專利名稱：與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因技術(shù)領(lǐng)域的核酸序列，特別是一種與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列。
背景技術(shù)：
利培酮(risperidone)是新一代的抗精神病藥物，1984年由比利時(shí)楊森制藥公司開發(fā)，商品名為維思通(Risperidal)，為苯異噁唑(benzisoxazole)衍生物，它與5-HT2受體和DRD2受體都有很高的親和力，與第一代抗精神病藥物相比，利培酮對(duì)精神分裂癥的陽性癥狀及陰性癥狀均有良好療效，且錐體外系癥狀(EPS)等不良反應(yīng)發(fā)生率低(Leysen JE，Gommeren W，Eens A，De Chaffog De CoucellesD，Stoof JC，Janssen PAJ.Biochemical profile of risperidone，a newantipsychotic.J Pharmacol Exp Ther 1988；247661-670)。在實(shí)際應(yīng)用中，利培酮的臨床療效存在很大的個(gè)體差異，僅有約50％的用藥患者可獲得較好療效，其它的服藥患者則療效不明顯、甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而目前臨床上除了試錯(cuò)試驗(yàn)外，尚無有效預(yù)測(cè)利培酮藥物效應(yīng)的方法，這種臨床療效的不確定性已成為用藥安全的重要隱患，而且浪費(fèi)了大量醫(yī)療資源(Miyamoto S，Duncan GE，Marx CE，Lieberman JA.Treatments for schizophreniaacritical review of pharmacology and mechanisms of action of antipsychoticdrugs.Mol Psychiatry 2005；10(1)79-104)?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，遺傳因素是利培酮臨床療效產(chǎn)生個(gè)體差異的重要原因，與利培酮臨床療效相關(guān)的基因主要包括代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、靶點(diǎn)等的編碼基因。DRD2是利培酮的主要作用靶點(diǎn)(Kapur S，Zipursky RB，Remington G.Clinical and theoretical implicationsof 5-HT2 and D2 receptor occupancy of clozapine，risperidone，andolanzapine in schizophrenia.Am J Psychiatry 1999；156(2)286-93)，DRD2基因的多態(tài)性可顯著影響DRD2的功能，這提示DRD2基因的多態(tài)性可能與利培酮臨床療效的個(gè)體差異有關(guān)。
單核苷酸多態(tài)性rs1799978(A-241G)位于DRD2基因上游調(diào)控區(qū)，經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，至今未見關(guān)于DRD2基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978與利培酮臨床療效相關(guān)，可作為分子標(biāo)記用于預(yù)測(cè)利培酮臨床療效的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列。使其可用于預(yù)測(cè)利培酮的臨床療效、指導(dǎo)利培酮的個(gè)體化治療。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978，所述的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A，在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，位于DRD2基因上游-241位。
所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為A純合子。個(gè)體利用利培酮治療更易于獲得較好療效。根據(jù)該多態(tài)性的等位位點(diǎn)特征可以預(yù)測(cè)利培酮的臨床療效，指導(dǎo)臨床合理用藥。
本發(fā)明所述利培酮臨床療效相關(guān)核酸序列如SEQ NO.1所示(a)序列特征*長(zhǎng)度1000堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(b)分子類型基因組DNA(gDNA文庫)(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源人(f)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200
ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000序列中251號(hào)的字母代表單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotidepolymorphisms，SNP)A/G的等位位點(diǎn)位置。
