專利名稱：核苷酸分子sr5b2及其在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗糖尿病藥物中 的應(yīng)用。背*技術(shù)糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床 綜合征。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標志， 久病可引起多個系統(tǒng)損害。病情嚴懲或應(yīng)激時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。糖尿病主要臨床類型胰島素依賴型糖尿病(IDDM， I型)可發(fā)生在任何年 齡，但多發(fā)生于青幼年。臨床特點是起病急，多食、多尿、多飲、體重減輕等癥 狀較明顯，有發(fā)生酮癥酸中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。起病初期 血中胰島細胞自身抗體陽性率高。口服葡萄糖胰島釋放試驗可見基礎(chǔ)胰島素水平 低于正常，葡萄糖刺激后胰島素分泌曲線低平，顯示胰島素缺乏。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM， II型)也可發(fā)生在任何年齡，但多見于 40歲以后中、老年。大多數(shù)病人起病緩慢，臨床癥狀相對較輕或缺如。無酮癥酸 中毒傾向，但在一定誘因作用下，也可發(fā)生酮癥酸中毒或髙滲性昏迷。依賴胰島 素，但在飲食和口服降糖藥治療效果欠佳時，或因并發(fā)癥和伴發(fā)病的存在，有時 亦需要用胰島素控制高血糖。然而，到目前為止，尚未有人報道用于抗糖尿病的基因藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗糖尿病藥物的核苷酸。
本發(fā)明的另 一個目的是提供上述核苷酸的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種分離出的核苷酸分子，它的序列包括UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 。稱為SR5B2。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子SR5B2"指具有抑制BRSK2蛋白話性或 者增加胰島素分泌量，并且含有與UUUCUGAAUGUGCUCUAGC序列高度同源 的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的同源性至少 70%，較佳地至少80%，更佳地至少卯％的核苷酸序列。該術(shù)語還包括UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的核苷酸序列變異形式。這 些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地 1-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和域3'端添加數(shù)個(通常為10 個以內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 前(5 '端)加入若干dT后形成的序列。本發(fā)明中的一個實施例中，所用的核苷酸分子序列包括dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有上述的核苷酸分子SR5B2。 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域巳知的各種載體，如市售的載體。比如，選用 市售的載體，然后將含有本發(fā)明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成重組載 體。如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些 部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作 為前體表達并參與多肽的分泌,那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連 于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如 果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序 列。 一般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于本發(fā)明的核酸分子則意味著 相鄰且不影響功能。本發(fā)明還提供了上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿 主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、 COS、 NIT細胞等。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SR5B2的制備方法，即按 UUUCUGAAUGUGCUCUAGC的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的 核苷酸分子SR5B2序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SR5B2在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。用siRNA的方法將含有本發(fā)明SR5B2核苷酸序列的dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT轉(zhuǎn)染入小 鼠的胰島P細胞(NIT)中，放射性免疫學(xué)方法檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)上清中 胰島素的含量增加。進一歩研究表明，上述siRNA干擾實驗中，原理是干擾了小鼠的胰島卩細 胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2的表達，才導(dǎo)致細胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。從Northern的結(jié)果可見，BRSK2主要在腦和胰腺中表達，尤其以胰腺中的. 表達量為最高。Western的結(jié)果與前面Northern的結(jié)果一致，BRSK2在小鼠中也 主要在腦和胰腺表達。從免疫組化的結(jié)果中可見，BRSK2主要在胰腺組織的胰 島中表達。神經(jīng)元分化相關(guān)基因BRSK2 (NCBI中核苷酸的序列號為AF533880，核苷 酸的序列號為AAP97727)在胰腺中有很髙的表達量，甚至超過在腦中的表達量。 進一步的免疫組化結(jié)果顯示，BRSK2主要在胰腺的胰島中高表達。將BRSK2在 小鼠的胰島P細胞(NIT)中過量表達，放射性免疫學(xué)方法檢測細胞培養(yǎng)上清中 胰島素的含量，結(jié)果顯示，胰島素分泌減少另一方面用siRNA的方法干擾小 鼠的胰島P細胞(MT)中內(nèi)源BRSK2的表達活性，同樣的放射性免疫學(xué)方法檢 測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2及其類似物，當在治療上進行施用(給藥)時， 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受
的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可 隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通 過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或 局部給藥。以本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2為例，可以將其與合適的藥^:上可接受的載 體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形 劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及 其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2可以被制 成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進 行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組 合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療 有效量,例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明的BRSK2 還可與其他治療劑一起使用。