專利名稱：一類具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域tat－ptd的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與一類抗氧化作用的蛋白分別形成的融合蛋白，以及該類融合蛋白在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療(gene therapy)是二十世紀(jì)八十年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，它主要是向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的。
傳統(tǒng)的基因治療是將目的基因?qū)氲郊?xì)胞當(dāng)中，并使其表達(dá)，但是這一技術(shù)存在著諸多缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用。首先是轉(zhuǎn)染效率較低，或轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)水平不足，其次是常用的病毒載體存在著安全性的問題。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年發(fā)展起來的一種將外源蛋白導(dǎo)入細(xì)胞的方法。將某些特殊的多肽與靶物質(zhì)共價(jià)相連后，這些多肽會連同靶物質(zhì)一起，進(jìn)入臨近細(xì)胞。這種由多肽攜帶靶物質(zhì)跨過細(xì)胞膜的阻擋，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過程稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)(protein transduction)。這些能攜帶外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的多肽成稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)。
在正常情況下，蛋白質(zhì)由于分子量較大，是不能透過細(xì)胞膜阻擋，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞核中的，但是將富含賴氨酸、精氨酸的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽與共價(jià)的所需要的目的基因產(chǎn)物相連后，這些目的基因產(chǎn)物就會被帶到細(xì)胞中，發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功能。目前利用該方法已經(jīng)高效地將EGFP、β-半乳糖苷酶、Caspase-3、insulin等等多種多肽帶到細(xì)胞中。目前最常用的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域共價(jià)偶連方法是將目的基因與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基因相融合，最后產(chǎn)生賦予了新的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的目的蛋白。
蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)高效、快速，并且不受目的基因產(chǎn)物大小限制，因而有望成為一種新的基因治療手段，目前正成為研究熱點(diǎn)。
超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血紅素加氧酶(HO-1)、過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)等都是人體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除自由基，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。然而當(dāng)人體受到氧化損傷時(shí)外源補(bǔ)給的這些抗氧化酶并不能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞，這大大降低了這些酶的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(TAT-PTD)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力來彌補(bǔ)超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血紅素加氧酶(HO-1)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)不能進(jìn)入跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗氧化作用的不足，將人免疫缺陷病毒TAT基因38-46氨基酸編碼序列分別與人SOD-1、HO-1、CAT和PHGPx基因融合，使得這些基因的最終表達(dá)產(chǎn)物具有新的功能—能夠進(jìn)入細(xì)胞中，產(chǎn)生抗氧化作用。
本發(fā)明的融合蛋白具有R1-R2或R1-L-R2通式，其中R1為人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(TAT-PTD)，具有SEQ.ID.NO1的氨基酸殘基序列其中R2為人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD-1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)中的一種，其中超氧化物歧化酶(SOD-1)具有SEQ.ID.NO2的氨基酸殘基序列，人血紅素加氧酶(HO-1)具有SEQ.ID.NO3的氨基酸殘基序列，過氧化氫酶(CAT)具有SEQ.ID.NO4的氨基酸殘基序列，谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)具有SEQ.ID.NO5的氨基酸殘基序列；L為連接子，其序列選自下列氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)甘氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸的氨基酸，或者選自下列各組合中的一種(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly；(f)gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；或者(a)～(h)組中的任意幾個(gè)的組合。
