專利名稱：一種成纖維細胞特異性非病毒載體及其構建和該載體的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種非病毒載體，具體地說是關于一種成纖維細胞特異性非病毒載體及其構建和該載體的應用。
背景技術：
大面積骨缺損是骨科、口腔頜面外科及整形外科領域的一大難題。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，特別是其中的BMP-2或BMP-7能促進骨再生和缺損修復。隨著分子生物學的發(fā)展，ex vivo局部基因治療方法可將促進骨缺損修復的BMP基因導入基因遞送細胞，然后將細胞移植到缺損局部進一步表達，避免了直接局部注射BMP蛋白后蛋白作用濃度難以穩(wěn)定的問題。目前骨修復基因治療主要以骨髓基質細胞為基因遞送細胞，以病毒載體系統(tǒng)(主要為腺病毒、逆轉錄病毒和腺相關病毒)為導入系統(tǒng)。
本發(fā)明人的研究顯示用逆轉錄病毒載體將BMP-2基因轉導入成纖維細胞后，細胞表現(xiàn)出轉分化為成骨細胞的能力，而且在動物體內促進骨缺損的修復，但是同時我們也發(fā)現(xiàn)逆轉錄病毒的致瘤性。而采用普通非病毒載體介導BMP-2局部基因治療，BMP-2在人皮膚成纖維細胞表達水平低，表達時間短，只能在體外表現(xiàn)出微弱的成骨表型，體內未能成骨。
有人研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞中I型膠原蛋白α2基因的啟動子和增強子調控元件，能特異性地調控下游基因在成纖維細胞中的表達，這和細胞的功能以及所處的微環(huán)境中所存在的一些調控蛋白分子有關。在轉基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)膠原蛋白啟動子和增強子能夠使轉入的外源基因在成纖維細胞中表達增強。目前這方面的研究主要應用于兩個方面一是將這些啟動子用于轉基因動物和細胞，使得目的基因在動物某些組織或細胞內特異性表達增強，以便于研究這些蛋白或分子在胚胎發(fā)育、信號轉導及某些生理或病理狀態(tài)下的的作用等。另一方面主要用于腫瘤基因治療的研究以解決基因治療靶向性問題。目前未見用于將成纖維細胞作為基因遞送細胞，以非病毒載體為導入系統(tǒng)的基因治療的研究。
從基因遞送細胞來說，骨髓基質細胞是骨系細胞的前體細胞，容易誘導分化，但是骨髓基質細胞從骨髓中提取，取材不易，而且對于許多骨大面積缺損的病人來說，骨髓抽取本身將會引起大的繼發(fā)性的損傷，不易恢復。成纖維細胞取自皮膚，具有取材容易，體外容易擴增，損傷小，恢復快的優(yōu)點，但是成纖維細胞作為終末分化細胞，其接受外源基因的能力相對較差。從基因導入的載體系統(tǒng)來說，病毒載體系統(tǒng)雖然轉導效率高，但是具有免疫原性強，生物安全性差的缺點。而非病毒載體雖然可以攜帶大片斷DNA，并具有生物安全性好，制備簡單等優(yōu)點，但是其轉導的基因表達為瞬時表達，表達時間短，表達效率低，優(yōu)越性難以體現(xiàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于
(1)提供一種成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2；(2)提供一種成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2構建方法；(3)提供一種用pcDNA3-CEP-BMP-2表達BMP-2蛋白質的方法；(4)pcDNA3-CEP-BMP-2在制備基因治療骨缺損藥物中的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現(xiàn)的在現(xiàn)有研究結果的基礎上，選擇人成纖維細胞特異的I型膠原蛋白α2基因的啟動子和增強子調控元件，構建含有此種調控元件的、非病毒的BMP-2表達載體，從而增強外源基因BMP-2在人成纖維細胞中特異表達的效率和延長表達時間，使成纖維細胞自身向成骨細胞分化或轉分化，并在移植體內后誘導周圍細胞向成骨細胞分化或轉分化，促進骨修復。一些基因啟動子往往有多個增強子調控元件，在不同增強子的調控下，這些基因表現(xiàn)出組織細胞特異性，而在其他表達該基因的細胞中，中心啟動子則使基因呈基礎水平轉錄。由于組織或細胞所處的微環(huán)境和需要行使的功能各不相同，因此在這些細胞中存在一些特定的基因轉錄調控蛋白，包括轉錄因子、反式激活蛋白和阻遏蛋白以及共激活蛋白，這些調控蛋白作用于上述的DNA調控序列，在調控序列的協(xié)調作用下，使有些基因的轉錄活性處于一定的高水平狀態(tài)。將細胞特異啟動子增強子克隆至外源目的基因的上游，可以利用細胞內特定的一些調控蛋白激活載體上的啟動子和增強子，增強下游目的基因的表達。這個含有成纖維細胞特異啟動子和增強子元件的非病毒載體可以在其他所有將成纖維細胞作為基因遞送細胞，以非病毒載體系統(tǒng)為導入系統(tǒng)的局部基因治療和再生醫(yī)學目標下應用。
