專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法，特別是涉及一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法背景技術(shù)纖維素是天然植物纖維的主要成分，細(xì)菌纖維素是由微生物產(chǎn)生的一類(lèi)纖維素，從纖維素的分子組成看，二者都是由β-D-葡萄糖通過(guò)β-1，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合成的直鏈，直鏈間彼此平行，不呈螺旋構(gòu)象，無(wú)分支結(jié)構(gòu)，又稱(chēng)β-1，4-葡萄糖。細(xì)菌纖維素和植物纖維素在化學(xué)性質(zhì)上是相同的，但細(xì)菌纖維素作為一種新型生物材料，有許多獨(dú)特的性質(zhì)。(1)高楊氏模量、高抗張強(qiáng)度和極佳的形狀維持能力。(2)超細(xì)(納米級(jí))，細(xì)菌纖維絲帶的形成過(guò)程如下木醋桿菌細(xì)胞壁側(cè)的小孔分泌出的纖維素微纖絲直徑為1.78nm，相鄰幾根微纖維絲間由氫鍵相互聯(lián)接形成的微纖束直徑為3～4nm，而由微纖維束聯(lián)接成的纖維絲帶寬度為30～100nm厚度為3～8nm。(3)高純纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(4)有較高的生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性。
細(xì)菌纖維素作為燒傷病人和慢性皮膚潰爛患者的生物敷料，有利于皮膚組織生長(zhǎng)和限制感染。J.D.Fontana用靜態(tài)法生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素膜經(jīng)干燥后制成一種生物末(商品注冊(cè)名為BioFill)，可作為臨時(shí)皮膚替代物，用于燒傷、潰瘍和移植。Ciechanska Danuta通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成，來(lái)改良細(xì)菌纖維素的性能，根據(jù)對(duì)改良細(xì)菌纖維素物理化學(xué)性質(zhì)、機(jī)械性能和生物醫(yī)學(xué)測(cè)試的結(jié)果，表明它具有一些良好的獨(dú)特性質(zhì)，如生物活性、生物可降解性、生物適應(yīng)性和無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，尤其是良好的機(jī)械韌性，可作為極佳的生物醫(yī)學(xué)材料。
據(jù)了解，僅在中國(guó)，每年因意外事故或疾病導(dǎo)致皮膚缺損的病患者人數(shù)就高達(dá)320萬(wàn)。目前國(guó)內(nèi)大多采用豬皮、異體人皮材料(由多聚物結(jié)合其他化學(xué)物質(zhì)—包括從鯊魚(yú)軟骨中提取的物質(zhì)制造而成)等治療皮膚缺損，這些生物敷料功能單一、應(yīng)用范圍較窄，且存在易感染細(xì)菌或病毒、易產(chǎn)生排斥反應(yīng)等隱患。美國(guó)、日本等國(guó)雖然成功找到了利用膠原蛋白或甲殼素等原材料生產(chǎn)生物敷料的方法，但由于價(jià)格昂貴等問(wèn)題，目前難以在中國(guó)和世界其他地區(qū)大規(guī)模應(yīng)用。并且用于人造皮膚的這些材料，其形狀結(jié)構(gòu)都需要進(jìn)行多種工序的加工及消毒處理，有的還要進(jìn)行加工成型處理，制作工藝的復(fù)雜性更易導(dǎo)致潛在的病毒入侵及成本的昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足或缺陷，滿(mǎn)足醫(yī)療和某些特定人群的需要。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法，包括如下步驟(1)用無(wú)菌吸管吸取0.2～0.6ml液體培養(yǎng)基，滴入盛菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在25～33℃培養(yǎng)1～3天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔1～3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)6～10次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于25～33℃在轉(zhuǎn)速為400～450rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)20～25h，再接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案步驟(2)中接入液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方案為以1～10％的不同接種量，接入5.0～7.0的相同PH值的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；以5～9％的相同接種量，接入5.0～7.0的相同PH值的液體培養(yǎng)基中觀察6～10天；以5～9％的相同接種量，10～1000cm2的相同液面表面積，5.0～7.0的相同PH值，接入1～30cm的不同培養(yǎng)液深度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天或以5～9％的相同接種量，4～10cm的相同液面深度，5.0～7.0的相同PH值，接入10～1000cm2的不同液面表面積的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天四中方案中的一種。
所述的產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌種包括包括木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、產(chǎn)醋桿菌(A.acetigenum)、醋化桿菌(Acetobacter aceti)、巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)、葡萄糖桿菌(Gluconobater spp)、農(nóng)桿菌(Agrobaterium tumefaciens)、根瘤菌(Rhizobium trifolii)、八疊球菌(Sarcina ventriculi)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、椰毒假單胞菌(P.cocovenenans)、空腸彎曲菌(Campylobater je juni)中的一種或幾種。
