專利名稱：一種凝乳酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種凝乳酶(Chymosin)的制備方法，特別是，公開了一種凝乳酶及其電滲析與離子交換層析相結合的制備方法。
背景技術：
凝乳酶Chymosin，；一般也稱rennet，因為容易與血管緊張肽原酶(rennin)混淆，國際酶學委員會推薦使用此名，即Chymosin，亦稱rennet。Chymosin是一種蛋白酶，EC3.4.23.4。存在于幼齡的反芻動物的胃液中，很類似胃蛋白酶，但凝乳作用(即酪蛋白→衍酪蛋白的轉變作用)遠比胃蛋白酶強。分解血紅蛋白的最適pH約3.5。隨著動物的生長，胃中的凝乳酶減少，為胃蛋白酶所取代。在胃中是以凝乳酶原(proChymosin)(從牛的第四胃純化的樣品，分子量約3萬6千，氨基末端殘基為丙氨酸)形態(tài)被分泌的，在酸性條件下由于本身的催化作用從氨基末端切去肽鏈，變成活性的凝乳酶(分子量約3萬1千，氨基末端殘基為甘氨酸)。其具體作用有酪蛋白→衍酪蛋白的轉變作用。凝乳酶還適用于各類慢性胃炎，胃下垂、胃大部切除后所至的上腹部不適、食欲不振等，亦可用于嬰兒消化不良和腹瀉。
工業(yè)上制備凝乳酶的有三種來源從小牛胃提取，植物提取，微生物發(fā)酵產生。從小牛胃提取是最傳統(tǒng)的途徑，但是從70年代始因為小牛胃來源問題，該方法已經不能滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產。植物提取和微生物發(fā)酵是逐步發(fā)展起來的替代方法，但是這些途徑產生的酶在使用時會產生異味，往往需要再添加其它酶以改善產品味道。
本發(fā)明產品采用小牛血清工業(yè)副產品小牛胃為原料，利用電滲及離子交換等工藝，成功制備了效價高，純度高的凝乳酶。該方法可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化制備凝乳酶。同時，原料采集滿足了清真要求，因而該產品可廣泛應用于清真乳制品工業(yè)，擴大了產品使用的范圍。
本發(fā)明在資料分析和發(fā)明者以往豐富的工作經驗的基礎上，廣泛的研究了各種制造凝乳酶的工藝，結合電滲析與離子交換層析等新技術，現(xiàn)采用“活化、電滲析、裝柱、洗提、分段收集、凍干”的產品工藝。該工藝路線優(yōu)點是操作方便、產品活力高。凝乳酶和雜蛋白分子的三維結構很相似，而且它們的活性部位絲氨酸附近的幾個氨基酸順序也是完全一樣的。由于這些酶分子在結構上及其他很多性質上的相似之處，使得傳統(tǒng)的一些分離、純化技術難以達到十分滿意的效果，制劑中往往混雜有彼此的組分而難以除凈。只是在采用了電滲析與離子交換層析技術以后，才大大提高了分離純化的效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了一種凝乳酶。在工藝技術上，克服了傳統(tǒng)技術對凝乳酶的分離、純化效果差、成品活力低的困難。本發(fā)明通過常規(guī)原料，采用電滲析與離子交換層析相結合的方法，分離出具有較高生物活性的凝乳酶。并且采用電滲析與離子交換層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
——本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明公開了一種凝乳酶，體外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更強，凝乳速度塊，不影響乳制品風味。本發(fā)明在原料選擇上，不采用非清真原料，而是采用清真小牛胃粘膜為主要原料，擴大了產品的使用范圍；并且采用電滲析與離子交換層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
本發(fā)明公開的一種凝乳酶的制備方法，依次包括如下步驟1取新鮮的小牛胃粘膜，加適量鹽酸調節(jié)PH，活化后過濾，得活化濾液。
2這些提取物在緩沖液A中進行電滲析。