本發(fā)明所述的人成纖維細胞特異的非病毒載體是指將I型膠原蛋白α2(COL1A2)的啟動子和增強子克隆至普通真核表達載體pcDNA3-BMP-2的的BMP-2上游，構建成pcDNA3-CEP-BMP-2。分別將空載體(pcDNA3)、普通BMP-2表達載體(pcDNA3-BMP-2，簡稱普通載體)和人成纖維細胞特異的BMP-2表達載體(pcDNA3-CEP-BMP-2，簡稱細胞特異性載體)轉染人成纖維細胞(HDF)和靜脈內皮細胞(HVEC)，RT-PCR檢測提示I型膠原蛋白α2啟動子和增強子確實能提高外源基因BMP-2在成纖維細胞中的表達，而對于上皮細胞則不能提高外源基因的表達。檢測轉染后人皮膚成纖維細胞分泌BMP-2蛋白，從蛋白水平證明I型膠原蛋白α2啟動子和增強子確實能提高外源基因BMP-2在成纖維細胞中的表達，表達持續(xù)時間和效率長于普通載體。早期成骨表型堿性磷酸酶含量和活性明顯高于普通載體。轉染細胞特異性載體的成纖維細胞形成的礦化結節(jié)明顯多于普通載體，而空載體轉染細胞基本上沒有礦化結節(jié)。這說明與普通載體相比，含I型膠原蛋白α2啟動子和增強子的細胞特異性載體能增強HDFs的成骨表型。體內研究說明與普通載體相比，含I型膠原蛋白α2啟動子和增強子的細胞特異性載體能增強HDFs的體內促進成骨能力。
本發(fā)明中細菌感受態(tài)的制備及質粒的細菌轉化如下挑取LB平板上的DH5α新鮮菌落單個克隆接種至50ml LB中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜(250rpm)；次日取0.5ml菌液加至500ml LB中培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌液于250ml離心瓶內，冰上放置10分鐘至1小時，4℃3000rpm離心10分鐘，沉淀細菌；用含10％甘油(v/v)的滅菌水(WB液)洗滌沉淀；4℃ 3000rpm離心30分鐘；棄上清，重復上一步；輕輕倒去上清，加入新鮮冰預冷的WB液20ml；輕吹打混勻菌液制備成感受態(tài)菌，取200μl為一份分裝于預冷的EP管內，現(xiàn)用或-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 電穿孔細胞轉化前，自-70℃取出感受態(tài)菌，4℃冰浴融化；加入1μl質粒，混勻；冰上放置10分鐘；轉入預冷的干凈電穿孔樣品杯(0.1cm)內，進行電穿孔轉化細菌。電穿孔條件300Ω，25μF，2.5kv。電穿孔后立即將樣品杯重放置冰上10分鐘；然后將混合物加入800μl的SOC培養(yǎng)基內，輕微顛倒混勻；37℃，100rpm溫和搖動45分鐘；稍離心后，棄去大部分上清，留100μl重懸沉淀，并均勻涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，待液體被吸收，倒置平皿，37℃培養(yǎng)12-16小時，挑取轉化菌落進行質粒小量制備。
將挑取的菌落接種至5ml含有100μg/ml Amp的LB中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜(250rpm)；次日取1.5ml菌液，13000rpm離心1分鐘；棄上清，加入溶液I，溶液II，溶液III各200μl，充分混勻后，室溫15分鐘；13000rpm離心5分鐘；盡棄上清，加入1/10體積的NaAc和2.5倍體積冰預冷的無水乙醇，4℃ 13000rpm離心30分鐘；棄上清，用70％的乙醇快速洗一下沉淀出的DNA，離心，小心吸干上清，以37℃預熱的雙蒸水50μl溶解DNA。進一步鑒定。