當本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽 施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大 多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l 毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這 些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的抗糖尿病藥物是由含有效治療量的核苷酸分子SR5B2和 藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片 劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發(fā)明中，所述藥物是針劑或者片劑。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床 綜合征。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以髙血糖為主要標志， 久病可引起多個系統(tǒng)損害。病情嚴懲或應(yīng)激時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2加入小鼠的胰島p細胞(NIT)中，細胞培養(yǎng)上
清中胰島素的含量增加。因此認為，本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2有促進小鼠的胰 島卩細胞(NIT)中胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物或者進行開發(fā), 為緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。


圖l為BRSK2過量表達對胰島素分泌的影響圖。該圖中，從左到右的柱狀 圖依次為胰島素測定濃度、細胞數(shù)和相對胰島素分泌值對空白對照與加入BRSK2 后對細胞的影響。從相對胰島素分泌值圖和最右側(cè)的western圖可見，BRSK2過 量表達將導(dǎo)致胰島素分泌降低。圖2為BRSK2被內(nèi)源千擾后對胰島素分泌的影響圖。該圖中，從左到右的 柱狀圖依次為胰島素測定濃度、細胞數(shù)和相對胰島素分泌值對空白對照與加入 siRNA (l"l、 3iU、 5ul)后對細胞的影響。從相對胰島素分泌值圖和最右側(cè)的 western圖可見，BRSK2被內(nèi)源干擾后將導(dǎo)致胰島素分泌升高。
具體實施方式
實施例1 siRNA干擾內(nèi)源BRSK2表達以后對胰島素分泌的影響(1) 將NTT細胞以lxl()S個/孔的密度接種在24孔板上，將細胞放入C02培 養(yǎng)箱中37X:培養(yǎng)18-24小時，使細胞豐度達到70-80%。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Nonsilence 5jil ( siRNA 干擾的陰性對照)，siRNA ( dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC和GCUAGAGCACAUUCAGAAAdTdT) -5 lfil、 3pl和5nl (每pl的濃度為20MM)。每種轉(zhuǎn)染重復(fù)4個孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時，換成完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+15。/。胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM)，培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢測試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測定值批內(nèi)CV<4.2%,批間CV〈.6。/。。(6) 培養(yǎng)板上的細胞胰酶消化后用細胞計數(shù)板計數(shù)。(7) 收集計數(shù)后的細胞做Western blot檢測內(nèi)源BRSK2的表達。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，用siRNA的方法干擾小鼠的胰島p細胞(NIT)中內(nèi)源BRSK2， 同樣的放射性免疫學(xué)方法檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。實施例2 BRSK2過量表達對胰島素分泌的影響(1) 將NIT細胞以lxl()5個/孔的密度接種在24孔板上，將細胞放入C02培 養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)18-24小時，使細胞豐度達到70-80%。(2) 用Invi加gen lipofectamine 2000真核轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染 Pcmv-Myc空載體和Pcmv-Myc-BRSK2兩種質(zhì)粒，每種質(zhì)粒按照200ng/孔的濃 度各轉(zhuǎn)染4個孔。(3) 轉(zhuǎn)染后16小時，換成完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+15。/。胎牛血清) 繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(4) 重新更換完全培養(yǎng)基(糖濃度為25mM)，培養(yǎng)20分鐘后收集培養(yǎng)上清液。(5) 采用放射免疫分析法測定培養(yǎng)上清中胰島素的濃度，檢澳J試劑盒由上海 市生物制品研究所提供，測定值批內(nèi)CV<4.2%,批間CV〈.60/。。(6) 培養(yǎng)板上的細胞胰酶消化后用細胞計數(shù)板計數(shù)。(7) 收集計數(shù)后的細胞做Western blot檢測BRSK2-Myc的表達。(8) 處理分析數(shù)據(jù)。過量表達的結(jié)果顯示，小鼠胰島Beta細胞NTT中過量表達BRSK2以后， 胰島素相對分泌量減少。
權(quán)利要求
1.一種分離出的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括UUUCUGAAUGUGCUCUAGC。
2. —種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括dTdT UUUCUGAAUGUGCUCUAGC 。
3. -種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子。
4. —種含有權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子的宿主細胞。
5. —種如權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子的制備方法，其特征在于， 按權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子的序列,將各核糖核酸基團依次脫水縮合。
6. 如權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是所述的抗糖尿病藥物是由含有效治 療量的權(quán)利要求1或者2所述的核苷酸分子和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥 物組合物。
8. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是，所述藥物是針劑或者片劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征。臨床以高血糖為主要標志，久病可引起多個系統(tǒng)損害。本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2加入胰島B細胞中，細胞培養(yǎng)上清中胰島素的含量增加。因此認為，本發(fā)明的核苷酸分子SR5B2有促進胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物進行開發(fā)，為緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P3/00GK101130773SQ20061003026
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月22日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 湯文文, 健 袁, 郭澤坤 申請人:復(fù)旦大學(xué)