3取滲析出來的小牛胃膜，用于以下的分離實驗。
4陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)懸浮于緩沖液A，然后填充一根10cm柱，用40mL緩沖液A平衡離子交換柱，然后加入上述小牛胃膜滲析液。
5用緩沖液B洗提出有效成分。以2mL為一個片斷收集洗脫液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片斷，凍干即得成品凝乳酶。
本發(fā)明以清真的牛胃粘膜臟為主要原料，在深入的資料分析和發(fā)明者以往豐富工作經驗的基礎上，結合電滲析與離子交換層析等新技術，現(xiàn)采用活化、電滲析、裝柱、洗提、分段收集、凍干的工藝。該工藝路線優(yōu)點是操作方便、產品活力高。
工藝路線牛胃粘膜臟→加酸活化→電滲析→準備樹脂→裝柱→交換柱預洗→加樣→洗提→分段收集→凍干→凝乳酶精品(二)工藝過程(按以下次序進行)1取新鮮的小牛胃粘膜，加適量鹽酸調節(jié)到PH2.0，活化后過濾，得PH2.0的活化濾液。
2這些提取物在緩沖液A中進行電滲析，條件如下20mmol/L檸檬酸和0.1％(w/v)安息香酸鈉，pH 2.45～2.55，傳導率2.3mS/cm。
3取滲析出來的小牛胃膜，濃度大約22CHU/mL，PH2.4～2.5、傳導率4.3mS/cm，用于以下的分離實驗。
4陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)懸浮于緩沖液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL緩沖液A平衡離子交換柱，然后加入上述小牛胃膜滲析液。
5用緩沖液B洗提出有效成分；緩沖液B成分10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸鹽，pH 5.9，傳導率114mS/cm。以2mL為一個片斷收集洗脫液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片斷，凍干即得成品凝乳酶。
6成品取樣進行全項檢測。
干酪是高附加值奶制品，且有極高的營養(yǎng)價值。制造干酪需要大量的凝乳酶。以清真原料提取的凝乳酶，制造方便、無殘留毒素、產品活力高，適用范圍更廣。
實際例1取新鮮的小牛胃粘膜100g，加適量鹽酸調節(jié)到PH2.0，活化后過濾，得PH2.0的活化濾液。
2這些提取物在緩沖液A中進行電滲析，條件如下20mmol/L檸檬酸加0.1％(w/v)安息香酸鈉，pH 2.45～2.55，傳導率2.3mS/cm。
3取50mL滲析出來的小牛胃膜，濃度大約22CHU/mL，PH2.4～2.5、傳導率4.3mS/cm，用于以下的分離實驗。
42.5g的陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)懸浮于25mL緩沖液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL緩沖液A平衡離子交換柱，然后加入50mL上述小牛胃膜滲析液。
5用緩沖液B洗提出有效成分；緩沖液B成分10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸鹽，pH5.9，傳導率114mS/cm。以2mL為一片斷收集洗脫液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片斷，凍干即得成品凝乳酶。(成品檢測體外凝乳活力＝9680U/g)結果總結于下片斷Ch，CHU/mL BpA，CHU/mL4 ＜0.5 1.57 ＜0.5 1.510 ＜0.5 1.313 ＜0.5 1.116 ＜0.5 1.419 ＜0.5 1.522 ＜0.525 ＜0.5 1.528 ＜0.5 1.430 ＜0.5 0.131 0.1632 170 0.4上述結果表明，所選擇的色普分離系統(tǒng)對于分離凝乳酶牛胃蛋白酶是有效的。
實際例2.
