專利名稱：一種化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
親環(huán)素Cycliphilins(CyPs)是普遍分布的細胞內(nèi)蛋白，在植物、細菌和哺乳動物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環(huán)孢素A的細胞受體被發(fā)現(xiàn)的。環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，作為免疫抑制劑藥物在臨床上常用于治療器官移植后所產(chǎn)生的排斥反應(yīng)及自身免疫系統(tǒng)疾病。目前已發(fā)現(xiàn)和克隆的CyPs有130多種異構(gòu)體[GalatA，Metcalfe SM.Peptidyl proline cis-trans iso-merases.Prog Biophys Molec Biol，1995；6367.]，它們構(gòu)成了Cyclophilins家族。CyPs具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，催化蛋白質(zhì)折疊過程，尤其是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，并且起著分子伴侶作用[Ivery MT.Immunophilinsswitched on protein binding domains？Med Res Rev.2000；20(6)452-484.]。與此同時，CyPs也廣泛參與相關(guān)的生物學(xué)過程如細胞凋亡[Lee JP，Palfrey HC，Bindokas VP，et al.The role of immunophilins in mutant superoxidedismutas-1 linked familial amyotrophic lateral sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA.1999；96(6)3251-3256.]和細胞間信號傳導(dǎo)[Jin ZJ，Melaragno MG，Liao DF，et al.CyclophilinA is a secreted growth factor induced by oxidative stress.Circ Res.2000；87(9)789-796.]等。
有許多研究顯示，CyPA能夠與人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白(Gag polyprotein)結(jié)合。這種結(jié)合使得CypA能夠被特異地包裝到HIV-1病毒體中，而不被包裝到其它逆轉(zhuǎn)錄病毒中[Franke EK，Yuan HE，Luban J.Specificincorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions.Nature.1994；372(6504)359-362.]。在HIV-1型病毒自組裝過程中，CyPA作為特定的組成部分進入病毒，在HIV-1感染細胞的早期階段發(fā)揮作用[Braaten D，F(xiàn)ranke EK，Luban J.Cyclophilin A isrequired for an early step in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1before the initiation ofreverse transcription.J Virol.1996；70(6)3551-3560.]。CypA與Gag的互作位點目前已經(jīng)被確定在Gag的N端CA結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域在HIV-1成熟后經(jīng)過切割成為p24外殼蛋白)，CypA的脯氨酸異構(gòu)酶活性能夠協(xié)助病毒完成感染細胞后的脫衣殼過程[Gamble TR，Vajdos FF，Yoo S，Worthylake DK，Houseweart M，Sundquist WI，Hill CP.Crystal structure of human cyclophilin A boundto the amino-terminal domain of HIV-1 capsid.Cell.1996；87(7)1285-1294.]。使用RNAi技術(shù)沉默CypA的表達[Braaten D，Luban J.Cyclophilin A regulates HIV-1infectivity，as demonstrated by gene targeting in human T cells.EMBO J.2001；20(6)1300-1309；Sokolskaja E，Sayah DM，Luban J.Target cell cyclophilin Amodulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.J Virol.2004；78(23)12800-12808.]，或者使用CsA及其衍生物[Sokolskaja E，Sayah DM，Luban J.Target cell cyclophilin A modulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.JVirol.2004；78(23)12800-12808.；Bartz SR，Hohenwalter E，Hu MK，Rich DH，Malkovsky M.Inhibition of human immunodeficiency virus replication bynonimmunosuppressive analogs of cyclosporin A.Proc Natl Acad Sci U S A.1995；92(12)5381-5385.；Steinkasserer A，Harrison R，Billich A，Hammerschmid F，Werner G，Wolff B，Peichl P，Palfi G，Schnitzel W，Mlynar E，et al.Mode of action of SDZ NIM811，a nonimmunosuppressive cyclosporin A analog with activity against humanimmunodeficiency virus type 1(HIV-1)interference with early and late events inHIV-1 replication.J Virol.1995；69(2)814-824.]來抑制CypA的活性，均能干擾HIV-1病毒的復(fù)制。
然而，到目前為止，尚未有人報道具有抗HIV病毒的CypA抑制劑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種化合物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)如
的分子在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用；其中，R1＝2-甲氧苯基；2-氨基苯基；2-羥基苯基；2-異丙基苯基或者2-乙氧苯基；R2＝苯基；3-甲苯基；3-t-丁苯基；3-羥基苯基或者3-三氟甲基苯基。本發(fā)明還包括對上述小分子化合物進行常規(guī)替代所得到的化合物，統(tǒng)稱為FD5。
本發(fā)明中，R1可以是2-乙氧苯基。
本發(fā)明中，R2可以是3-三氟甲基苯基。
