專利名稱：核苷酸分子sr2b及其在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床 綜合征。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標(biāo)志， 久病可引起多個系統(tǒng)損害。病情嚴(yán)懲或應(yīng)澉時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。糖尿病主要臨床類型胰島素依賴型糖尿病(IDDM， I型)可發(fā)生在任何年 齡，但多發(fā)生于青幼年。臨床特點(diǎn)是起病急，多食、多尿、多飲、體重減輕等癥 狀較明顯，有發(fā)生酮癥酸中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。起病初期 血中胰島細(xì)胞自身抗體陽性率高?？诜咸烟且葝u釋放試驗(yàn)可見基礎(chǔ)胰島素水平 低于正常，葡萄糖刺激后胰島素分泌曲線低平，顯示胰島素缺乏。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM， H型)也可發(fā)生在任何年齡，但多見于 40歲以后中、老年。大多數(shù)病人起病緩慢，臨床癥狀相對較輕或缺如。無酮癥酸 中毒傾向，但在一定誘因作用下，也可發(fā)生酮癥酸中毒或髙滲性昏迷。依賴胰島 素，但在飲食和口服降糖藥治療效果欠佳時，或因并發(fā)癥和伴發(fā)病的存在，有時 亦需要用胰島素控制髙血糖。然而，到目前為止，尚未有人報道用于抗糖尿病的基因藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗糖尿病藥物的核苷酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。 本發(fā)明提供了一種分離出的核苷酸分子，它的序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAA。稱為SR2B。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子SR2B"指具有抑制BRSK2蛋白活性或者 增加胰島素分泌量，并且含有與GCUGCACGACGUUUAUGAA序列髙度同源的 核苷酸序列。該術(shù)語還包括與GCUGCACGACGUUUAUGAA的同源性至少 70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括GCUGCACGACGUUUAUGAA的核苷酸序列變異形式。這 些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地 1-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為10 個以內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在GCUGCACGACGUUUAUGAA 后(3 '端)加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。在本發(fā)明中，可在SR2B后(3 '端)連接dTdT,從而形成 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT。在本發(fā)明還提供了核苷酸分子,其序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA 和AAAGCUGUUCUUGAUGGAG。在本發(fā)明還提供了核苷酸分子，其序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdTUUCAUAAACGUCGUGCAGC。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有上述的核苷酸分子SR2B。 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用 市售的載體，然后將含有本發(fā)明SR2B核苷酸序列的 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成重組 載體。如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些 部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作 為前體表達(dá)并參與多肽的分泌,那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連 于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如 果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序
列。-般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于本發(fā)明的核酸分子則JE味奢 相鄰且不影響功能。本發(fā)明還提供了上述核苷酸分子SR2B的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿 主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞， 昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、 COS、 NIT細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SR2B的制備方法，即按 GCUGCACGACGUUUAUGAA的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發(fā)明的核苷酸分子SR2B可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的 核苷酸分子SR2B序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。
本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SR2B在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。用siRNA的方法將含有本發(fā)明SR2B核苷酸序列的 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC轉(zhuǎn) 染入小鼠的胰島P細(xì)胞(NU)中，放射性免疫學(xué)方法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng) 上清中胰島素的含量增加。進(jìn)一步研究表明，上述siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，原理是干擾了小鼠的胰島P細(xì) 胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2的表達(dá)，才導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。
從Northern的結(jié)果可見，BRSK2主要在腦和胰腺中表達(dá)，尤其以胰腺中的 表達(dá)量為最高。Western的結(jié)果與前面Northern的結(jié)果一致，BRSK2在小鼠中也 主要在腦和胰腺表達(dá)。從免疫組化的結(jié)果可見，BRSK2主要在胰腺組織的胰島 中表達(dá)。
神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2 (NCBI中核苷酸的序列號為AF533880,核苷 酸的序列號為AAP97727)在胰腺中有很高的表達(dá)量，甚至超過在腦中的表達(dá)量。 進(jìn)--步的免疫組化結(jié)果顯示，BRSK2主要在胰腺的胰島中髙表達(dá)。將
胰島素的含量，結(jié)果顯示，胰島素分泌減少另一方面用siRNA的方法干擾小 鼠的胰島卩細(xì)胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2的表達(dá)活性，同樣的放射性免疫學(xué)方法檢 測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。本發(fā)明的核苷酸分子SR2B及其類似物，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可 提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的 水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨 被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過 常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局 部給藥。以本發(fā)明的核苷酸分子SR2B為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子SR2B可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的1BRSK2還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的核苷酸分子SR2B被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10'傲克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的,.本發(fā)明中，所述的抗糖尿病藥物是由含有效治療l:的核苷酸分子SR2B和 藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片 劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發(fā)明中，所述藥物是針劑或者片劑。