本發(fā)明的融合蛋白通過下述方式獲得1、分別擴(kuò)增人超氧化物歧化酶(SOD-1)、血紅素加氧酶(HO-1)、過氧化氫酶(CAT)或谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)基因根據(jù)已知的SOD-1、CAT、HO-1及PHGPx基因的mRNA序列，設(shè)汁引物，用RT-PCR擴(kuò)增出這四種基因的cDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后連接到表達(dá)載體中(比如Novagen公司的pET系列載體)，分別構(gòu)建成為pET-SOD-1、pET-HO-1、pET-CAT和pET-PHGPx，上述載體經(jīng)酶切及測序檢測，序列正確。
2、構(gòu)建融合蛋白基因TAT-PTD的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分別合成兩條鏈引物，5’-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3’(SEQ ID NO6)，以及5’-TCGAGTCTTCGTCGCTG TCTCCGCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO7)。引物退火后分別連接到酶切后的pET-SOD-1、pET-HO-1、pET-CAT和pET-PHGPx載體中，構(gòu)建成為pTAT-SOD-1、pTAT-HO-1、pTAT-CAT以及pTAT-PHGPx，上述載體經(jīng)酶切及測序檢測，序列正確。
3、融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)用構(gòu)建的載體pTAT-SOD-1、pTAT-HO-1、pTAT-CAT以及pTAT-PHGPx分別轉(zhuǎn)化帶有DE3的大腸桿菌。菌液生長至OD600＝0.5時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)。SDS-PAGE電泳分析證實(shí)，上述融合基因在大腸桿菌(DE3)中獲得高效表達(dá)。
4、融合蛋白純化上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌液經(jīng)過超聲破碎后，4℃下12000rpm離心30分鐘，表達(dá)產(chǎn)物存在于上清液中，經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得純化后的融合蛋白，其純度大于90％。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供以本發(fā)明的一類融合蛋白中一種或多種混合為活性成分的抗氧化藥物。在需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的融合蛋白可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明巧妙地利用低分子量的TAT-PTD多肽與人源的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等等形成融合蛋白，克服了過去這些大分子的酶不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的缺點(diǎn)，賦予了它們新的功能，使得他們可以進(jìn)入跨過細(xì)胞膜的阻擋，到細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化作用細(xì)胞，提高細(xì)胞自身抗氧化能力。本發(fā)明的融合蛋白具有很高的應(yīng)用價(jià)值，可以作為一種高效的抗氧化藥物。


圖1為構(gòu)建pTAT-SOD-1載體示意圖。
圖2為純化后的TAT-SOD-1融合蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果。
圖3為純化后的TAT-SOD-1融合蛋白用SOD-1抗體進(jìn)行免疫印記的結(jié)果。
圖4為不同濃度的TAT-SOD-1融合蛋白對Hela細(xì)胞的抗氧化作用曲線。
圖5為不同濃度的TAT-SOD-1融合蛋白對角朊細(xì)胞的抗氧化作用曲線。
圖6為不同濃度的TAT-CAT融合蛋白對Hela細(xì)胞的抗氧化作用曲線。
圖7為不同濃度的TAT-CAT與TAT-SOD-1對角朊細(xì)胞的聯(lián)合抗氧化作用曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1 HIV-TAT-SOD-1融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)1、構(gòu)建重組TAT-SOD-1融合蛋白基因
1)用RT-pCR擴(kuò)增SOD-1基因采用TRIzol抽提肝臟的總RNA，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，P15’-CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG-3’(SEQ ID NO8)，以及P25’-GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC-3’(如SEQ ID NO9)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在50微升體系中進(jìn)行，條件為94℃變性5min，94℃30s，54℃lmin，72℃Imim，30個(gè)循環(huán)，72℃5mim。反應(yīng)完成后，全部PCR反應(yīng)液加入1％瓊脂糖中電泳，割膠回收500bp條帶(回收反應(yīng)采用賽百盛公司回收試劑盒)?；厥债a(chǎn)物連接到TA克隆載體中，用Xho I與BamHI酶切后，連入pET-15b載體中，構(gòu)建成為pET-15b-SOD-1，插入序列經(jīng)測序鑒定，序列正確(測序采取雙脫氧法，ABI 3730DNA測序儀，測序引物T7promoter primer，上海博亞公司協(xié)助完成)。TAT-PTD的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分別合成兩條鏈引物，5’-TAGGAAGAAGCGGAGA CAGCGACGAAGAC-3’(SEQ ID NO6)，以及5’-TCGAGTC-TTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3’(SEQID NO8)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物分別溶于100μl純水，各取20μl，加入40μl 1mol/LNaCl和20μl石蠟油，置于沸水中煮5min后讓其緩慢冷卻，自動(dòng)退火。將退火產(chǎn)物連接到用Nde和XHO-1消化的pET-15b-SOD-1中，構(gòu)建成為pTAT-SOD-1，該載體經(jīng)酶切及測序檢測，序列正確(見圖1所示)。
