專(zhuān)利名稱(chēng)：三維明膠多孔支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物材料和組織工程領(lǐng)域，涉及一種用天然高分子物質(zhì)加工成的多孔膜及其制備方法，可用于皮膚組織工程支架材料。
背景技術(shù)：
天然高分子材料是人類(lèi)最早使用的醫(yī)用材料，具有良好的生物相容性，幾乎都可降解且降解產(chǎn)物無(wú)毒。組織工程支架材料中，典型的天然高分子材料有膠原蛋白、殼聚糖以及明膠、海藻酸鈉等。
明膠是纖維性不溶膠原蛋白的部分變性衍生物，它廣泛存在于自然界中，是皮膚、骨骼和結(jié)締組織中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要組成部分。明膠由氨基酸單鏈組成。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，明膠分子含有氨基乙酸-X-Y的三鏈重復(fù)單元，其中X和Y常是脯氨酸和羥(基)脯氨酸。膠原蛋白在生理?xiàng)l件下表達(dá)抗原性，而明膠尚未發(fā)現(xiàn)有這樣的抗原性。
近年來(lái)，在皮膚組織工程領(lǐng)域，明膠基支架材料的研究非常廣泛。然而，其制備方法往往僅限于常用的冷凍干燥法(freeze drying)。傳統(tǒng)的冷凍干燥法制備出的多孔明膠支架材料，可塑性能、機(jī)械性能和微觀(guān)結(jié)構(gòu)難以滿(mǎn)足組織工程需要。
因此本領(lǐng)域迫切需要提供一種微觀(guān)結(jié)構(gòu)均勻、易成型、機(jī)械強(qiáng)度好的多孔明膠支架材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種性能優(yōu)良的三維明膠多孔支架材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種三維明膠多孔支架材料的制備方法。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種三維明膠多孔支架材料，所述的材料含有(a)90-100重量份明膠和(b)0.000001-2重量份的水，并且組分(a)和(b)占支架材料總重量的90-100％；并且，所述的支架材料具有以下特性(1)孔隙率為85-99.9％；(2)所述的材料的平均孔徑為5-500μm；(3)孔的排列以及孔徑大小分布均勻，孔徑為20-80μm范圍的孔占全部孔的80％以上。
在另一優(yōu)選例中，所述的材料的孔徑為10-300μm。
在另一優(yōu)選例中，孔隙率為90-95％，平均孔徑為20-200μm，其中孔徑在20-80μm之間的孔最多。
在另一優(yōu)選例中，所述的材料是采用包括以下步驟的乳液冷凍干燥法制得的(a)取明膠溶解在去離子水中形成明膠溶液；(b)在上述明膠溶液中加入有機(jī)溶劑，混合均勻，形成乳液，所述的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正丙醇、丙三醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、丙酮、吡啶中的一種或多種；(c)在步驟(b)所得的乳液中，加入交聯(lián)劑，預(yù)凍；(d)干燥預(yù)凍后的樣品獲得多孔明膠支架；(e)用后處理液處理多孔明膠支架材料，去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)；(f)再次冷凍干燥制得如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中有機(jī)溶劑加入的體積和明膠溶液的體積比為0.05-10∶1在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了本發(fā)明所述的三維明膠多孔支架材料的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟(a)取明膠溶解在去離子水中形成明膠溶液；(b)在上述明膠溶液中加入有機(jī)溶劑，混合均勻，形成乳液，所述的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正丙醇、丙三醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、丙酮、吡啶中的一種或多種；(c)在步驟(b)所得的乳液中，加入交聯(lián)劑，預(yù)凍；(d)干燥預(yù)凍后的樣品獲得多孔明膠支架；(e)用后處理液處理多孔明膠支架材料，去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)；(f)再次冷凍干燥制得如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中所配制的明膠溶液的濃度為0.5-40wt％的明膠溶液。