利用本發(fā)明提供的利培酮臨床療效相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸序列，構(gòu)建預(yù)測(cè)利培酮臨床療效的試劑盒，可用于利培酮的個(gè)體化治療。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1基因的收集和抽提精神分裂癥患者來自于中國(guó)上海市精神衛(wèi)生中心，以DSM-IV(中國(guó)精神病分類方案與診斷標(biāo)準(zhǔn)第二版修訂版)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。在知情同意的前提下參加本課題的研究，采集血液，并簽署知情同意書。所有入組患者均無第二代抗精神病藥物用藥史，經(jīng)過周期為4周的藥物清洗期后開始臨床實(shí)驗(yàn)。分別于實(shí)驗(yàn)開始、4周、8周時(shí)采用簡(jiǎn)明精神病量表(Brief Psychiatric Rating Scale，BPRS)對(duì)患者臨床癥狀評(píng)分，BPRS減分率大于或等于40％者定義為有效，小于40％者為無效。
實(shí)施例2核苷酸序列的獲得以及單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978的檢測(cè)本發(fā)明采用直接測(cè)序的方法對(duì)DRD2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978(其等位位點(diǎn)為A/G)等位位點(diǎn)在利培酮治療有效患者組和利培酮治療無效患者組中的頻率分布情況進(jìn)行了檢測(cè)。PCR反應(yīng)均采用96孔板，用Gene Amp PCR system9700完成。
(1)PCR反應(yīng)擴(kuò)增引物正向引物(Pri-F)5’-CCCCACCAAAGGAGCTGTACCT-3’(SEQ ID NO2)反向引物(Pri-R)5’-CAGAAAACGGATGCGGACCTCT-3’(SEQ ID NO3)反應(yīng)試劑反應(yīng)體系總體積為10.0ul，其中ddH2O 5.8ul滅菌雙蒸水Buffer 1.0ul聚合反應(yīng)緩沖液包含Mg2+ Tris-HCl溶液dNTP1.0ul2mM dNTP溶液Pri-F 0.5ul 10pmol/ul正向引物Pri-R 0.5ul 10pmol/ul反向引物Taq0.2ul DNA合成多聚酶DNA1.0ul 10ng/ul人體DNA擴(kuò)增模板反應(yīng)條件94℃ 4min，37×(94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 60s)，72℃ 10min，4℃∞(2)測(cè)序反應(yīng)PCR產(chǎn)物采用shrimp alkaline phosphatase(Roche，Basel，Switzerland)and exonulease I純化，具體過程按說明書操作。
測(cè)序反應(yīng)體系DNA 3.0ul 純化后DNA，計(jì)200ngBDT 1.0ul ABI BigDyeTerminator Cylce sequencing Ready Reaction
Kit 3.1Primer 1.0ul所獲得的PCR產(chǎn)物的正向或反向引物3pmol/ul測(cè)序反應(yīng)條件96℃ 2min，40×(94℃ 30s，50℃ 30s，60℃ 120s)，4℃∞結(jié)束后加入70％乙醇避光靜置15分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，甩去乙醇，70％乙醇洗兩次，靜置晾干，加入HIDI變性后上樣。測(cè)序采用ABI PRISM3100 DNA Sequencer進(jìn)行。
實(shí)施例3單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978與利培酮臨床療效的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)利用SPSS10.0計(jì)算等位位點(diǎn)、基因型的分布和Hardy-Weinberg平衡，并計(jì)算Odds Ratio(OR)及其95％的可信區(qū)間，采用G Power Program計(jì)算所用樣本量的統(tǒng)計(jì)學(xué)力度，選用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性水平設(shè)定為P小于0.05。
結(jié)果位于11q22-23區(qū)域DRD2基因上游調(diào)控區(qū)的rs1799978(其等位位點(diǎn)為A/G)等位位點(diǎn)在利培酮治療有效患者組和利培酮治療無效患者組中的頻率分布情況見表1。
表1.rs1799978等位位點(diǎn)和基因型在利培酮治療有效患者組和無效患者組中的分布和分析結(jié)果

注OROdds Ratio；CIConfidence intervals從上表可見，位于11q22-23區(qū)域DRD2基因上的常見型單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978的A等位位點(diǎn)，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，在利培酮治療有效組中的分布頻率明顯大于其在利培酮治療無效組中的頻率(P＝0.007)，因此可作為預(yù)測(cè)利培酮臨床療效的標(biāo)記分子。rs1799978位于DRD2基因上游-241位，可能影響DRD2基因的表達(dá)，或與其它功能性多態(tài)性位點(diǎn)連鎖。
本發(fā)明的具有實(shí)用性的例證1)可以利用本發(fā)明所介紹的rs1799978的A等位位點(diǎn)(即在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn))作為預(yù)測(cè)利培酮臨床療效的標(biāo)記分子，為臨床合理用藥提供依據(jù)。
2)利用本發(fā)明提供的多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978的核酸序列，構(gòu)建用于指導(dǎo)利培酮個(gè)體化治療的試劑盒。