2、融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)用構(gòu)建的載體pTAT-SOD-1與pET-15b-SOD-1(前者作為試驗(yàn)，后者作為對照)分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。菌液生長至OD600＝0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度為1mmol/L)37℃誘導(dǎo)2小時(shí)。
3、融合蛋白純化上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌液中加入溶菌酶處理一小時(shí)，經(jīng)過超聲破碎后，4℃以12000rpm離心30分鐘，表達(dá)產(chǎn)物存在于上清液中。取離心后上清至10ml Eppendorf管中，加入Ni-NTA(Novagen公司)，4℃，50rpm震蕩2h。將上述混合物轉(zhuǎn)移至層析柱中，待液體快流盡時(shí)加入4ml Wash Buffer(含有PBS及0.1M的咪唑)，洗滌層析柱。待液體快流盡時(shí)加入300μL洗脫液，(含有PBS及0.4M的咪唑)收集流出的液體。純化后液體經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，分子量大小約為25KD，與計(jì)算值相符，獲得融合蛋白純度大于90％。用SOD-1抗體進(jìn)行免疫印記，同樣可以證實(shí)上述結(jié)果(圖2、圖3所示)。
4、融合蛋白進(jìn)胞作用檢測體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入0.5-2μl純化的TAT-SOD-1融合蛋白，輕柔混勻，一小時(shí)后用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，收集1×106細(xì)胞，用SOD-1抗體進(jìn)行免疫印記。結(jié)果顯示隨著加入的融合蛋白濃度增加，細(xì)胞內(nèi)SOD-1濃度隨之增加；而在用SOD-1處理過的細(xì)胞中沒有雜交條帶。
實(shí)施例2TAT-SOD-1融合蛋白在Hela細(xì)胞中抗氧化作用檢測在體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入0.1-2μl純化后的TAT-SOD-1蛋白，對照組加入0.1-2μl純化后的SOD-1蛋白，兩小時(shí)后更換培養(yǎng)基。加入終濃度為5mM甲基紫精(Paraquat)，以產(chǎn)生超氧化物陰離子。12小時(shí)后用比色法測量細(xì)胞存活率。比色法采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip-henyltetrazolium bromide，Sigma)進(jìn)行測定.結(jié)果表明加入TAT-SOD-1蛋白的試驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯增高，證實(shí)TAT-SOD-1融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞并具有明顯抗氧化能力(圖4所示)。
實(shí)施例3TAT-SOD-1融合蛋白在角朊細(xì)胞中抗氧化作用檢測在原代培養(yǎng)的小鼠皮膚角朊細(xì)胞培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入0.5-2μl純化后的TAT-SOD-1蛋白，對照組加入0.5-2μl純化后的SOD-1蛋白，兩小時(shí)后用胰酶和EDTA混合液消化細(xì)胞，離心去上清液，加入磷酸緩沖液動(dòng)融，置于漩渦混勻器上劇烈混勻，再次離心，上清為SOD-1提取液。在二甲亞砜中加入NaOH，在有氧條件下可產(chǎn)生氧自由基，此時(shí)加入化學(xué)發(fā)光劑魯米諾，會發(fā)出冷化學(xué)光。再取0.1mlSOD-1提取液加入發(fā)光溶液中，計(jì)算發(fā)光抑制率。抑制率越高，說明SOD-1濃度越高。結(jié)果顯示試驗(yàn)組的SOD-1濃度顯著高于對照組，說明含有轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的SOD-1融合蛋白進(jìn)入了角朊細(xì)胞中(見圖5所示)。
實(shí)施例4TAT-CAT融合蛋白在Hela細(xì)胞中抗氧化作用檢測采用實(shí)施例1的構(gòu)建載體表達(dá)融合蛋白的方法，分別表達(dá)、純化TAT-CAT與CAT。在體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入0.1-2μl純化后的TAT-CAT蛋白，對照組加入0.1-2μl純化后的CAT蛋白，2小時(shí)后加入0.5mM的H2O2，以產(chǎn)生氧自由基。12小時(shí)后，用前述的MTT比色法測量細(xì)胞存活率。結(jié)果表明加入TAT-SOD-1蛋白的試驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯增高，證實(shí)TAT-SOD-1融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞并具有明顯增高的抗氧化能力(見圖6所示)。
實(shí)施例5TAT-CAT與TAT-SOD-1聯(lián)合抗氧化作用檢測在體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入0.1-4μl純化后的TAT-SOD-1與TAT-CAT融合蛋白混合物(1∶1)，對照組加入0.1-4μl純化后的CAT與SOD-1蛋白混合物(1∶1)蛋白。2小時(shí)后加入0.5mM的H2O2，或5mM甲基紫精(Paraquat)以產(chǎn)生氧自由基。12小時(shí)后，用前述的MTT比色法測量細(xì)胞存活率。結(jié)果表明加入TAT-CAT與TAT-SOD-1蛋白混合物的試驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯高于對照組增高，證實(shí)TAT-SOD-1與TAT-CAT融合蛋白混合物有更強(qiáng)抗氧化能力(見圖7所示)。