在另一優(yōu)選例中，所配制的明膠溶液的濃度為1-35wt％，更佳地為10-30wt％在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中有機(jī)溶劑加入的體積和明膠溶液的體積比為0.05-10∶1。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中有機(jī)溶劑加入的體積和明膠溶液的體積比為1-6∶1在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中加入的有機(jī)溶劑為甲醇、丙三醇、正丙醇、正丁醇或正戊醇。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中加入濃度為0.01-10％的交聯(lián)劑0.1-5ml，交聯(lián)時(shí)間為0.5-10min。
在另一優(yōu)選例中，所述的交聯(lián)劑濃度為0.25-5％，更佳地0.5-2％，；交聯(lián)時(shí)間為1-7min，更佳地1-5min；所述的交聯(lián)劑為戊二醛或碳化亞胺。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中的預(yù)凍溫度為-196℃至-10℃，更佳地-100℃至-20℃，冷凍溫度為-80℃至-20℃；冷凍時(shí)間為12-72小時(shí)，更佳地為24-48小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(e)中所用的后處理液為(不存在甲醇)、乙醇、去離子水或硼氫化鈉中的兩種或多種。
在另一優(yōu)選例中，步驟(e)中將步驟(d)中所得的明膠多孔支架放入無(wú)水乙醇中浸泡，然后用去離子水浸泡清洗或加入硼氫化鈉。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了本發(fā)明所述的三維明膠多孔支架材料的用途，它可用作皮膚組織工程的支架材料。
據(jù)此，本發(fā)明提供了提供一種微觀(guān)結(jié)構(gòu)均勻、易成型、機(jī)械強(qiáng)度好的多孔明膠支架材料。


圖1明膠多孔支架材料I的掃描電鏡照片圖2明膠多孔支架材料II的掃描電鏡照片圖3明膠多孔支架材料III的照片(a)大體照片；(b)掃描電鏡圖4明膠多孔支架材料IV的掃描電鏡照片圖5在明膠多孔支架材料上培養(yǎng)7天后的成纖維細(xì)胞具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入地研究，意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)改進(jìn)制版工藝可以制得一種性能極其優(yōu)越的三維明膠多孔支架材料，該支架材料孔的排列、孔徑大小分布均勻；易成型；抗壓、抗彎性能優(yōu)越。具體地，所述的三維明膠多孔支架材料可以用乳液冷凍干燥法獲得，在該方法中，用醇做油相，在適當(dāng)?shù)臄嚢杷俾氏滦纬删坏挠?水(O/W)相結(jié)構(gòu)，通過(guò)改變O/W相的比例、交聯(lián)劑的量、冷凍溫度等參數(shù)，對(duì)支架孔徑、孔隙率、力學(xué)性能、降解時(shí)間等性能進(jìn)行調(diào)控，從而本發(fā)明所提供的三維明膠多孔支架材料。
支架材料明膠屬天然高分子材料，本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料可作為組織工程材料，具有組織工程材料的一般特性，有良好的生物相容性和生物降解性，又具有特定形狀和連通三維多孔結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料優(yōu)選地，具有均一的孔形，更優(yōu)選圓孔；其孔徑大小均勻，為5-500μm，較佳地10-300μm，更佳地10-100μm；孔隙率大于90％，優(yōu)選85-99.9％；孔與孔的連通性好，而且水形成的冰晶不易對(duì)支架孔結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；其內(nèi)表面積大，具有良好的表面活性。
