專利名稱：從廢血中提取免疫增強(qiáng)劑的聯(lián)產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從廢血中提取免疫增強(qiáng)劑的方法，尤其涉及從廢血中同時(shí)
提取SOD、 Ig及STF的方法。
背景技術(shù)：
S0D、 Ig及STF是免疫調(diào)節(jié)劑，都能提高免疫功能，三種產(chǎn)品都是可以
從血中分離得到的。
目前，許多專利文獻(xiàn)報(bào)道了 S0D、 Ig及STF的提取方法，但均為單產(chǎn)。 因此，如何從動(dòng)物血同時(shí)提取SOD、 Ig及STF，以提高動(dòng)物血的利用率
和提取效率，是人們所十分關(guān)注的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種從廢血中提取免疫增強(qiáng)劑的聯(lián) 產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。 本發(fā)明的方法包括如下步驟
(1) 將檸檬酸三鈉加入動(dòng)物血中，離心分離10-30分鐘，獲得血漿和
血球；
檸檬酸三鈉的加入量為動(dòng)物血重量的2~5%; 離心分離時(shí)的轉(zhuǎn)速為2500~3500r.p.m.;
所說的動(dòng)物血優(yōu)選采用羊的新鮮血、牛的新鮮血豬的新鮮血或馬的新 鮮血。
(2) SOD的提取
將血球用重量濃度為0.5 1.2%的NaCl水溶液洗滌，然后在 2500 3500r.p.m.的轉(zhuǎn)速下離心分離，獲得紅血球，加入等量的水溶血0.5-1.0 小時(shí)，獲得溶血液，接著加重量濃度為0.03 1.0%的二價(jià)金屬氯化物，去除
血紅蛋白，離心得粗酶液，然后用截留分子量為30000以下，通常是 6000-10000的超濾膜濃縮至原體積的1/10~1/2，獲得超濾液，加入超濾液 體積1/10-1/2的水，超濾，獲得的超濾液可反復(fù)加水超濾濃縮，以達(dá)到純 化的目的，超濾液加保護(hù)劑，冷凍干燥，得淺綠色凍干粉，即為超氧化物 歧化酶，簡(jiǎn)稱SOD;
SOD測(cè)活采用連苯三酚氧化法，醫(yī)藥工業(yè)，1988， 19(5): 217;
二價(jià)金屬氯化物的加入量為溶血液體積的0.3~0.1%;
所說的二價(jià)金屬氯化物選自氯化銅、氯化鈣、二氯化錳或氯化鎂中的 一種；
SOD的活性易失活，通常保護(hù)劑可選用蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖 等糖類，優(yōu)選海藻糖；
(3) Ig的提取
(3.1) 將步驟(1)獲得的血漿加入硫銨至50~55%的飽和度，4~10 i:靜置8~16小時(shí)，然后在3000 5000 r.p.m的轉(zhuǎn)速下離心分離20~30分鐘， 得沉淀物和清液；
(3.2) 沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝膠(G25)按照常規(guī)的 方法脫鹽，然后在所獲得的脫鹽溶液中，加入加利凡諾，沉淀，加入酸性 物質(zhì)或堿性物質(zhì)，控制pH為7.6~8.6，收集清液，用截留分子量為2000-3000 的超濾膜濃縮至原體積的1/10~1/2，凍干，獲得產(chǎn)品，成品為混合物，內(nèi)含 IgG、 IgM和IgA。
所說的利凡諾的化學(xué)名稱為6，9 二氨基2-乙氧基吖啶乳鹽； 酸性物質(zhì)選自鹽酸、醋酸或磷酸； 堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鈣或氫氧化鉀；
(4) STF的提取將葡聚糖凝膠(G25)加入步驟(3.1)中獲得的清 液脫鹽； .