本發(fā)明的一個實施例中，R1是2-乙氧苯基，R2是3-三氟甲基苯基，這樣本發(fā)明的化合物就成為2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺(即2-[(2-ethoxyphenyl)(methylsulfonyl)amino]-N-[4-[[[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino]sulfonyl]phenyl]-acetamide或者2-[2-ethoxy(methylsulfonyl)anilino]-N-(4-{[3-(trifluoromethyl)anilino]sulfonyl}phenyl)acetamide)，其結(jié)構(gòu)式為
鑒于抑制CypA活性的物質(zhì)可能干擾HIV-1病毒的復(fù)制，本發(fā)明針對CypA的活性位點設(shè)計了若干小分子抑制劑。由于是針對細胞靶點設(shè)計的藥物，而細胞靶點相對于病毒靶點來說突變速率相對較慢，因此不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。
首先，本發(fā)明對CypA小分子抑制劑進行了虛擬篩選。
Cyclophilin A(CypA，PPIA)基因在人類基因組數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被登錄，其錄入號為NM_021130。在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，檢索到了人類CypA蛋白的X光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CypA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。從這個結(jié)構(gòu)中，確定了CypA的活性位點，并且確定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān)鍵氨基酸位點。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息，本發(fā)明針對CypA活性位點，對若干小分子數(shù)據(jù)庫進行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫主要包括SPECS和CNPD，最后篩選到了本發(fā)明的FD5。整個計算過程是在中科院上海藥物所64CPU-SGI ORIGN3800計算機和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機上進行的。
其次，本發(fā)明利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果 BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相互作用，無需任何標記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時，將目的生物分子(CypA蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶劑并且流過芯片表面。監(jiān)測器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物分子結(jié)合、解離整個過程的變化。通過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，我們最終確定了12個能夠與CypA發(fā)生結(jié)合的小分子化合物，并且計算出了這些小分子化合物與CypA結(jié)合的平衡—解離常數(shù)KD。本發(fā)明的2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺其平衡解離常數(shù)KD(M)為KD＝6.61±0.09×10-6，Chi2＝0.248。其中，Chi2是BIAcore統(tǒng)計軟件中用于檢測實驗誤差的一個數(shù)據(jù)。
再次，本發(fā)明利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力，從而尋找出CypA的抑制劑。
測定CyP活性的方法很多，但以α-胰凝乳蛋白酶活性測定法(α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe對硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide)在溶液中其順式、反式結(jié)構(gòu)處于平衡，CyP能催化該底物發(fā)生順反異構(gòu)作用，即催化脯氨酸由順式變?yōu)榉词剑划斊涮幱诜词浇Y(jié)構(gòu)時，C端p-nitroanilide被α-胰凝乳蛋白酶裂解，釋放出色素基團對硝基苯胺，在390nm連續(xù)測定吸光值的變化即可得知CyP的PPIase活性。
我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不同濃度下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的IC50值。本發(fā)明的2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺其酶活抑制IC50值(μM)為14.45±0.67。
最后，本發(fā)明還測定了CypA小分子抑制劑對HIV-1病毒復(fù)制的影響。
化合物抗HIV-1病毒增值測試簡單的說，就是利用雙抗夾心法測定每個孔內(nèi)p24蛋白產(chǎn)生的量。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各個化合物抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值。結(jié)果2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值(ug/ml)為19.21±2.35。可見，2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺具有抑制HIV-1病毒復(fù)制的能力，可以作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué)合成的方法。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FD5發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人FD5為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人FD5可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD5還可與其他治療劑一起使用。
本發(fā)明的人FD5在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用中，可以是針劑或者片劑。
當本發(fā)明的人FD5多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
艾滋病(AIDS)是一種由艾滋病病毒，即人體免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，簡稱HIV)侵入人體后破壞人體免疫功能，使人體發(fā)生多種不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致被感染者死亡的一種嚴重傳染病。被稱為“當代瘟疫”和“超級癌癥”的艾滋病已引起世界衛(wèi)生組織(WHO)及各國政府的高度重視，無論是人員和經(jīng)費的投入均放在首位，我國已將其列入乙類法定傳染病，并為國境衛(wèi)生監(jiān)測傳染病之一。然而，到目前為止，尚無可以治愈該病的有效藥物。本發(fā)明的小分子化合物FD5具有抑制HIV-1病毒復(fù)制的能力，而且是針對細胞靶點設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。因此，本發(fā)明的FD5可以作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)， 為治療和治愈艾滋病提供了一種新的途徑和手段。