本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料可作成多種規(guī)則或不規(guī)則形狀，易于重復(fù)操作，在植入體內(nèi)后仍能保持原有形狀14-45天。本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料的機(jī)械強(qiáng)度好，便于先期操作。
本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料用乳液冷凍干燥法制得，所形成的均一乳液可直接倒入模具，冷凍成型后形成的支架收縮量較小，可制備不同形狀的支架。
制備方法本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料可用常規(guī)的方法制得。一種優(yōu)選的方法是(a)取明膠溶解在去離子水中，配制成明膠溶液；(b)在上述明膠溶液中加入有機(jī)溶劑，混合均勻，形成白色乳液；(c)在步驟(b)所得的乳液中，加入交聯(lián)劑，放入冰箱中預(yù)凍；(d)預(yù)凍后的樣品在冷凍干燥機(jī)中干燥，獲得多孔明膠支架；(e)用后處理液處理多孔明膠支架材料，去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)；(f)再次冷凍干燥制得本發(fā)明的三維明膠多孔支架材料。所使用的有機(jī)溶劑包括乙醇、正丙醇、丙三醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、丙酮或吡啶中的一種或多種，優(yōu)選甲醇、丙三醇、正丙醇、正丁醇或正戊醇；微相加入的體積和明膠溶液的體積比為0.05-10∶1，優(yōu)選1-5∶1；微相加入后的攪拌速率為100至2000r/min，優(yōu)選200至1800r/min；預(yù)凍溫度為-196℃至-10℃，較佳地為-100℃至-20℃，更佳地為-80℃至-20℃；冷凍時(shí)間為12-72小時(shí)，更佳地為24-48小時(shí)；去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)的后處理液為乙醇、去離子水或硼氫化鈉中的兩種或多種。
用途本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料可用于組織工程支架材料，也可用作藥物控釋載體。優(yōu)選地，用作皮膚組織工程支架材料。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料的孔結(jié)構(gòu)均勻、連通性好；孔膜孔徑范圍大，孔隙率高，而且孔結(jié)構(gòu)可控。
2、本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，而且容易成型。
3、本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料非常適合作為皮膚組織工程支架材料，在濕態(tài)下也能保持一定的形態(tài)和強(qiáng)度。
4、本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料各種性能可控。
5、本發(fā)明提供的乳液冷凍干燥法制備工藝簡(jiǎn)單，原料價(jià)格低廉，適合大眾化、規(guī)?；a(chǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
實(shí)施例1制備三維明膠多孔支架材料I
將1g明膠放入100ml水中，水浴30℃下磁力攪拌60min，使明膠完全溶解在水中，制成1％明膠溶液。放入-4℃保存，備用。
取10ml，1％的明膠溶液，水浴30℃下磁力攪拌。逐漸、分批加入10ml正戊醇，形成白色乳液。取0.5％戊二醛0.5ml，磁力攪拌1min后倒入模具，放入-20℃冰箱預(yù)凍24h。取冷凍后的明膠，在冷凍干燥機(jī)中干燥，得到多孔明膠支架材料粗產(chǎn)品。
將明膠支架材料用乙醇浸泡，再用去離子水浸泡沖洗，去除有機(jī)溶劑和殘留物。再次冷凍干燥，得到三維明膠多孔支架材料I。見(jiàn)附圖1。
所制得的三維明膠多孔支架材料I形狀為塊狀，孔隙率為97.3％，孔徑40-100μm。
實(shí)施例2制備三維明膠多孔支架材料II將2g明膠放入100ml水中，在水浴35℃下磁力攪拌60min，使明膠完全溶解，配制成2％的明膠溶液。放入-4℃保存，備用。
取10ml，2％的明膠溶液，水浴35℃下磁力攪拌。逐漸、分批加入15ml正丙醇，形成白色乳液。取0.5％戊二醛1ml，磁力攪拌2min后倒入模具，放入-20℃冰箱預(yù)凍24h。取冷凍后的明膠，在冷凍干燥機(jī)中干燥后得到白色多孔材料。