將脫鹽清液先用截留分子量為6000~10000的中空纖維超濾膜超濾，除 去分子量6000以上的生物大分子，然后用截留分子量為2000 3000的超濾 膜超濾，最后在20 3(TC下真空濃縮，獲得胸腺因子STF濃縮液，凍干， 獲得產(chǎn)品；
所說的胸腺因子(STF)為9肽，分子量為1500, STF的氨基酸組成 為pGlu-Ala-Lys-Ser畫Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH。
術(shù)語
超氧化物歧化酶(SOD) Superoxide dismutase
胸腺因子(STF) Serum Thymic Factor
免疫球蛋白(Ig) Immunoglobulin 葡聚糖凝膠(G-25) SephdexG-25 本發(fā)明的方法， 一次投料同時(shí)可獲三種產(chǎn)品Ig、 STF和SOD，大大 提高了血液的利用率，制備過程中反復(fù)用超濾技術(shù)，并且用分子量截留新 思路，將產(chǎn)品一一分開，這是一種物理法，安全實(shí)用效果好，在SOD提取 過程中采用二價(jià)金屬氯化物和熱變性去血紅蛋白，以替代原工藝的氯仿和 乙醇，便于工業(yè)化生產(chǎn)。 ^
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
(1) 將10克檸檬酸三鈉加入1000克羊的新鮮血中，3500r.p.m.離心 分離30分鐘，獲得650克血漿和350克血球；
(2) SOD的提取
將血球用重量濃度為0.9%的NaCl水溶液洗滌，然后在3500r.p.m.的轉(zhuǎn) 速下離心分離，獲得紅血球，加入等量的水溶血30分鐘，獲得溶血液，接 著加入重量濃度為3.0%的氯化銅水溶液15ml，去除血紅蛋白，離心得粗酶 液，然后用截留分子量為10000的超濾膜濃縮至原體積的1/10,獲得超濾 濃縮液40ml,超濾液加15mg乳糖，冷凍干燥，得淺綠色凍干粉125mg SOD;
(3)SOD測(cè)活采用連苯三酚氧化法，醫(yī)藥工業(yè)，1988， 19 (5): 217;
(3) Ig的提取.-
(3.1) 將步驟(1)獲得的血槳加入硫銨至50%飽和度，4r靜置15 小時(shí)，然后在5000r.p.m的轉(zhuǎn)速下離心分離30分鐘，得沉淀物和清液；
(3.2) 沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝膠(G25)脫鹽，然后 再在所獲得的脫鹽溶液中，加入7克加利凡諾沉淀，用氫氧化鈉控制pH為 8.6，收集清液，用截留分子量為3000的超濾膜濃縮，得免疫球蛋白Ig濃 縮液，加乳糖保護(hù)劑，凍干，獲得650mg產(chǎn)品。
(4) 胸腺因子的提取將葡聚糖凝膠(G25)加入步驟(3.1)中獲得 的清液按照常規(guī)方法脫鹽；
將脫鹽清液先用截留分子量為6000的中空纖維超濾膜超濾，然后用截 留分子量為2000的超濾膜超濾，最后在25'C下真空濃縮，獲得胸腺因子 STF濃縮液，凍干，獲得65mg產(chǎn)品。
實(shí)施例2
(O將10克檸檬酸三鈉加入1000克牛的新鮮血中，3000r.p.m.離心分 離20分鐘，獲得600克血漿和400克血球；
(2) SOD的提取
將血球用重量濃度為0.9%的NaCl水溶液洗滌，然后在3000r.p.m.的轉(zhuǎn) 速下離心分離，獲得紅血球，加入等量的水溶血0.5小時(shí)，獲得溶血液，接 著加重量濃度為5n/。的氯化鋅水溶液25ml，去除血紅蛋白，離心得粗酶液， 然后用截留分子量為10000的超濾膜濃縮至原體積的2/10，獲得超濾膜濃 縮，反復(fù)加水超濾，最后獲得70ml濃縮液，加50mg蔗糖，冷凍干燥，得 淺綠色凍干粉135mgSOD;
(3) Ig的提取
(3.1)將步驟(1)獲得的血漿加入硫銨至55%飽和度，6'C靜置16
小時(shí)，然后在5000^.111的轉(zhuǎn)速下離心分離30分鐘，得沉淀物和清液；
(3.2)沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝膠(G25)按照常規(guī)方
法脫鹽，然后在所獲得的脫鹽溶液中，加入7克加利凡諾沉淀，加入氫氧
化鈉控制pH為8.6，收集清液，用截留分子量為3000的超濾膜濃縮，得免
