專利名稱：香豆素類化合物在制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香豆素類化合物在制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞作為主要干細(xì)胞的一種，是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn)證明，成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在神經(jīng)干細(xì)胞，在成年哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)能終生產(chǎn)生神經(jīng)元而且增殖活躍的2個(gè)區(qū)域是前腦室下帶和海馬齒狀回的亞顆粒。
由于神經(jīng)干細(xì)胞具有終生自我更新能力，可以保持?jǐn)?shù)量上的恒定，體外培養(yǎng)時(shí)不需要飼養(yǎng)細(xì)胞層，僅僅依靠懸浮培養(yǎng)即可大量擴(kuò)增，而且純度極高；并且擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞在接觸培養(yǎng)時(shí)即迅速分化為三種成熟的神經(jīng)組織細(xì)胞即神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞。在體移植的神經(jīng)干細(xì)胞具有遷移、分化的能力，多分化潛能能誘導(dǎo)分化為神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞，種屬特異性低，基本無致瘤性危險(xiǎn)。這些特點(diǎn)就為不同疾病移植治療提供了可能。
神經(jīng)干細(xì)胞在移植部位分裂增殖，并在局部微環(huán)境的作用下分化成相應(yīng)的細(xì)胞來補(bǔ)充替代受損的細(xì)胞，恢復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能，移植后產(chǎn)生的細(xì)胞也可以自主釋放神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺、乙酰膽堿或C2氨基丁酸)，產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)保護(hù)因子，從而抑制神經(jīng)變性或者促進(jìn)神經(jīng)再生。通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向特定神經(jīng)元分化，替代治療因神經(jīng)退變引起神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
但是由于移植部位環(huán)境的影響，在成年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)非神經(jīng)元生發(fā)區(qū)(包括脊髓)移植時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞絕大部分分化為形成不利的膠質(zhì)疤痕的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而不分化為有成髓鞘功能的寡突膠質(zhì)細(xì)胞和有傳遞信息功能的神經(jīng)元。
在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，脫髓鞘疾病和脊髓損傷等在當(dāng)今仍然是不治之癥，患了此種疾病的病人唯一的歸宿就是等死，一般在1-10年內(nèi)視病程進(jìn)展快慢不同陸續(xù)死亡。一般的治療方法不能阻止病程的進(jìn)展。這種病癥最主要的病理現(xiàn)象就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包裹軸突的的成熟的成髓鞘細(xì)胞大量死亡，造成中樞神經(jīng)傳導(dǎo)障礙，自身又無法產(chǎn)生新的寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體使脫髓鞘的軸突重新成髓鞘。
現(xiàn)代細(xì)胞移植療法對脫髓鞘疾病和脊髓損傷的治療打開了一條新的通路，但是因?yàn)闊o法獲得大量的、廉價(jià)的、純化的寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，因此細(xì)胞移植療法一直停留在實(shí)驗(yàn)階段而無法用于臨床。
因此對神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化調(diào)控的研究就成為今天研究的熱點(diǎn)，迫切需要尋找到一些物質(zhì)，它們能使神經(jīng)干細(xì)胞高比例的定向分化為具有成髓鞘功能的寡突膠質(zhì)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種香豆素類化合物在制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供一組以該香豆素類化合物為活性成分的，用于治療脫髓鞘疾病和脊髓損傷的藥物組合物。
本發(fā)明提出的用于制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物的香豆素類化合物，具有下述兩種結(jié)構(gòu)通式 式中R1為氫、羥基、烷氧基、苯基、異戊烯基或1～5個(gè)單元的糖苷鍵。
式中R1為氫、羥基、烷氧基、苯基、異戊烯基或1～5個(gè)單元的糖苷鍵。
這兩類香豆素類化合物分布在植物界的許多種植物中，可以從植物中提取分離制備而得，也可以用化學(xué)合成方式獲得。
所述的香豆素類化合物，比較典型的有秦皮乙素、7-羥基香豆素、雙白瑞香素、結(jié)香素、七葉內(nèi)酯苷、東莨菪內(nèi)酯。
中藥是我國的國粹，在治病強(qiáng)身方面有著神奇的療效已被世界所承認(rèn)。有些中藥在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有著很好的優(yōu)勢，我國利用傳統(tǒng)中藥研究神經(jīng)干細(xì)胞的研究為神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究開辟了一條新的道路。最近研究發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽在體外可明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，銀杏內(nèi)酯B亦具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的作用。
但是單靠中藥治則去發(fā)現(xiàn)可以決定性地影響神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的中藥單體的可能性是微乎其微，只有依靠新藥篩選的模式大規(guī)模，高通量的檢測才有可能發(fā)現(xiàn)有效的中藥單體。做到這一點(diǎn)需要兩方面條件的支撐一是要建立快速、微量、細(xì)胞水平的體外篩選模型和測試方法。二是要有大量可供篩選的樣品資源，包括新合成的化合物和天然化合物。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新、多分化和高增值潛能，這些屬性決定了它是最適于高通量篩選的模型。