將白色明膠多孔材料用乙醇浸泡，再用去離子水浸泡沖洗，用5％的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，用大量去離子水洗滌，去除有機(jī)溶劑，殘留物。再次冷凍干燥，得到三維明膠多孔支架材料II。見(jiàn)附圖2。
所制得的三維明膠多孔支架材料II形狀為塊狀，孔隙率為96.5％，孔徑16-50μm。
實(shí)施例3制備三維明膠多孔支架材料III將5g明膠放入100ml水中，在水浴37℃下磁力攪拌60min，使明膠完全溶解在水中，制成5％明膠溶液。放入-4℃保存，備用。
取10ml，5％的明膠溶液，水浴37℃下磁力攪拌。逐漸、分批加入20ml正丁醇，形成白色乳液。取1％戊二醛0.5ml，磁力攪拌3min后倒入模具，放入-25℃冰箱預(yù)凍至少24h。取冷凍后的明膠，在冷凍干燥機(jī)中干燥得到白色多孔材料。
將白色明膠多孔材料用乙醇浸泡，再用去離子水浸泡沖洗，用5％的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，用大量去離子水洗滌，去除有機(jī)溶劑，殘留物。再次冷凍干燥，得到三維明膠多孔支架材料III。見(jiàn)附圖3。
所制得的三維明膠多孔支架材料III形狀為管狀，孔隙率為98.6％，孔徑15-40μm。
實(shí)施例4制備三維明膠多孔支架材料IV將10g明膠放入100ml水中，在水浴40℃下磁力攪拌60min，使明膠完全溶解，配制成10％明膠溶液。放入-4℃保存，備用。
取10ml，10％的明膠溶液，水浴40℃，磁力攪拌。逐漸、分批加入30ml甲醇，形成白色乳液。取1％戊二醛1ml，磁力攪拌4min后倒入模具，放入-30℃冰箱預(yù)凍至少24h。取冷凍后的明膠，在冷凍干燥機(jī)中干燥得到白色多孔材料。
將白色明膠多孔材料用乙醇浸泡，再用去離子水浸泡沖洗，用5％的硼氫化鈉除去游離的戊二醛，用大量去離子水洗滌，去除有機(jī)溶劑，殘留物。再冷凍干燥，得到三維明膠多孔支架材料IV。見(jiàn)附圖4。
所制得的三維明膠多孔支架材料IV形狀為不規(guī)則狀，孔隙率為96.8％，孔徑10-25μm。
實(shí)施例5制備三維明膠多孔支架材料V將25g明膠放入100ml水中，在水浴45℃，磁力攪拌60min，使明膠完全溶解在水中，制成25％明膠溶液。放入-4℃保存，備用。
取10ml，25％的明膠溶液，水浴45℃，磁力攪拌。逐漸、分批加入40ml丙三醇，形成白色乳液。取0.5％碳化亞胺0.5ml，磁力攪拌5min后倒入模具，放入-80℃冰箱預(yù)凍24h。取冷凍后的明膠，在冷凍干燥機(jī)中干燥得到白色多孔材料。
將白色明膠多孔材料用乙醇浸泡，再用去離子水浸泡沖洗，去除有機(jī)溶劑，殘留物。再冷凍干燥，得到三維明膠多孔支架材料V。
所制得的三維明膠多孔支架材料V孔隙率為97.3％，孔徑20-50μm，形狀不規(guī)則。
實(shí)施例6制備皮膚組織工程用支架通過(guò)乳液冷凍干燥法制備的三維明膠多孔支架材料I，經(jīng)75％的酒精浸泡消毒，紫外線(xiàn)照射后用于接種皮膚成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)并收集的人的成纖維細(xì)胞，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成細(xì)胞懸液，滴加到已消毒的三維明膠多孔支架材料上，細(xì)胞接種密度為1×105cells/cm2。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～14天，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS沖洗，2.5％的戊二醛水溶液固定，鋨酸后固定，CO2臨界點(diǎn)干燥，SEM觀(guān)察成纖維細(xì)胞在三維明膠多孔支架材料上的生長(zhǎng)情況。見(jiàn)附圖5。
結(jié)果本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料和成纖維細(xì)胞的相容性良好，培養(yǎng)3天后即可見(jiàn)伸展成梭形的成纖維細(xì)胞貼附在支架表面，支架的孔結(jié)構(gòu)隱約可見(jiàn)，大部分被細(xì)胞所覆蓋。成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)旺盛，材料的下表面也可見(jiàn)大量的細(xì)胞。培養(yǎng)7天后，明膠支架被細(xì)胞所鋪滿(mǎn)，形成細(xì)胞膜層。由此可見(jiàn)，成纖維細(xì)胞在本發(fā)明的三維明膠多孔支架材料上生長(zhǎng)良好，該材料對(duì)于皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)講是良好的支架材料，細(xì)胞復(fù)合明膠支架將可能用于皮膚缺損。