所述的斜面培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、瓊脂1～30g。
所述的液體培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、蛋白胨1～20g、檸檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g。
所述的種子培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、檸檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g、MgSO41～10g。整個(gè)培養(yǎng)及接種過(guò)程是在無(wú)菌室中完成的。
本發(fā)明的原理是從細(xì)菌纖維素生物合成的初步階段著手，在菌種優(yōu)化的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格控制培養(yǎng)液的滅菌過(guò)程及細(xì)菌纖維素膜的無(wú)雜菌培養(yǎng)環(huán)境。使合成的細(xì)菌纖維素膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、比表面積基本滿(mǎn)足用于人造皮膚骨架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)控制不同的接種量、PH值、培養(yǎng)液深度、培養(yǎng)液表面積、發(fā)酵時(shí)間等條件，獲得不同結(jié)構(gòu)特征的細(xì)菌纖維素濕膜，找出其內(nèi)在的規(guī)律性，反復(fù)進(jìn)行大量的試驗(yàn)獲得各個(gè)條件的技術(shù)指標(biāo)。
本發(fā)明的有益效果是(1)總結(jié)細(xì)菌纖維素形態(tài)結(jié)構(gòu)的可控性操作，從而有目的地指導(dǎo)今后細(xì)菌纖維素膜的合成。
(2)精確了解細(xì)菌生物合成初步條件對(duì)產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素膜的影響，可以指導(dǎo)我們進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)菌纖維素膜用于人造皮膚研究。
(3)細(xì)菌纖維素膜整個(gè)合成過(guò)程中的無(wú)雜菌污染環(huán)境，及合成路線(xiàn)中沒(méi)有諸如加工成型等操作工序的引入，這些都大大降低了細(xì)菌纖維素作為人造皮膚的潛在病毒入侵隱患。
(4)熟悉合成條件之后可以做出任意形狀的細(xì)菌纖維素膜，這些膜柔軟性接近人的皮膚，韌性和貼附性都非常好，保存辦法簡(jiǎn)單。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
實(shí)施例1(1)用無(wú)菌吸管吸取0.2mL液體培養(yǎng)基，滴入盛木醋桿菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)1天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)6次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于25℃在轉(zhuǎn)速為400rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)20h，再接入液體培養(yǎng)基中，改變接種量(3％～9％)，其他條件不變，接入液體培養(yǎng)基，第7天觀察，細(xì)菌纖維素的厚度在接種量7％時(shí)達(dá)到最大值2.3mm，此后出現(xiàn)厚度減小的趨勢(shì)。
(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
實(shí)施例2(1)用無(wú)菌吸管吸取0.6ml液體培養(yǎng)基，滴入盛葡萄糖桿菌(Gluconobater spp)菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在33℃培養(yǎng)3天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔1轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)10次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于33℃在轉(zhuǎn)速為450rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)25h，再接入液體培養(yǎng)基中，改變PH值(5.0～7.0)，其它條件不變，接入液體培養(yǎng)基，第7天觀察，細(xì)菌纖維素膜的厚度在PH值為5.6時(shí)達(dá)到最大值2.2mm，此后出現(xiàn)厚度減小的趨勢(shì)。
(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
實(shí)施例3(1)用無(wú)菌吸管吸取0.4ml液體培養(yǎng)基，滴入盛根瘤菌(Rhizobium trifolii)菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)2天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔2天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)8次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于30℃在轉(zhuǎn)速為420rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)22h，再接入液體培養(yǎng)基中，改變液面深度(4～10cm)，其他條件不變，接入液體培養(yǎng)基，第7天觀察，細(xì)菌纖維素膜的厚度在液面深度4cm時(shí)達(dá)到最大值2.6mm，此后出現(xiàn)厚度減小的趨勢(shì)。
(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
