專利名稱：制備多糖玻璃體微粒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術領域的制備方法。特別是一種制備多糖玻璃體微粒的方法。
背景技術：
基因重組技術用于治療蛋白的表達和生產(chǎn)的20多年以來，到目前為止，已有30多個蛋白藥物產(chǎn)品投入臨床使用，近200個在審批和研發(fā)過程中，涌現(xiàn)出一批諸如安進(Amgen)、基因技術(Genentech)等一批新的大型醫(yī)藥公司。相對于蛋白大分子藥物本身的快速發(fā)展，其劑型技術進展緩慢。一方面，蛋白大分子藥物口服不吸收、體內(nèi)半衰期短，需要注射給藥；另一方面，許多何爾蒙、細胞因子類的蛋白藥物藥物治療周期長，長期而頻繁地注射成為必須，也影響患者順應性的主要原因。緩釋蛋白藥物的劑型的研發(fā)，由于在制備微粒過程導致活性的損失諸如W/O/W法等。發(fā)展制備具有活性保護的蛋白微粒勢在必行。而葡聚糖和PEG是常用來蛋白藥物的凍干保護劑和分離純化蛋白的試劑。Hennink利用修飾的葡聚糖制備蛋白緩釋微球的報道，但是作者用到強氧化劑如過硫酸鉀、過硫酸銨等，及聚合物引發(fā)劑使葡聚糖分子發(fā)生交聯(lián)，這些難免不與蛋白發(fā)生反應，導致蛋白的失活或增加免疫原性。到目前還未見在水性環(huán)境下，不用交聯(lián)劑或固化劑制備聚合物的微粒方法報道。
經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)[Hennink.W.E.and Franssen.O.PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CONTROLLED RELEASESYSTEM.Publication No.WO/1998/022093 International Application NoPCT/NL1997/000625]，(Hennink.W.E.and Franssen.O.一種控釋系統(tǒng)的制備方法，公開號.WO/1998/022093.國際申請?zhí)朠CT/NL1997/000625)，該專利報道了水相-水相兩相系統(tǒng)制備多糖顆粒。不過它們使用了可以交聯(lián)的多糖，而著些交聯(lián)基團是通過化學修飾得到。這樣不僅會改變多糖的本身的性質，有可能增加多糖的免疫原性，同時這些交聯(lián)基團也可能與蛋白質和多肽發(fā)生交聯(lián)，因為交聯(lián)基團并沒有特殊的選擇性。我們避免了使用交聯(lián)來使不穩(wěn)定的水相-水相乳液制備多糖玻璃體。
現(xiàn)有技術中的專利[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo THE PREPARATIONMETHOD OF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASE EMULSION AND ITSUSE，Publication Number InternationalWO/2002/000778 Application No.PCT/CN2001/001033](陳勵；朱華；金拓穩(wěn)定的高分子水相-水相乳液的制備及其應用公開號為，WO/2002/000778國際申請?zhí)朠CT/CN2001/001033)，該專利揭示一種新型的穩(wěn)定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制備方法和在制藥及生物技術中的應用。該乳液與常規(guī)乳液的根本區(qū)別在于其分散相和連續(xù)相均為水溶液。即通過將高分子電解質引入高分子親水兩項體系(aqueous two-phase system)產(chǎn)生擴散雙電層，從而開發(fā)了一個獨特的材料體系穩(wěn)定的不需連續(xù)攪拌或者(對分散相的)即時固化高分子水相-水相乳劑。將這一體系用于蛋白大分子藥物緩釋微球劑型的制備，獲得了理想的結果。然而，有些蛋白分子可能與高分子電解質發(fā)生相互作用，造成聚集。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種制備多糖玻璃體微粒的方法。使其制備的微粒表面光滑圓整，均勻度好，顆粒規(guī)無粘連，在完全無有機溶劑、不加任何交聯(lián)劑、聚合物引發(fā)劑及表面活性劑尤其是高分子電解質類表面活性劑，以避免這些對藥物的治療的作用影響。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明在-2℃-4℃的條件，兩種或兩種以上的互不形容的水溶性聚合物，在外界條件下如勻質化、Voterx、超聲機械攪拌等作用下形成乳液，然后凍干并除去連續(xù)散相得到多糖玻璃體微粒。不需使用有機相(或稱油相)乳化，不需使用交聯(lián)劑、固化劑、表面活性劑，不存在水-油、水-氣等強界面張力的界面。
本發(fā)明具體包括以下步驟
①將聚乙二醇(PEG)、聚環(huán)氧乙烷(PEO)或聚吡咯烷酮(PVP)等和多糖溶于水中配成溶液，在低溫的條件下，按照大于1∶1(W/W)的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②將生物活性物質加入其中，或與多糖、聚乙二醇一并加入，或不加藥物；③將完成步驟②的乳劑冷凍；④將完成步驟③的樣品凍干；⑤將完成步驟④的樣品用溶劑洗滌除去PEG、PEO或PVP連續(xù)相獲得多糖分散相顆粒。
所述的PEG、PEO或PVP，其分子量為1,000-30,000。
所述的PEG、PEO或PVP，其濃度為0.2％-50％之間。
所述的多糖，其分子量為50,000-500,000。
所述的多糖，其濃度為2％-20％。
所述的多糖，為葡聚糖或者葡聚糖、淀粉、纖維素及其衍生物、瓊脂糖和水溶性高分子多糖。
所述的PEG、PEO或PVP，用于除去PEG、PEO或PVP，連續(xù)相的有機溶劑是溶解PEG而不溶解多糖的溶劑。
所述的多糖分散相顆粒，含有緩沖物質、鹽類和小分子糖類物質。