具體實施例方式 實施例1CypA小分子抑制劑的虛擬篩選 Cyclophilin A(CypA，PPIA)基因在人類基因組數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)被登錄，其錄入號為NM_021130。在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，我們檢索到了人類CypA蛋白的X光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CypA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。從這個結(jié)構(gòu)中，我們確定了CypA的活性位點，并且確定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān)鍵氨基酸位點。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息，我們與中國科學(xué)院上海藥物所合作，針對CypA活性位點，對若干小分子數(shù)據(jù)庫進行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫主要包括SPECS和CNPD。最后篩選到了本發(fā)明的FD5。整個計算過程是在中科院上海藥物所64CPU-SGIORIGN3800計算機和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機上進行的。
實施例2利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果 BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相互作用，無需任何標記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時，將目的生物分子(CypA蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶劑并且流過芯片表面。監(jiān)測器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物分子結(jié)合、解離整個過程的變化。通過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，我們最終確定了12個能夠與CypA發(fā)生結(jié)合的小分子化合物，并且計算出了這些小分子化合物與CypA結(jié)合的平衡—解離常數(shù)KD。本發(fā)明的2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺其平衡解離常數(shù)KD(M)為KD＝6.61±0.09×10-6，Chi2＝0.248。其中，Chi2是BIAcore統(tǒng)計軟件中用于檢測實驗誤差的一個數(shù)據(jù)。
實施例3利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力 測定CyP活性的方法很多，但以α-胰凝乳蛋白酶活性測定法(α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。
我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不同濃度下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的IC50值。本發(fā)明的2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺(CHEMCATS OrderNumberOVS2445294)。其酶活抑制IC50值(μM)為14.45±0.67，例如，14.7、14.96或者13.7。
實施例4化合物抗HIV-1病毒增值測試 MT-2細胞種于96孔板中，每孔104個。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。HIV-1病毒以100個50％組織感染當量來感染細胞，同時加入不同濃度梯度的化合物培養(yǎng)過夜(以不加化合物的孔為空白對照)。次日，更換不含小分子化合物的新鮮培養(yǎng)基。第四天，取100uL培養(yǎng)液上清，加入5％體積的Triton-X100處理后得到病毒裂解液，然后用ELISA方法測定p24蛋白含量(p24是HIV-1的外殼蛋白，可以作為衡量病毒粒子數(shù)量的指標)。簡單的說，就是利用雙抗夾心法測定每個孔內(nèi)p24蛋白產(chǎn)生的量。將抗HIV免疫球蛋白包板過夜(pH9.6碳酸緩沖液，4℃)，然后加入含4％脫脂奶粉的PBS封閉；加入100uL病毒裂解液后于37℃孵育1個小時，用預(yù)冷PBS沖洗若干次；加入辣根過氧化物酶標記的抗p24單克隆抗體，用TMB顯色一刻鐘；然后加入1N的硫酸溶液終止反應(yīng)，在酶標儀上讀取450nm時的光吸收值。以空白對照孔的光吸收值為參照，計算各個化合物抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值。
結(jié)果2-[(2-乙氧苯基)(甲基磺?；?氨基]-N-[4-[[[3-(三氟甲苯基]氨基]磺酰]苯基]-乙酰胺抑制HIV-1病毒p24蛋白產(chǎn)生的IC50值如下(ug/ml)FD5＝19.21±2.35。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)如
的分子的應(yīng)用，其特征是在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用；其中，R1＝2-甲氧苯基；2-氨基苯基；2-羥基苯基；2-異丙基苯基或者2-乙氧苯基；R2＝苯基；3-甲苯基；3-t-丁苯基；3-羥基苯基或者3-三氟甲基苯基。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，R1為2-乙氧苯基。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，R2為3-三氟甲基苯基。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗艾滋病藥物為針劑或者片劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域，涉及一種具有抗HIV活性的小分子化合物，其制備方法及應(yīng)用。CyPA能夠與人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白結(jié)合。使用RNAi技術(shù)沉默CypA或者抑制CypA的活性，均能干擾HIV-1病毒的復(fù)制。本發(fā)明的小分子化合物是CyPA抑制劑，具有抗HIV-1病毒的功能，而且本發(fā)明的小分子化合物是針對細胞靶點設(shè)計的，不易形成耐藥性，適合AIDS患者終身用藥的需求。因此，本發(fā)明的小分子化合物可以作為新的抗艾滋病藥物進行開發(fā)，為治療和治愈艾滋病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P31/00GK101108191SQ20061002917
公開日2008年1月23日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者龍 余, 帥 陳, 趙雪梅, 蔣華良, 唐麗莎 申請人:復(fù)旦大學(xué)