加入4％聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化5分鐘后呈現(xiàn)均勻乳狀。在攪拌條件下，將上述乳液緩緩滴加到0.3％聚乙烯醇水溶液中，持續(xù)攪拌5小時(shí)，整個(gè)攪拌過(guò)程在37℃水浴下進(jìn)行。攪拌結(jié)束后，將所得混懸液置于磁鐵上，除去上清夜，再用蒸餾水洗滌，高速離心，反復(fù)3次。將所得沉淀物冷凍干燥、真空干燥、滅菌，即得磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球。
本發(fā)明的納米藥物是以聚乳酸-羥基乙酸共聚物為包裹層，以四氧化三鐵納米微粒和氧化酚砷分散體系為核的聚合物微球。該種納米微球通過(guò)超聲乳化-溶劑揮發(fā)法合成，其粒徑在20℃為140-500納米，且具有較好的磁性，在外加磁場(chǎng)的條件下具有較好的磁靶向性。
上述微球的聚合物包裹層為聚乳酸-羥基乙酸共聚物。
上述的內(nèi)核為四氧化三鐵納米微粒和氧化酚砷分散體系。
上述納米微球具有磁性核心，具有較好的磁響應(yīng)性，故在外加磁場(chǎng)的條件下，可實(shí)現(xiàn)藥物的靶向治療作用。
本發(fā)明中，所用的磁性納米顆?？梢允撬难趸F、r-三氧化二鐵等其中的一種。
本發(fā)明中，所用的油相為二氯甲烷，水相為聚乙烯醇水溶液。
本發(fā)明中，采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備磁性聚乳酸羥基乙酸氧化酚砷納米微球，超聲時(shí)間不應(yīng)過(guò)短，5分鐘以上為好。
本發(fā)明研制的具有磁性的磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，其直徑在20℃為140-500納米?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)超聲時(shí)間，聚乳酸-羥基乙酸的用量，油水比例來(lái)控制其粒徑的大小。一定范圍內(nèi)超聲時(shí)間延長(zhǎng)，粒徑增大；聚乳酸-羥基乙酸用量增加，粒徑增大；油水比例增大，粒徑增大。
本發(fā)明研制的具有磁性的磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，其包封率、載藥量可以通過(guò)改變氧化酚砷、聚乳酸-羥基乙酸的用量、油水比例、聚乙烯醇的溶度來(lái)調(diào)控。
本發(fā)明在上述投料范圍內(nèi)，研制的共聚物包裹四氧化三鐵、氧化酚砷的微球是一種具有磁性的納米微粒，其直徑在140-500納米，載藥量及包封率均可控。
該藥物具有較好的磁靶向性與緩釋性，可用于體內(nèi)定位給藥，在外加磁場(chǎng)的條件下，可極大的減少了氧化酚砷的全身毒副作用及給藥次數(shù)，同時(shí)可較好的增加靶點(diǎn)藥物濃度，提高治療效果。
我們進(jìn)行了如下的研究工作，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、MTT法驗(yàn)證磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球體外抗肝癌效果。建立昆明小鼠肝癌模型，磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球組在外加磁場(chǎng)條件下，與單純氧化酚砷藥物組相比，可較好提高小鼠的生存期。
我們采用聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球抗肝癌治療，其具體步驟如下(1)通過(guò)超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球。
(2)肝臟靶向性研究12只SD大鼠隨機(jī)分成2組，每組6只，雌雄各半。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在固定板。尾靜脈注射21毫克磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，1組大鼠肝區(qū)外加一大小4500高斯磁場(chǎng)，另一組不加磁場(chǎng)。30分鐘后，處死大鼠，分別取心、肝、肺、腎臟器，檢測(cè)氧化酚砷含量。
(3)磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球體外抗肝癌細(xì)胞作用研究采用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)觀察磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球?qū)Ω伟┘?xì)胞(SMMC-7721)增殖的抑制作用。
(4)肝癌模型昆明小鼠存活期觀察抽取肝癌腹水模型昆明種鼠(上海醫(yī)學(xué)工業(yè)研究所提供)腹水，將腹水與生理鹽水按1∶1稀釋后，每只小鼠腋下注射0.1ml混合液體。十天后，將已長(zhǎng)出癌塊的小鼠分兩組，一組肝癌區(qū)外加4500高斯磁場(chǎng)，尾靜脈給予磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，另一組給予純氧化酚砷藥物，觀察小鼠小鼠存活期。
研究表明本發(fā)明的磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，其藥物有效成份為氧化酚砷，本發(fā)明藥物可較好提高肝癌區(qū)藥物濃度，減少全身毒副作用，用于肝癌治療。