本發(fā)明中質粒的大量制備及純化如下取1ml已擴增的菌液加至100ml LB(含Amp100μg/ml)中，37℃、250rpm搖床培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期。4℃6000rpm離心15分鐘；棄上清，溶液P1(含RNase A)10ml重懸沉淀，混勻；加入37℃預熱的溶液P2 10ml，輕柔顛倒混勻數(shù)次；再加入冰預冷的P3 10ml，輕柔顛倒混勻數(shù)次；冰浴20分鐘；4℃ 20000g離心30分鐘；將上清移至預先用緩沖液QBT 10ml平衡過的柱子(QIAGEN-Tip500)上過柱；然后用緩沖液QC 20ml洗柱2次，再用65℃預熱的緩沖液QF洗脫質粒，以潔凈的高速離心管收集流液；最后加異丙醇3.5ml，4℃ 15000g離心30分鐘以沉淀質粒DNA；經75％乙醇洗滌后，用適量雙蒸水溶解；260nm測定OD值，鑒定質粒的含量和純度；適當?shù)南拗菩詢惹忻感×棵盖?，電泳檢測。
一種成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2，所述的COL1A2啟動子-378bp到+52bp的近轉錄起始位點的啟動子與-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增強子區(qū)域克隆普通真核表達載體pcDNA3-BMP-2上。(含有該載體菌株DH5α/pcDNA3-CEP-BMP-2于2006年5月18日送交位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC M206050)。
pcDNA3-CEP-BMP-2載體構建包括以下步驟(a)COL1A2增強子連接到pcDNA3；(b)BMP-2基因連接到pcDNA3-CE；(c)COL1A2啟動子，連接到pcDNA3-CE-BMP-2得到pcDNA3-CEP-BMP-2載體。
其(a)步驟中COL1A2增強子連接到pcDNA3的Xho I的位點上，其(b)步驟中BMP-2基因連接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位點上，其(c)步驟中COL1A2啟動子，連接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位點上，擴增啟動子的上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’。
一種BMP-2蛋白質是由下列方法制得(b)構建pcDNA3-CEP-BMP-2載體；(b)用脂質體非病毒的方法轉染成纖維細胞。
成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2在制備基因治療骨缺損藥物中的應用。
本發(fā)明所公開一種成纖維細胞特異性非病毒載體及其構建和該載體的應用，其優(yōu)點表現(xiàn)在該新型載體既避免了病毒載體的免疫原性、成瘤性等問題，又彌補了普通非病毒載體表達強度不夠的缺點，能使成纖維細胞作為基因遞送細胞的長處得到發(fā)揮，短處得到克服。
在本發(fā)明中外源基因為BMP-2，因而該載體促進成纖維細胞介導的成骨，輔以生物材料可能用于骨缺損修復。除了應用于成纖維細胞介導的成骨作用，這一新型載體還可以應用于其他以成纖維細胞為基因遞送細胞的基因治療和再生醫(yī)學目的，用于促進真皮、肌腱等組織形成。


圖1 pcDNA3-CE質粒篩選(lane1及l(fā)ane6為7.8kb重組質粒，其余l(xiāng)ane為空載體)圖2酶切鑒定pcDNA3-CE(lane1pcDNA3-CE質粒，lane2DNA marker，lane3Sal I酶切，lane4Kpn I酶切)
圖3 pcDNA3-CE-BMP-2質粒篩選鑒定(lane4、5、8、9、10、11、13、15、20、23為插入BMP-2基因的重組質粒)圖4 PCR鑒定pcDNA3-CE-BMP-2(lane1pcDNA3；lane2pcDNA3-CE；lane3marker；lane4、8、11、13、23為正向插入的正確的質粒)圖5 sph I酶切鑒定pcDNA3-CE-BMP-2(lane1pcDNA3；lane2pcDNA3-CE；lane3-7PCR正確的重組質粒；lane8marker；)圖6PCR鑒定pcDNA3-CEP-BMP-2(lane1marker；lane2ddH2O；lane3pcDNA3-CE-BMP-2；lane4pcDNA 3-CEP-BMP-2)圖7RT-PCR檢測hBMP-2基因的表達((A)HDFs，(B)HVEC；1pcDNA3，2pcDNA3-BMP-2，3pcDNA3-CEP-BMP-2)圖8ELISA檢測轉染后成纖維細胞BMP-2分泌圖9酶化學檢測轉染后成纖維細胞ALP活性圖10ELISA檢測轉染后成纖維細胞骨鈣素分泌圖11茜素紅染色檢測轉染并經誘導培養(yǎng)后成纖維細胞礦化能力(ApcDNA3，BpcDNA3-BMP-2，CpcDNA3-CEP-BMP-2)圖12轉染后成纖維細胞移植裸鼠肌肉內8周組織HE染色((A)轉染pcDNA3-BMP-2，(B)轉染pcDNA3-CEP-BMP-2，HC肥大軟骨細胞，M肌肉，F(xiàn)成纖維細胞，B骨組織，C軟骨細胞；×10)