所述的緩沖物質為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4中的一種；小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇中的一種。
所述的多糖分散相顆粒，可以用來微囊化結構脆弱的治療物質--諸如蛋白質、多肽、基因物質、抗體、疫苗、病毒和脂質體等可被擔載于多糖微粒之中；所述的多糖分散相顆粒，可以用于其所擔載的治療物質的緩釋微球劑型和吸入劑型；所述的緩釋微球劑型，載有治療物質的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基質中；通過將多糖微粒分散在可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成復乳即油包固體—水包油(S/O/W)的方法，或者通過將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成復乳即油包固體—油包油(S/O/O)的方法。
所述的吸入劑型，為載有治療物質的多糖本身，其粒徑為1μm-5μm。
一、空白多糖玻璃體制備1.制備PEG和多糖水溶液用超純水分別制備10％的PEG和10％的多糖水溶液，精確稱取10克PEG和10克多糖水分別放在100毫升的燒杯里加水90克，然后把兩個燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和多糖全部溶解取下來冷卻待用。
2.制備PEG和多糖低溫水相-水相乳液在0℃-4℃的條件下，將1.的多糖和PEG水溶液按照體積比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成水相-水相乳液；或稱取按照多糖和PEG的質量比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶先混勻再加水，使之溶解形成水相-水相乳液。
3.冷凍制備PEG和多糖低溫水相-水相乳液將制備PEG和多糖低溫水相-水相乳液在冰箱冷凍過夜，也可以速凍不會影響玻璃體的大小。
4.將完成步驟3的樣品在真空冷凍干燥機凍干；5.將完成步驟4的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續(xù)相獲得多糖分散相顆粒。
二、載藥多糖玻璃體制備1.制備PEG和多糖水溶液均按照空白多糖玻璃體制備方法。
2.在0℃-4℃的條件下，把藥物和多糖溶液混合均勻，或把藥物和PEG和多糖水溶液一起混合制備載藥的PEG和多糖低溫水相-水相乳液。
3.冷凍多糖、藥物和PEG低溫水相-水相乳液4.將制備多糖、藥物和PEG低溫水相-水相乳液冷凍過夜。
5.然后按照制備空白多糖玻璃體4和5進行的方法得到載藥多糖玻璃體。
本發(fā)明制備的載藥多糖玻璃體可以直接用于吸入劑型，保護結構脆弱的生物試劑如蛋白質和多肽等藥物；通過將多糖微粒分散在可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成復乳即油包固體—水包油(S/O/W)的方法，或者通過將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成復乳即油包固體—油包油(S/O/O)的方法。
本發(fā)明完全避免了使用有機溶劑、高剪切力、界面、和交聯(lián)劑等，在溫和的條件下把生物活性物質，如蛋白質、多肽、疫苗、DNA、RNA、病毒和脂質體載入多糖玻璃體，能夠長期保持活性。大大的減少保存的費用和提高療效。同時制備的多糖玻璃體的粒徑小，活性高，因此在制備成其它劑型如緩釋微球，可以減少突釋和不完全釋放。
具體實施例方式
實施例一空白多糖玻璃體制備1.在0℃-4℃條件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.500gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶5(w/w)旋渦30s-60s充分混勻形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱預凍一晚，再在真空干燥24小時，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋渦5min，在12000RPM離心5min，去上清液，來回三次，在真空干燥揮盡二氯甲烷，收集微粒，取少量的在顯微鏡下觀察，或把它混懸在二氯甲烷中用PCS粒度散射儀測定其粒徑。粒徑在2μm-10μm，平均粒徑為5.7μm。
2.在0℃-4℃條件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.250gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶10(w/w)，旋渦30s-60s充分混勻形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱預凍一晚，再在真空干燥24小時，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋渦5min，在12000RPM離心5min，去上清液，來回三次，在真空干燥揮盡二氯甲烷，收集微粒，取少量的在顯微鏡下觀察，或把它混懸在二氯甲烷中用PCS粒度散射儀測定其粒徑。粒徑在1μm-5μm，平均粒徑為2.652μm。
3.在0℃～4℃條件下，配制成10％的Dex70,000和10％的PEG8,000溶液；按照取0.125gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶20(w/w)，旋渦30s-60s充分混勻形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱預凍一晚，再在真空干燥24小時，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋渦5min，在12000RPM離心5min，去上清液，來回三次，在真空干燥揮盡二氯甲烷，收集微粒，取少量的在顯微鏡下觀察，或把它混懸在二氯甲烷中用PCS粒度散射儀測定其粒徑。粒徑在0.5μm-5μm，平均粒徑為1.562μm。