1取新鮮的小牛胃粘膜800g，加適量鹽酸調節(jié)到PH2.0，活化后過濾，得PH2.0的活化濾液。
2這些提取物在緩沖液A中進行電滲析，條件如下160mmol/L檸檬酸加0.1％(w/v)安息香酸鈉，pH 2.45～2.55，傳導率2.3mS/cm。
3取400mL滲析出來的小牛胃膜，濃度大約22CHU/mL，約PH2.45、傳導率4.3mS/cm，用于以下的分離實驗。
420g的陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)懸浮于200mL緩沖液A，然后填充一根200cm柱(FPLC.TM.)，用800mL緩沖液A平衡離子交換柱，然后加入1000mL上述小牛胃膜滲析液。
5用緩沖液B洗提出有效成分；緩沖液B成分10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸鹽，pH5.9，傳導率114mS/cm。以2mL為一片斷收集洗脫液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片斷，凍干即得成品凝乳酶。(成品檢測體外凝乳活力＝9160U/g)結果總結于下片斷 Ch，CHU/mL BpA，CHU/mL
4 ＜0.5 1.57 ＜0.5 1.510 ＜0.5 1.313 ＜0.5 1.116 ＜0.5 1.419 ＜0.5 1.522 ＜0.5 1.525 ＜0.5 1.528 ＜0.5 1.430 ＜0.5 1.533 ＜0.5 1.536 ＜0.5 1.439 ＜0.5 1.542 ＜0.5 1.445 ＜0.5 1.548 ＜0.5 1.451 ＜0.5 1.554 ＜0.5 1.457 ＜0.5 1.560 ＜0.5 1.463 ＜0.5 1.566 ＜0.5 1.469 ＜0.5 1.372 ＜0.5 0.174 0.1575 170 0.4上述結果表明，所選擇的色普分離系統(tǒng)對于分離凝乳酶牛胃蛋白酶是有效的。
權利要求
1.一種凝乳酶，其特征在于體外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更強，凝乳速度塊，不影響乳制品風味；用于治療各類慢性胃炎、胃下垂、食欲不振和嬰兒消化不良和腹瀉，有更好的療效。
2.本發(fā)明還公開了一種凝乳酶酶的透析與親和層析相結合的制備方法，依次包括如下步驟1取新鮮的小牛胃粘膜，加適量鹽酸調節(jié)到PH2.0，活化后過濾，得PH2.0的活化濾液。2這些提取物在緩沖液A中進行電滲析，條件如下20mmol/L檸檬酸和0.1％(w/v)安息香酸鈉，pH2.45～2.55，傳導率2.3mS/cm。3取滲析出來的小牛胃膜，濃度大約22CHU/mL，PH2.4～2.5、傳導率4.3mS/cm，用于以下的分離實驗。4陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)懸浮于緩沖液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL緩沖液A平衡離子交換柱，然后加入上述小牛胃膜滲析液。5用緩沖液B洗提出有效成分；緩沖液B成分10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸鹽，pH5.9，傳導率114mS/cm。以2mL為一個片斷收集洗脫液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片斷，凍干即得成品凝乳酶。6成品取樣進行全項檢測。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，選用清真宰牲場的小牛胃膜為主要原料，適應了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應食品原料的渠道。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中采用檸檬酸和安息香酸鈉作為電滲析介質，取得了較好的分離效果。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4中采用陽離子交換樹脂(HZ-202強酸性)，既能很好的保護凝乳酶酶的活性，又達到了理想的分離效果。
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟5中采用緩沖液B作為洗提溶劑，能夠比較完全的洗脫凝乳酶，延長樹脂的使用壽命。
7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所得凝乳酶酶為無菌，體外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更強，凝乳速度塊，不影響乳制品風味。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凝乳酶，體外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更強，凝乳速度塊，不影響乳制品風味；用于治療各類慢性胃炎、胃下垂、食欲不振和嬰兒消化不良和腹瀉，有更好的療效。本發(fā)明在原料選擇上，不采用非清真原料，而是采用清真小牛胃粘膜為主要原料，擴大了產品的使用范圍；并且采用電滲析與親和層析純化技術，操作簡單、無殘留毒素、產品活力高。
文檔編號A61K38/43GK1924012SQ20061003075
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月1日 優(yōu)先權日2006年9月1日
發(fā)明者蘇翰, 蘇有錄, 唐甜, 周鈺 申請人:上海阿敏生物技術有限公司