糖尿病(diabetes memtus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床 綜合征。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標(biāo)志， 久病可引起多個系統(tǒng)損害。病情嚴(yán)懲或應(yīng)激時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。本發(fā)明的核苷酸分子SR2B加入小鼠的胰島p細(xì)胞(NIT)中，細(xì)胞培養(yǎng)上清 中胰島素的含量增加。因此認(rèn)為，本發(fā)明的核苷酸分子SR2B有促進(jìn)小鼠的胰島卩 細(xì)胞(NIT)中胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物或者進(jìn)行開發(fā)，為 緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 siRNA干擾內(nèi)源BRSK2表達(dá)以后對胰島素分泌的影響(1) 將NTT細(xì)胞以lM()5個/孔的密度接種在24孔板上，將細(xì)胞放入C02培 養(yǎng)箱中37"C培養(yǎng)18-24小時，使細(xì)胞豐度達(dá)到70-80。/i。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Nonsilence5fU( siRNA干擾的陰性對照 )，siRNA(GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC) -5 1fil、 3jil和5jil (每jil的濃度為20fiM)。每種轉(zhuǎn)染重復(fù)4個孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時，換成完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+15。/。胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM),培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢測試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測定值批內(nèi)CV<4.2%,批間0^<7.6%。(6) 培養(yǎng)板上的細(xì)胞胰酶消化后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。(7) 收集計數(shù)后的細(xì)胞做Western blot檢測內(nèi)源BRSK2的表達(dá)。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，用siRNA的方法干擾小鼠的胰島P細(xì)胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2， 同樣的放射性免疫學(xué)方法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。實(shí)施例2 BRSK2過量表達(dá)對胰島素分泌的影響(1) 將NIT細(xì)胞以lxl()5個/孔的密度接種在24孔板上，將細(xì)胞放入C02培 養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)18-24小時，使細(xì)胞豐度達(dá)到70-80%。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Pcmv-Myc空載體和Pcmv-Myc-BRSK2兩種質(zhì)粒，每種質(zhì)粒按照200ng/孔的濃 度各轉(zhuǎn)染4個孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時，換成完全培養(yǎng)基(DMEM髙糖培養(yǎng)基+15。/c胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM)，培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢測試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測定值批內(nèi)CV<4.2%,批間CV<7.6%。(6) 培養(yǎng)板上的細(xì)胞胰酶消化后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。(7) 收集計數(shù)后的細(xì)胞做Western blot檢測BRSK2-Myc的表達(dá)。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。過量表達(dá)的結(jié)果顯示，小鼠胰島Beta細(xì)胞NTT中過量表達(dá)BRSK2以后， 胰島素相對分泌量減少。
權(quán)利要求
1.一種分離出的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA。
2. —種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAA dTdT。
3. —種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA和UUCAUAAACGUCGUGCAGC。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC.
5. —種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子。
6. —種含有權(quán)利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的宿主細(xì)胞。
7. —種如權(quán)利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的制備方法，其特征 在于，按權(quán)利要求l、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團(tuán) 依次脫水縮合。
8. 如權(quán)利要求l、 2、 3或者4所述的核苷酸分子在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是所述的抗糖尿病藥物是由含有效治 療量的權(quán)利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組 成的藥物組合物。
10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是，所述藥物是針劑或者片劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征。臨床以高血糖為主要標(biāo)志，久病可引起多個系統(tǒng)損害。本發(fā)明的本發(fā)明的核苷酸分子SR2B加入胰島β細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。因此認(rèn)為，本發(fā)明的核苷酸分子SR2B有促進(jìn)胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物進(jìn)行開發(fā)，為緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P3/10GK101130770SQ20061003025
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月22日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 湯文文, 健 袁, 郭澤坤 申請人:復(fù)旦大學(xué)