3)由于DRD2基因是多種抗精神病藥物的作用靶點(diǎn)，因此，本發(fā)明為今后對(duì)DRD2基因與其他抗精神病藥物療效關(guān)系公開了前期最寶貴的經(jīng)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和應(yīng)用技術(shù)。
序列表<110>上海交通大學(xué)<120>與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列<160>1<210>1<211>1000<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
<221>allele<222>(251)…(251)<223>序列中第251位核苷酸為a或g<400>1ggcctccttt tgcatttcca tgtcaggtca actccaaaca ggctttttcc 50
tttggatgag tccagcaata gaactgacta catagattcc aagacctgaa 100gtcagaaaac ggatgcggac ctcttccaac acctcctctc cttgcctgac 150ttgctggatg ggtggtgcct cccgcaaccc ttggcttctg agtcctcaaa 200ggagaagact ggcgagcaga cggtgaggac ccagcctgca atcacagctt 250attactctgg gtgtgggtgg gagcgcagtg ggcggtcgag ggttgcgttc 300ccgcctcaaa acaagggatg gcggaatccc ccaacccctc ctacccgttc 350aggccgggga tcgccgagga ggtacagctc ctttggtggg gggcgggggc 400ggggcctgtc tcaggggcgg ggaccggggc acctccctcc cgcgctcccc 450gcgctcgggc gccgcagagc tgtccagctt cagtgccgaa ccggcagcct 500cacgcgcgca ccgcgccgcc tccgccccgt ccccgcgctc cctcctgccc 550gcccgccccg cgcccggccc cgccccgccc cgccccgccg cggcccgtcc 600actgctcccc gcgggccaga gccggccgag ctgctgcccg ccggggctct 650gaacggcgcg gcggggccgg gagccaggga ccggccgagg agagtggcgg 700ccccggacgg ctgccggagg ggcggccgcg cgtggatgcg gcgggagctg 750gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc ccccgggcgc cctatggctt 800gaaggtaagc accggccgga tggagcggcg ggcgactcag tgtcacgggg 850agaggaggag ggacctccaa ggggagcgag gccaggacca gaagtttgtg 900cggccactcc tggccgcctg ctcgggagcg cccgcctggg atccggctct 950gcatgggctc cccgtcgggc gggggcagag ggcgtctgga gcccgcggct 1000
權(quán)利要求
1.一種與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列，其特征在于，所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列，其特征是，所述的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978，是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列，其特征是，所述的DNA，在其互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，位于DRD2基因上游-241位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列，其特征是，所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為A純合子。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因技術(shù)領(lǐng)域的與利培酮臨床療效相關(guān)的核酸序列。本發(fā)明所分離出的DNA分子，它具有SEQ ID NO1所示的序列，在SEQ ID NO1所示序列的第251位為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978，所述的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1799978是指在SEQ NO1所示序列中的第251為存在A。所述的DNA，在其互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，位于DRD2基因上游－241位。所述的SEQ ID NO1序列，其中，第251位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為A純合子。通過本發(fā)明預(yù)測(cè)利培酮的臨床療效不依賴于醫(yī)生的主觀判斷，且時(shí)效性強(qiáng)，因此是臨床合理用藥可以借助的有力工具。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1884528SQ200610028329
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者賀林, 邢清和, 秦?zé)? 高建軍, 錢學(xué)慶, 李華芳 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)