疫球蛋白(Ig)，凍干，獲得1.0克產(chǎn)品。
(4)胸腺因子的提取將葡聚糖凝膠(G25)加入步驟(3. 1)中按照
常規(guī)方法脫鹽；
將脫鹽清液先用截留分子量為1000的中空纖維超濾膜超濾，然后用截 留分子量為3000的超濾膜超濾，最后在25'C下真空濃縮至原體積的1/10， 獲得胸腺因子(STF)濃縮液，加乳糖保護(hù)劑，凍干，獲得70mg產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.從廢血中提取免疫增強(qiáng)劑的聯(lián)產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將檸檬酸三鈉加入動(dòng)物血中，離心分離，獲得血漿和血球；(2)將血球用NaCl水溶液洗滌，然后在2500～3500r.p.m.的轉(zhuǎn)速下離心分離，獲得紅血球，加入等量的水溶血，獲得溶血液，接著加二價(jià)金屬氯化物，離心得粗酶液，然后用截留分子量30000以下的超濾膜濃縮至原體積的1/10～1/2，獲得超濾濃縮液，加入水，再濃縮超濾，最后超濾液加保護(hù)劑，冷凍干燥，得淺綠色凍干粉，即為超氧化物歧化酶(SOD)；(3)Ig的提取(3.1)將步驟(1)獲得的血漿加入硫銨至50～55％的飽和度，4～10℃靜置，然后在3000～5000r.p.m的轉(zhuǎn)速下離心分離，得沉淀物和清液；(3.2)沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝膠(G25)脫鹽，然后在所獲得的脫鹽溶液中，加入加利凡諾，沉淀，加入酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)，控制pH為7.6～8.6，收集清液，用截留分子量為3000～4000的超濾膜濃縮至原體積的1/10～1/2，凍干，獲得產(chǎn)品；(4)將葡聚糖凝膠(G25)加入步驟(3.1)中獲得的清液脫鹽；將脫鹽清液先用截留分子量為6000～8000的中空纖維超濾膜超濾，然后用截留分子量為1000～3000的超濾膜超濾，最后在25～30℃下真空濃縮，濃縮液加保護(hù)劑，冷凍干燥，獲得產(chǎn)品胸腺因子(STF)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檸檬酸三鈉的加入量為 動(dòng)物血重量的2 5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)離心分離時(shí)的 轉(zhuǎn)速為2500~3500r.p.m.。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，二價(jià)金屬氯化物的加入 量為溶血液體積的0.3~0.1%。 .
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的二價(jià)金屬氯化物 選自氯化銅、氯化鈣、二氯化錳或氯化鎂中的一種；保護(hù)劑選用蔗糖、乳 糖、甘露醇或海藻糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所說的動(dòng)物血 采用羊的新鮮血、牛的新鮮血、豬的新鮮血或馬的新鮮血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從廢血中提取免疫增強(qiáng)劑的聯(lián)產(chǎn)方法，本發(fā)明的方法，一次投料同時(shí)可獲三種產(chǎn)品Ig、STF和SOD，大大提高了血液的利用率，制備過程中反復(fù)用超濾技術(shù)，并且用分子量截留新思路，將產(chǎn)品一一分開，本法主要采用物理法，盡量避免和少加有機(jī)溶劑，故安全實(shí)用，效果好。在SOD提取過程中采用二價(jià)金屬氯化物和熱變性去血紅蛋白，以替代原工藝的氯仿和乙醇，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101112390SQ20061002944
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者李愛國(guó), 袁勤生, 健 趙 申請(qǐng)人:上海漢德食品有限公司;趙 健