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1人成纖維細胞特異性非病毒BMP-2表達載體構建材料真核表達載體質粒pβ-gal-Basic-UE(含collagen 1A2的啟動子和增強子)由美國紐約大學Mount Sinai醫(yī)學院生化和分子生物教研室的Dr.Francesco Ramirez饋贈。
質粒pcDNA3-BMP-2由本室從美國Cambridge遺傳研究所Dr Wozney饋贈的質粒pSP65-BMP-2進行亞克隆構建。
限制性內切酶EcoR I，HindIII，Kpn I；Klenow酶(購自Takara公司)；T4 DNA連接酶，CIP酶。(購自Promega公司)方法第一步從質粒pβ-gal-Basic-UE切下2.3kb大小的COL1A2增強子，連接到pcDNA3的Xho I的位點，轉化并篩選作Sal I、Kpn I酶切鑒定，正確的克隆(pcDNA3-CE)測序鑒定；第二步將1.6kb大小的BMP-2基因從pcDNA3-BMP-2切下，連接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位點，篩選并作PCR鑒定，上游引物CEf5’-aattctgatgatagatt-3’，下游引物BMPr5’-attaaagaagaatcta-3’，正確的克隆(pcDNA3-CE-BMP-2)測序鑒定；第三步用PCR方法從質粒pβ-gal-Basic-UE擴出450bp大小的promotor(啟動子)片斷，上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’，連接到pCDNA3-CE-BMP-2中的BamH I酶切位點，PCR方法鑒定，上游引物為膠原蛋白enhancer序列5’-ttagagggacaatggaagtt-3’，下游引物為promoter序列5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’，陽性克隆測序鑒定。
結果2.3kb大小的COL1A2 enhancer(增強子)連接到pcDNA3的Xho I酶切位點后形成7.8kb的pcDNA3-CE，質粒篩選后經酶切鑒定并做測序鑒定正確；將1.6kb大小的BMP-2基因連接到pcDNA 3-CE中Xba I酶切位點構建pcDNA 3-CE-BMP-2，質粒篩選，PCR和酶切鑒定后經測序鑒定正確；450bp左右大小的promotor(啟動子)連接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位點構建形成新的重組載體，我們將其命名為pCDNA3-CEP-BMP-2，經菌落PCR鑒定并測序證實構建正確。CEP代表collagen enhancer and promotor，指人成纖維細胞特異的調控元件，即位于I型膠原蛋白α2(COL1A2)基因近起始位點-378bp到+52bp的啟動子區(qū)域和遠離起始位點-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增強子區(qū)域。因此pcDNA3-CEP-BMP-2載體是一個將COL1A2的啟動子和增強子克隆至普通真核表達載體的BMP-2上游構建而成的人成纖維細胞特異的、非病毒的BMP-2表達載體。
實施例2BMP-2基因在人皮膚成纖維細胞(HDF)和靜脈內皮細胞(HVEC)中的表達材料細胞人皮膚成纖維細胞從小兒包皮環(huán)切手術廢棄物組織法培養(yǎng)擴建，人靜脈內皮細胞由本室凍存。