實(shí)施例4(1)用無(wú)菌吸管吸取0.3mL液體培養(yǎng)基，滴入盛木醋桿菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)1天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)6次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于28℃在轉(zhuǎn)速為400rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)20h，再接入液體培養(yǎng)基中，改變液面表面積(10～1000cm2)，其他條件不變，接入液體培養(yǎng)基，第7天觀察，細(xì)菌纖維素膜的厚度在基本保持不變?yōu)?.0mm。
(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
實(shí)施例5(1)用無(wú)菌吸管吸取0.6mL液體培養(yǎng)基，滴入盛木醋桿菌(Acetobacter xylinum)菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)3天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)7次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于25℃在轉(zhuǎn)速為450rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)25h，再接入液體培養(yǎng)基中，改變液面表面積(10～1000cm2)，其他條件不變，接入液體培養(yǎng)基，第7天觀察，細(xì)菌纖維素膜的比表面積基本保持不變?yōu)?18.6m2/g。
(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
權(quán)利要求
1.一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用無(wú)菌吸管吸取0.2～0.6ml液體培養(yǎng)基，滴入盛菌株的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移植于斜面培養(yǎng)基上，在25～33℃培養(yǎng)1～3天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔1～3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)6～10次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于25～33℃在轉(zhuǎn)速為400～450rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)20～25h，再接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中接入液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方案為以1～10％的不同接種量，接入5.0～7.0的相同PH值的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；以5～9％的相同接種量，接入5.0～7.0的相同PH值的液體培養(yǎng)基中觀察6～10天；以5～9％的相同接種量，10～1000cm2的相同液面表面積，5.0～7.0的相同PH值，接入1～30cm的不同培養(yǎng)液深度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天或以5～9％的相同接種量，4～10cm的相同液面深度，5.0～7.0的相同PH值，接入10～1000cm2的不同液面表面積的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天四中方案中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌種包括木醋桿菌、產(chǎn)醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農(nóng)桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌、空腸彎曲菌中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、瓊脂1～30g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～120g、酵母膏1～20g、CaCO31～30g、蛋白胨1～20g、檸檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖10～100g、蔗糖10～50g、酵母膏1～10g、蛋白胨1～20g、檸檬酸1～10g、Na2HPO41～10g、KH2PO41～10g、MgSO41～10g。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于整個(gè)培養(yǎng)及接種過(guò)程是在無(wú)菌室中完成的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人造皮膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法，包括如下步驟(1)用無(wú)菌吸管吸取0.2～0.6ml液體培養(yǎng)基，移植于斜面培養(yǎng)基上，在25～33℃培養(yǎng)1～3天，將其轉(zhuǎn)移到同樣的斜面培養(yǎng)基上，每隔1～3天轉(zhuǎn)移一次，如此重復(fù)6～10次，完成菌種的活化過(guò)程；(2)取一環(huán)活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，于25～33℃在轉(zhuǎn)速為400～450rpm/min的磁力攪拌器下攪拌培養(yǎng)20～25h，再接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；(3)將纖維素濕膜快速分離提純后，放冰箱內(nèi)保存。有益效果是合成過(guò)程中的無(wú)雜菌污染環(huán)境，降低了細(xì)菌纖維素作為人造皮膚的潛在病毒入侵隱患?？梢宰龀鋈我庑螤畹募?xì)菌纖維素膜，其柔軟性接近人的皮膚，韌性和貼附性好，保存方便。
文檔編號(hào)A61L27/14GK1850302SQ200610026708
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者王華平, 孫曉玉, 鄒瑜, 陳仕艷, 顏志勇, 石帥科, 方正然, 王彪, 張玉梅 申請(qǐng)人:東華大學(xué)