圖1為磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球在外加磁場(chǎng)條件下與單純給予氧化酚砷藥物相比肝癌模型昆明小鼠存活期觀察
具體實(shí)施例方式
下面的試驗(yàn)例可更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
試驗(yàn)例1.肝臟靶向性研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，鼠齡4-6周，體重175-200克，數(shù)量12只，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
試驗(yàn)方法12只SD大鼠隨機(jī)分成2組，每組6只，雌雄各半。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在固定板。尾靜脈注射21毫克磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，1組大鼠肝區(qū)外加一大小4500高斯磁場(chǎng)，另一組不加磁場(chǎng)。30分鐘后，處死大鼠，分別取心、肝、肺、腎臟器，檢測(cè)氧化酚砷含量，結(jié)果如表1。
表1氧化酚砷藥物濃度(n＝6)

試驗(yàn)表明，在外加磁場(chǎng)的條件下，磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球具有較好的靶向性，可較大的提高肝臟靶點(diǎn)的藥物濃度，減少其他臟器的藥物含量，從而減少藥物全身毒副反應(yīng)。
試驗(yàn)例2.磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球?qū)Ω伟┘?xì)胞(SMMC-7721)抑制作用。
采用MTT法觀察磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的抑制作用。試驗(yàn)藥物組濃度分別為1、氧化酚砷0.1umol/L、1.0umol/L、10umol/L、100umol/L；2、磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球有效濃度0.1umol/L、1.0umol/L、10umol/L、100umol/L，用助懸劑稀釋，肝癌細(xì)胞以5×104/ml接種于96孔板，200ul/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，接種24h后換加有藥液的完全培養(yǎng)液，100ul/孔，陰性對(duì)照組只加聚乳酸-羥基乙酸空白微球。加藥后分別于24、48、72h加MTT溶液20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加DMSO100ul/孔，37℃放置后，以多孔酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570nm處的吸光度值(A)，計(jì)算抑制率。抑制率＝(對(duì)照組吸光度—實(shí)驗(yàn)組吸光度)/對(duì)照組的吸光度值。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制作用

試驗(yàn)表明，磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球在體外具有對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，其抑制程度隨作用時(shí)間、藥物濃度而變化。
試驗(yàn)例3肝癌模型昆明小鼠存活期觀察試驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，雌雄各半，體重16-20克，數(shù)量40只，昆明小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物研究所提供。
實(shí)驗(yàn)方法抽取肝癌腹水模型昆明種鼠(上海醫(yī)學(xué)工業(yè)研究所提供)腹水，用生理鹽水按1∶1比例稀釋，每只小鼠腋下注射0.1ml混合液體。十天后，將已長(zhǎng)出癌塊的小鼠分兩組，一組肝癌區(qū)外加4500高斯磁場(chǎng)，按3.6mg/kg有效氧化酚砷含量，尾靜脈給予磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球；另一組按同樣含量，僅尾靜脈給予氧化酚砷藥物，觀察小鼠存活期，記錄如圖1所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球在外加磁場(chǎng)條件下與單純給予氧化酚砷藥物相比，由于在肝癌病變區(qū)外加磁場(chǎng)，使得磁性納米藥物大部分集中在肝癌區(qū)，達(dá)到體內(nèi)靶向給藥效果，減少氧化酚砷的毒副作用及給藥次數(shù)，增加肝癌區(qū)藥物溶度，提高氧化酚砷抗肝癌療效，可明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，其組成包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物、四氧化三鐵、氧化酚砷，其特征在于以四氧化三鐵、氧化酚砷為內(nèi)核，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹層為殼層，氧化酚砷與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶50至25∶50，微球粒徑在20℃時(shí)為140-500納米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球，其特征在于微球制備采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化酚砷納米微球在外加磁場(chǎng)條件下，用于體內(nèi)靶向給藥治療肝癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有磁響應(yīng)性的磁性聚乳酸－羥基乙酸氧化酚砷納米微球及其治療肝癌方面的應(yīng)用。首先通過(guò)超聲乳化—溶劑揮發(fā)法制備磁性聚乳酸－羥基乙酸氧化酚砷納米微球，微球以四氧化三鐵、氧化酚砷為內(nèi)核，以聚乳酸－羥基乙酸共聚物包裹層為殼層，氧化酚砷與聚乳酸－羥基乙酸共聚物的重量比例為1∶50至25∶50，微球粒徑在20℃時(shí)為140－500納米。由于在肝癌病變區(qū)外加磁場(chǎng)，使得磁性納米藥物大部分集中在肝癌區(qū)，達(dá)到體內(nèi)靶向給藥效果，可較大的提高肝臟靶點(diǎn)的藥物濃度，提高氧化酚砷抗肝癌療效，減少其他臟器的藥物含量，從而減少藥物全身毒副反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1857728SQ200610024660
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者蔡洪培, 董勤, 謝謂芬, 張興榮, 張忠兵 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)