質?？蛰d體pcDNA3(Invitrogen公司)、普通BMP-2表達載體pcDNA3-BMP-2質粒pcDNA3-BMP-2(由本室從美國Cambr idge遺傳研究所Dr Wozney饋贈的質粒pSP65-BMP-2進行亞克隆構建)。、成纖維細胞特異表達載體pcDNA3-CEP-BMP-2。(上述方法構建)方法分別于轉染質粒pcDNA3、pcDNA3-BMP-2和pcDNA3-CEP-BMP-2后3、6、9、12天取成纖維細胞和靜脈內皮細胞，TE消化，Trizol(購自Invitrogen公司)，裂解細胞，抽提RNA，并做RT-PCR檢測，BMP-2上游引物5’-taaaggtcgaccatggtggccg-3’，下游引物5’-ctcttttgtggagaggatgc-3’；擴增片斷長度為849bp；G3PDH上游引物5’-accacagtccatgccatcac-3’，下游引物5’-tccaccaccctgttgctgta-3’，擴增片斷長度為452bp。
結果在HDF和VEC中，pcDNA3轉染均未有BMP-2表達，在HDFs中，BMP-2的mRNA水平在轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的細胞均要高于pcDNA3-BMP-2，在HVEC細胞中則相反，BMP-2的mRNA水平在轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的細胞均低于pcDNA3-BMP-2，至第12天，轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的HVEC細胞已經沒有BMP-2的表達，而HDFs中BMP-2表達還可以維持在第9天的水平。說明I型膠原蛋白α2啟動子和增強子確實能提高外源基因BMP-2在成纖維細胞中的表達，而對于上皮細胞則不能提高外源基因的表達。
實施例3
ELISA法檢測轉染后BMP-2蛋白質表達水平材料與方法收集轉染pcDNA3、pcDNA3-BMP-2和pcDNA3-CEP-BMP-2后2d、、4d、6d、8d、10d的成纖維細胞上清，根據(jù)試劑盒說明檢測，酶標儀上讀取各孔405nm處的光吸收值(OD405)。據(jù)各濃度標準品的OD405得到標準曲線，并據(jù)標準曲線算出所測樣品中的BMP-2蛋白含量。
結果轉染第3天，轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的成纖維細胞分泌BMP-2蛋白含量為為pcDNA3-BMP-2的1.5倍，在第6天兩者沒有明顯差異，第9天轉染pcDNA3-BMP-2的HDFs開始下降，第12天繼續(xù)下降，而轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的成纖維細胞則分泌量一直維持至第12天，為空載體的2.3倍。說明I型膠原蛋白α2啟動子和增強子確實能提高外源基因BMP-2在成纖維細胞中的表達，表達持續(xù)時間長于普通載體pcDNA3-BMP-2。
實施例4轉染后成纖維細胞成骨表型檢測1.早期指標堿性磷酸酶材料與方法堿性磷酸酶(ALP)是成骨的早期指標，與BCIP/NBT反應產生紫色的溶液。轉染后2、4、6、8天的細胞收集裂解，取上清，檢測其OD490可反應ALP的活性。
結果酶化學方法檢測堿性磷酸酶活性顯示轉染pcDNA3-CEP-BMP-2后成纖維細胞堿性磷酸酶活性在第2天升高，是空載體的1.5倍，至第4、6天分別為空載體的1.7和2.3倍，而轉染pcDNA3-BMP-2的在第2天為空載體的1.1倍，并在第4、6天沒有上升。
2.晚期指標骨鈣素骨鈣素(osteocalcin，OCN)是一種酸性糖蛋白，為骨骼中含量最高的非膠原蛋白，占非膠原蛋白總量的10％～20％。由分化成熟的成骨細胞合成和分泌，主要沉積于骨基質中，與骨鈣化密切相關。因為分子中含有依賴維生素K的-羧基谷氨酸殘基，故又名r-羧基谷氨酸蛋白(bone-carboxyglutamate protein，BGP)，由于骨鈣蛋白主要在礦化形成期出現(xiàn)，故被認為是成骨細胞向礦化發(fā)生期即晚期分化的重要標記之一。
材料與方法將轉染后人皮膚成纖維細胞用誘導培養(yǎng)基(Medium106+50mg/ml ascorbic acid，+10mM β-glycerophosphate+10-7Mdexamethasone)培養(yǎng)，然后檢測晚期成骨表型。ELISA法檢測培養(yǎng)30天細胞分泌骨鈣素(osteocalcin，OCN)含量，酶標儀讀取OD450光吸收值(reference filter 650nm)。據(jù)各濃度標準品的OD405得到標準曲線，并據(jù)標準曲線算出所測樣品中骨鈣素含量。
結果轉染細胞特異性載體的HDFs在第12天OCN即開始升高并維持該水平至30天，而轉染普通載體的細胞分泌在第12天升高以后逐漸下降。說明修飾BMP-2的成纖維細胞的體外成骨能力較未修飾BMP-2的成纖維細胞強這說明與普通BMP-2表達載體相比，含I型膠原蛋白α2啟動子和增強子的成纖維細胞特異性BMP-2表達載體能增強晚期成骨表型。