序列表(1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO1GRKKRRQRR(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度153個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO2ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ(3)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度288個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO3MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYIIIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQHYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTRSQAPLLRWVLTLSFLVATVAVGLYAM(4)SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征(A)長度228個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO4TKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL(5)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度197個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO5MSLGRLCRLLKPALLCGALAAPGLAGTMCASRDDWRCARSMHEFSAKDIDGHMVNLDKYRGFVCIVTNVASQXGKTEVNYTQLVDLHARYAECGLRILAFPCNQFGKQEPGSNEEIKEFAAGYNVKFDMFSKICVNGDDAHPLWKWMKIQPKGKGILGNAIKWNFTKFLIDKNGCVVKRYGPMEEPLVIEKDLPHYF(6)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)核苷酸(B)類型核酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO6TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC(7)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)核苷酸
(B)類型核酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO7TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC(8)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)核苷酸(B)類型核酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO8CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(9)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)核苷酸(B)類型核酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO9GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于具有R1-R2或R1-L-R2通式，其中R1為人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；R2為人Cu/Zn超氧化物歧化酶、血紅素加氧酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶中的一種；L為連接子。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1的融合蛋白，其特征在于R1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1的融合蛋白，其特征在于所述超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示，人血紅素加氧酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO3所示，過氧化氫酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO4所示，谷胱甘肽過氧化物酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO5所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述連接子序列采用下列氨基酸中一個(gè)或多個(gè)甘氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸的氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述連接子選自下述之一種(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly；(f)gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；或者(a)～(h)中的任意幾個(gè)組合。
6.一種抗氧化藥物，其特征在于以權(quán)利要求1-5之一所述融合蛋白中一種或多種混合物作為活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗氧化藥物，其特征在于含有一種或多種醫(yī)學(xué)上可以接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽(TAT－PTD)分別與四種抗氧化酶人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD－1)、血紅素加氧酶－1(HO－1)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)融合形成的融合蛋白。該類融合蛋白能跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，并發(fā)揮很好的抗氧化作用。以本發(fā)明該類融合蛋白中一種或多種為活性成分的抗氧化藥物都對人體細(xì)胞有明顯的抗氧化保護(hù)作用。
文檔編號A61K38/16GK1908016SQ20061003035
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月24日
發(fā)明者盧大儒, 張舒羽 申請人:復(fù)旦大學(xué)