實(shí)施例7-10制備皮膚組織工程用支架通過(guò)乳液冷凍干燥法制備的三維明膠多孔支架材料II-V通過(guò)實(shí)施例6所描述的方法制得的皮膚組織工程用支架，其結(jié)果與實(shí)施例6中的結(jié)果類(lèi)似。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種支架材料，其特征在于，所述的材料含有(a)90-100重量份明膠和(b)0.000001-2重量份的水，并且組分(a)和(b)占支架材料總重量的90-100％；并且，所述的支架材料具有以下特性(1)孔隙率為85-99.9％；(2)所述的材料的平均孔徑為5-500μm；(3)孔的排列以及孔徑大小分布均勻，孔徑為20-80μm范圍的孔占全部孔的80％以上。
2.如權(quán)利要求1所述的支架材料，其特征在于，所述的材料的孔徑為10-300μm。
3.如權(quán)利要求1所述的支架材料，其特征在于，孔隙率為90-95％，平均孔徑為20-200μm，其中孔徑在20-80μm之間的孔占全部孔的80％以上。
4.如權(quán)利要求1所述的支架材料，其特征在于，所述的材料是采用包括以下步驟的乳液冷凍干燥法制得的(a)取明膠溶解在去離子水中形成明膠溶液；(b)在上述明膠溶液中加入有機(jī)溶劑，混合均勻，形成乳液，所述的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正丙醇、丙三醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、丙酮、吡啶中的一種或多種；(c)在步驟(b)所得的乳液中，加入交聯(lián)劑，預(yù)凍；(d)干燥預(yù)凍后的樣品獲得多孔明膠支架；(e)用后處理液處理多孔明膠支架材料，去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)；(f)再次冷凍干燥制得如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料。
5.如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括以下步驟(a)取明膠溶解在去離子水中形成明膠溶液；(b)在上述明膠溶液中加入有機(jī)溶劑，混合均勻，形成乳液，所述的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正丙醇、丙三醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、丙酮、吡啶中的一種或多種；(c)在步驟(b)所得的乳液中，加入交聯(lián)劑，預(yù)凍；(d)干燥預(yù)凍后的樣品獲得多孔明膠支架；(e)用后處理液處理多孔明膠支架材料，去除有機(jī)溶劑和殘留物質(zhì)；(f)再次冷凍干燥制得如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所配制的明膠溶液的濃度為0.5-40wt％的明膠溶液。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(b)中有機(jī)溶劑加入的體積和明膠溶液的體積比為0.05-10∶1。
8.如權(quán)利要求5或7所述的制備方法，其特征在于，步驟(b)中加入的有機(jī)溶劑為甲醇、丙三醇、正丙醇、正丁醇或正戊醇。
9.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(c)中加入濃度為0.01-10％的交聯(lián)劑0.1-5ml，交聯(lián)時(shí)間為0.5-10min。
10.一種如權(quán)利要求1所述的三維明膠多孔支架材料的用途，其特征在于，它用作皮膚組織工程的支架材料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種三維明膠多孔支架材料，它孔徑大小分布均勻，易成型，抗壓、抗彎。本發(fā)明還公開(kāi)了用乳液冷凍干燥法制得上述三維明膠多孔支架材料的方法。本發(fā)明提供的三維明膠多孔支架材料非常適合作為皮膚組織工程支架材料。
文檔編號(hào)A61L27/56GK101036803SQ20061002468
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者趙莉, 曹誼林, 崔磊 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司