3.礦化結節(jié)茜素紅屬蒽醌衍生物，可與鈣形成有色鰲和物，將鈣染成雙折光性的橘紅色，其染色深淺代表礦化能力的強弱。
材料與方法茜素紅染色檢測轉染后細胞的礦化能力。
結果茜素紅染色檢測誘導培養(yǎng)28天細胞礦化能力，結果顯示轉染細胞特異性載體的成纖維細胞形成的礦化結節(jié)明顯多于普通載體，而空載體轉染細胞基本上沒有礦化結節(jié)。這說明與普通BMP-2表達載體相比，含I型膠原蛋白α2啟動子和增強子的成纖維細胞特異性BMP-2表達載體能增強成纖維細胞的礦化能力。
實施例5裸鼠肌肉內異位成骨模型的建立(人HDFs移植)材料與方法人皮膚成纖維細胞經脂質體轉染后第3天，胰蛋白酶消化，600rpm離心，，無血清Medium106重懸，按每只裸鼠5×106個細胞注射入裸鼠后大腿肌肉內。實驗分為2組第1組為pcDNA-BMP-2組20只，另一組為pcDNA-CEP-BMP-2組20只，于注射2、4、6、8、10周分別拉頸處死，各時間點處死4只。取注射部位肌肉4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。
結果轉染pcDNA3-CEP-BMP-2的HDFs移植入裸鼠后大腿肌肉內，8周后在成纖維細胞團周圍出現(xiàn)成熟的或肥大的軟骨細胞以及骨組織。由于所形成的骨組織較小，X-Ray檢測未見到鈣化區(qū)，故我們將肌肉組織未經脫鈣便進行包埋檢測，所以骨組織結構不夠完整清晰。共有5％小鼠肌肉內發(fā)現(xiàn)異位成骨。而轉染普通載體的成纖維細胞移植后周圍只能看到少量軟骨細胞，沒有骨組織。
權利要求
1.一種成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2(含有該載體菌株DH5α/pcDNA3-CEP-BMP-2保藏編號CCTCC M 206050)，其特征在于所述的C0L1A2啟動子-378bp到+52bp的近轉錄起始位點的啟動子與-21.1kb到-18.8kb的一段2.3kb的增強子區(qū)域克隆至普通真核表達載體pcDNA3-BMP-2上。
2.根據(jù)權利要求1所述的pcDNA3-CEP-BMP-2載體的構建，其包括以下步驟(a)C0L1A2增強子連接到pcDNA3；(b)BMP-2基因連接到pcDNA3-CE；(c)C0L1A2啟動子連接到pcDNA3-CE-BMP-2得到pcDNA3-CEP-BMP-2載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2載體構建，其(a)步驟中C0L1A2增強子連接到pcDNA3的Xho I的位點上。
4.根據(jù)權利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2載體構建，其(b)步驟中BMP-2基因連接到pcDNA3-CE的Xba I酶切位點上。
5.根據(jù)權利要求2所述的pcDNA3-CEP-BMP-2載體構建，其(c)步驟中C0L1A2啟動子連接到pcDNA3-CE-BMP-2的BamH I酶切位點上，擴增啟動子的上游引物5’-agaggatccgatctgcaaattctgc-3’，下游引物5’-ataggatccgcagtcgtggccagta-3’。
6.一種BMP-2蛋白質是由下列方法制得(a)構建權利要求1所述的pcDNA3-CEP-BMP-2載體；(b)用脂質體非病毒的方法轉染成纖維細胞。
7.成纖維細胞特異性非病毒載體pcDNA3-CEP-BMP-2在制備基因治療骨缺損藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種成纖維細胞特異性非病毒載體及其構建和該載體的應用，本發(fā)明將成纖維細胞特異表達的I型膠原蛋白啟動子與增強子克隆至目的基因上游構建成成纖維細胞特異性的載體，用脂質體非病毒的方法轉染成纖維細胞，利用成纖維細胞特有的調控I型膠原蛋白轉錄表達機制，增強外源基因在成纖維細胞中的表達，使得成纖維細胞成為較為理想的基因遞送細胞，同時避免了病毒載體的不安全性和較高的免疫原性。
文檔編號A61K48/00GK1896247SQ20061002677
公開日2007年1月17日 申請日期2006年5月22日 優(yōu)先權日2006年5月22日
發(fā)明者易靜, 王茸影, 鄒嫣瓊, 王英 申請人:上海交通大學醫(yī)學院