我們通過多年的基礎(chǔ)研究積累了2000多種化合物，并建立了天然產(chǎn)物庫，通過對庫中化合物進(jìn)行高通量篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了上述香豆素類化合物具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的作用。又通過確證性實(shí)驗(yàn)證明，該香豆素類化合物具有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向向寡突膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用。
本發(fā)明提出的藥物組合物含有治療有效量的香豆素類化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。其中，活性成分的重量含量為0.1-99.5％。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的藥物，用以治療脫髓鞘疾病和脊髓損傷修復(fù)。
上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑，或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑、鼻噴霧劑和注射劑。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。


圖1為(a)7-羥基香豆素、(b)雙白瑞香素和(c)DMSO誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的細(xì)胞形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1制備7-羥基香豆素和雙白瑞香素11Kg黃瑞香(Daphne giraldii Nitsche.)藥材的根皮和莖皮，粉碎后以95％乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓回收乙醇至體積為10L，過濾，濾液依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集各萃取部分并濃縮成浸膏，其中乙酸乙酯萃取部分浸膏200g，以甲醇溶解過濾后進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢查洗脫流分，具有相同單一斑點(diǎn)的流分合并，濃縮，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分2經(jīng)進(jìn)一步硅膠層析分離純化，得到白色粉末，結(jié)構(gòu)鑒定為7-羥基香豆素；其中流分5經(jīng)進(jìn)一步硅膠層析和葡聚糖凝膠層析分離純化，得到淡黃色粉末，結(jié)構(gòu)鑒定為雙白瑞香素。
7-羥基香豆素的結(jié)構(gòu)式如下 雙白瑞香素的結(jié)構(gòu)式如下 實(shí)施例2制備東莨菪內(nèi)酯5Kg毛瑞香(Daphne odora Thunb.var.atrocaulis Rehd.)藥材的根皮，粉碎后以75％乙醇滲漉提取，得到提取液50L，濃縮后依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液濃縮成浸膏。利用硅膠柱色譜、聚酰胺色譜、Sephadex LH-20和制備HPLC等手段對各萃取部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分離和鑒定。氯仿部位分離得到12個(gè)化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，其中1個(gè)淺黃色粉末為東莨菪內(nèi)酯。
東莨菪內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式如下 實(shí)施例3制備結(jié)香素5Kg結(jié)香藥材的根莖粉碎后以80％乙醇浸泡24hr，收集浸泡液，濃縮至無醇味，加適量水稀釋成流浸膏，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，收集各萃取部位，濃縮成浸膏。對各部位的浸膏進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分析，結(jié)果氯仿部位分離得到12個(gè)化合物，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定，其中1個(gè)淡黃色粉末為結(jié)香素。
結(jié)香素的結(jié)構(gòu)如下
實(shí)施例4制備秦皮乙素和七葉內(nèi)酯苷取遼寧產(chǎn)苦櫪白蠟樹的莖干皮15kg，切碎磨成粉，用乙醇40L連續(xù)加熱提取10～12h，提取液減壓濃縮，殘?jiān)盟s4L溫?zé)崛芙猓玫润w積氯仿洗滌2次。水層蒸去其中的氯仿，再用乙酸乙酯提取2次。乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，浸膏以甲醇溶解后上硅膠柱進(jìn)行層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層層析檢查洗脫流分，具有相同單一斑點(diǎn)的流分合并，濃縮，得到5個(gè)化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定其中一個(gè)為秦皮乙素，另一個(gè)為七葉內(nèi)酯苷。
秦皮乙素的結(jié)構(gòu)式如下 七葉內(nèi)酯苷的結(jié)構(gòu)式如下 實(shí)施例5制備香豆素類化合物的制劑片劑活性成分20mg乳糖177mg玉米淀粉50mg硬脂酸鎂3mg制備方法將活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，活性成分含量為20mg。
實(shí)施例6香豆素類化合物誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法1.1材料 新生1～3d的SD大鼠，第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEMF12、2％B27(Gibco，美國)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fib rob last grow thfacto r，bFGF)和表皮生長因子(epiderm al growth factor，EGF)，(Sigma，美國)；胎牛血清(杭州四季青公司)?？贵w抗巢蛋白(nestin)單抗(Chemicon，美國)，抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fib rillary acidic p ro tein，GFA P)多抗(武漢博士德生物工程公司)、寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白(NG2，Chemicon，美國)、FITC，羅丹明標(biāo)記的驢抗小鼠和兔二抗。