4.在0℃-4℃條件下，配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.080g Dex70,000；3.200g PEG8,000，即1∶40(w/w)，旋渦30s-60s充分混勻形成水相-水相乳液，在-26℃冰箱預凍一晚，再在真空干燥24小時，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋渦5min，在12000RPM離心5min，去上清液，來回三次，在真空干燥揮盡二氯甲烷，收集微粒，取少量的在顯微鏡下觀察，或把它混懸在二氯甲烷中用PCS粒度散射儀測定其粒徑。粒徑在0.3μm-5μm，平均粒徑為309nm。
實施例二制備載牛血清白蛋白多糖玻璃體1.制備牛血清白蛋白、PEG和多糖水溶液用超純水分別制備10％的PEG和10％的多糖水溶液，精確稱取10克PEG和10克多糖水分別放在100毫升的燒杯里加水90克，然后把兩個燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下來冷卻待用。用電子天平精確稱取800毫克牛血清白蛋白溶于7.2毫升水中待用。
2.牛血清白蛋白、PEG和多糖水相-水相乳液在0℃-4℃條件下，將1.的多糖、牛血清白蛋白和PEG水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成水相-水相乳液；或稱取按照多糖和PEG的質量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水溶解，再按照多糖和牛血清白蛋白的重量比為1∶1加入，使之形成形成水相-水相乳液。
3.凍牛血清白蛋白、PEG和多糖水相-水相乳液將制備牛血清白蛋白、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些沒有分配到多糖相的蛋白質，在降溫過程中再分配到多糖分散相中，冷凍過夜。
4.完成步驟3的樣品在真空冷凍干燥機凍干；5.完成步驟4的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續(xù)相獲得載牛血清白蛋白多糖玻璃體。
得到的載牛血清白蛋白多糖分散相玻璃體的粒徑大都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻?？梢允古Ｑ灏椎鞍椎慕Y構得到好的保護，避免了在劑型制備過程失活。
權利要求
1.一種制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征在于，包括以下步驟①將聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷或聚吡咯烷酮和多糖溶于水中配成溶液，在低溫的條件下，按照重量大于1∶1的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②將生物活性物質加入其中，或與多糖、聚乙二醇一并加入；③將完成步驟②的乳劑冷凍；④將完成步驟③的樣品凍干；⑤將完成步驟④的樣品用溶劑洗滌除去PEG、PEO或PVP連續(xù)相獲得多糖分散相顆粒。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷或聚吡咯烷酮，其分子量為1,000-30,000。
3.根據(jù)權利要求1或者2所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷或聚吡咯烷酮，其濃度為0.2％-50％。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其分子量為50,000-500,000。
5.根據(jù)權利要求1或者2所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其濃度為2％-20％。
6.根據(jù)權利要求1或者2所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的多糖，為葡聚糖或者葡聚糖、淀粉、纖維素及其衍生物、瓊脂糖和水溶性高分子多糖。
7.根據(jù)權利要求1或者2所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的多糖，其分散相顆粒，含有緩沖物質、鹽類和小分子糖類物質。
8.根據(jù)權利要求1或者2所述的制備多糖玻璃體微粒的方法，其特征是，所述的緩沖物質為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4中的一種；小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術領域的制備多糖玻璃體微粒的方法。本發(fā)明包括以下步驟①將聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷或聚吡咯烷酮和多糖溶于水中配成溶液，在低溫的條件下，按照重量大于1∶1的比例混和，在外力的作用下，形成乳液；②將生物活性物質加入其中，或與多糖、聚乙二醇一并加入；③將完成步驟②的乳劑冷凍；④將完成步驟③的樣品凍干；⑤將完成步驟④的樣品用溶劑洗滌除去PEG、PEO或PVP連續(xù)相獲得多糖分散相顆粒。本發(fā)明完全避免了使用有機溶劑、高剪切力、界面、和交聯(lián)劑等，在溫和的條件下長期保持生物活性物質活性。大大的減少保存的費用和提高療效。同時制備的多糖玻璃體的粒徑小，活性高，因此在制備成其它劑型如緩釋微球，可以減少突釋和不完全釋放。
文檔編號A61K47/36GK1887273SQ20061002912
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權日2006年7月20日
發(fā)明者袁偉恩, 金拓, 吳飛 申請人:上海交通大學