1.2腦組織單細(xì)胞懸液的制備取新生1-3d SD大鼠，取頭，除去頭皮及頭骨，剝離硬腦膜，分離出大腦半球，取皮層將其移至另一個(gè)含有解剖液的無菌青霉素瓶中，剪成盡量小的小塊，加入胰蛋白酶邊消化邊用經(jīng)火焰拋光的滴管吹打混勻。然后過200目尼龍篩網(wǎng)，離心，棄上清，臺盼藍(lán)染色后作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，5*105個(gè)細(xì)胞1瓶，每瓶25ml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮(DMEMF12、2％B27，20ng bFGF，20ng EGF)培養(yǎng)。
1.3神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)5-6天后可形成神經(jīng)球克隆。神經(jīng)球克隆呈懸浮狀，用經(jīng)火焰拋光的窄口吸管吹打克隆球形成單細(xì)胞懸液，將部分細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，5*105個(gè)細(xì)胞1瓶。以后每6天傳代1次，每3天換液1次，培養(yǎng)條件不變。
1.4神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化收集培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞集落，加入少量培養(yǎng)液后吹打，使細(xì)胞盡量分散，計(jì)數(shù)細(xì)胞，40～50個(gè)細(xì)胞集落/35mm培養(yǎng)皿(預(yù)先涂多聚賴氨酸)分散培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為DMEMPF12(1∶1)，0.5％胎牛血清，1×B27，1×非必需氨基酸。置37℃5％CO2，10天換液2次。
1.5化合物的添加神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入各種篩選化合物終濃度為10uM，收集培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞集落，40～50個(gè)細(xì)胞集落/35mm培養(yǎng)皿(預(yù)先涂多聚賴氨酸)，加入培養(yǎng)基，五天后光鏡下觀察，換液一次，十天后固定后免疫組化定性，GFAP陽性與NG2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)神經(jīng)干細(xì)胞在包被有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板上經(jīng)3天無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)即可自動(dòng)分化為3種細(xì)胞胞體圓，折光性強(qiáng)，突起長的神經(jīng)元；胞體扁平，折光性極差，突起較短的星形膠質(zhì)細(xì)胞；胞體較圓，折光性強(qiáng)，突起短的寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體。DMSO對照品分化出來的細(xì)胞大多成胞體扁平，折光性極差，突起較短的星形膠質(zhì)細(xì)胞；6個(gè)香豆素處理組多處現(xiàn)胞體較圓，折光性強(qiáng)，突起短的寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體。
2.2免疫表達(dá)結(jié)果DMSO對照組分化出來的細(xì)胞星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP免疫陽性的細(xì)胞占70％左右，寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白(NG2)免疫陽性的細(xì)胞約20％。6個(gè)香豆素處理組分化出來的細(xì)胞NG2免疫陽性的細(xì)胞占70％左右，星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP免疫陽性的細(xì)胞低于10％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一些香豆素類成分能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞定向分化為寡突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，對脫髓鞘疾病和脊髓損傷的修復(fù)具有較好的效果。
表1各組的NG2陽性細(xì)胞占爬出細(xì)胞總數(shù)的比例(％)
注*表示與對照組比較，P＜0.0權(quán)利要求
1.一種香豆素類化合物在制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物中的應(yīng)用，該香豆素類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式之一種 式中R1為氫、羥基、烷氧基、苯基、異戊烯基或1～5個(gè)單元的糖苷鍵； 式中R1為氫、羥基、烷氧基、苯基、異戊烯基或1～5個(gè)單元的糖苷鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的香豆素類化合物從植物中提取或化學(xué)合成得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所說的藥物為治療脫髓鞘疾病或脊髓損傷的藥物。
4.一種誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的藥物組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求1中所述的香豆素類化合物活性成分和藥學(xué)上可以接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于活性成份的重量含量為0.1-99.5％。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種香豆素類化合物在制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化藥物中的應(yīng)用。該香豆素類化合物比較典型的有如下幾種秦皮乙素、7－羥基香豆素、雙白瑞香素、結(jié)香素、七葉內(nèi)酯苷、東莨菪內(nèi)酯。試驗(yàn)表明，該香豆素類化合物具有明顯的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的作用。因此，可以用于制備誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的藥物。所制備的藥物可雙是以該香豆素類化合物為活性成分，且含有藥學(xué)上可以接受的載體的組合物，活性成分的重量含量為0.1－99.5％。藥物劑型可以是片劑、粉劑、粒劑和注射劑等。
文檔編號A61P43/00GK1923195SQ20061003091
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日
發(fā)明者何成, 張衛(wèi)東, 徐曉輝, 張薇, 蘇娟, 張川 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)