專利名稱：3，5，7，3'，4'，5'－六羥基－2，3－二氫黃酮在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮(以下簡(jiǎn)稱ZL2004)在制藥中的應(yīng)用，尤其涉及在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑、抗氧化劑和二?；视偷鞍准っ窩抑制劑藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ZL2004化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 分子式為C15H12O8，微黃色粉末或白色針狀結(jié)晶，相對(duì)分子質(zhì)量為320.2，mp 246-247℃，易溶于熱水、熱乙醇，溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水、乙酸乙酯，難溶于氯仿、石油醚。
該化合物首次由Kotake和Kubota于1940年從葡萄科蛇葡萄屬植物福建茶即楝葉玉葡萄(A.Meliaefolia)的葉中分離到，命名為福建茶素(ampeloptin)[Ann，1940，544253]，后又有命名二氫楊梅黃素(dihydromyricetin)及蛇葡萄素(ampelopsin)[The Merck Index，12ed，1996，97]。該化合物廣泛存在于松柏類植物和木材中，如松屬(pinus)和雪松屬(cedrus)樹皮中，也存在于木本被子植物，如杜娟花科植物砂杜娟(Rhodendroncinnabariunm)葉、連香樹科植物連香樹(Cercidiphyllumjaponicus)木材中。該植物存在于楊梅科、杜娟科、藤黃科、大戟科等植物中，具抗癌、利膽和抗炎作用。從目前研究情況表明，該化合物大量存在于葡萄科植物中，如顯齒蛇葡萄(Agrossedentata)、粵蛇葡萄(Cantoniensis)、羽葉蛇葡萄(Achaffanjoni)、蛇葡萄(Asinica)、東北蛇葡萄(Abrevipedunculate)、光葉蛇葡萄(Asinicavarhancei)等，尤其是在蛇葡萄屬植物中更是大量存在，如廣泛分布于我國(guó)的廣東、廣西、云南、湖南、湖北、江西等省區(qū)的顯齒蛇葡萄和粵蛇葡萄植物的幼嫩莖葉中含量達(dá)20％～30％?；浬咂咸?《中藥大詞典》稱無(wú)莿根)和顯齒蛇葡萄(又稱藤茶，為粵蛇葡萄的變種)這兩種植物的干制品歷來(lái)是民間作清涼解毒的代茶飲品，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀破結(jié)、利尿、消炎等功效，治肺癰、風(fēng)濕、癰癥腫痛、跌打、燙傷、慢性腎炎、肝炎、小便澀痛、胃熱嘔吐、感冒、咽喉腫痛等。
據(jù)報(bào)道，ZL2004具有抗癌作用、防治艾滋病作用及抗病毒作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ZL2004在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑、抗氧化劑和二?；视偷鞍准っ窩抑制劑藥物的應(yīng)用。
為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，采用ZL2004的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
本發(fā)明以維生素C作陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)比較ZL2004對(duì)氧自由基的清除作用及對(duì)大鼠腦組織中丙二醛(MDA)的清除作用，結(jié)果表明效果均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥維生素C。
抑制糖化終產(chǎn)物(AGEs)形成的作用試驗(yàn)通過(guò)體外糖化終產(chǎn)物AGEs形成的模型，根據(jù)AGEs形成的速度來(lái)評(píng)價(jià)抑制AGEs形成的作用。結(jié)果表明ZL2004具有明顯的預(yù)防體外非酶糖基化終產(chǎn)物形成的作用，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥氨基胍(AG)。
對(duì)PKC的抑制作用試驗(yàn)為，PepTagC1肽是帶有特異熒光的一種短肽，組織中PKC可使其磷酸化，磷酸化的底物肽帶有負(fù)電荷，非磷酸化的底物帶有正電荷，在瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)為向兩極電泳。如果正極方向上熒光弱，表明磷酸化底物少，即PKC被抑制，半定量試驗(yàn)表明，ZL2004對(duì)正常大鼠腦組織PKC的抑制作用接近陽(yáng)性對(duì)照藥Staurospoine。
小白鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)為取昆明小白鼠，按常規(guī)藥理學(xué)試驗(yàn)方法試驗(yàn)，結(jié)果表明ZL2004毒性屬低毒～無(wú)毒級(jí)，腹腔給藥無(wú)毒劑量達(dá)到1000mg/kg小鼠。
從以上的結(jié)果可說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明對(duì)已知的化合物ZL2004發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的ZL2004原料來(lái)源豐富，可做成口服劑型、注射劑型、片劑等，使用方便。
(3)由于本發(fā)明的物質(zhì)配制成的藥物具有顯著抑制糖化終產(chǎn)物形成的作用，因此可用于治療糖尿病、抗衰老、動(dòng)脈粥樣硬化。
(4)由于本發(fā)明的物質(zhì)配制成的藥物具有顯著抑制蛋白激酶C磷酸化的作用，因此可用于治療糖尿病、抗癌、抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(脊髓神經(jīng)痛等)。
(5)由于本發(fā)明的物質(zhì)配制成的藥物具有顯著地清除自由基、抑制丙二醛(MDA)生成的作用，因此可用于治療糖尿病、抗癌、抗衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗高血壓高膽固醇、抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森氏病等)。
將ZL2004采用藥學(xué)上可接受的輔料按常規(guī)生產(chǎn)方法制備成藥劑學(xué)上所說(shuō)的任何劑型包括口服劑型如片劑、沖劑、膠囊、口服液等，也可制備成注射劑型，如注射用粉針劑、注射劑等；也可以制成靶向制劑，如脂質(zhì)體等。
本發(fā)明的藥物劑型中含有重量比為1-99％的ZL2004。
本發(fā)明的藥物的用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、腫瘤類型而改變。其劑量可以是0.5-1g，可以皮下或肌肉注射，或靜脈內(nèi)注射或滴注，也可以口服用藥。
圖1為ZL2004對(duì)羥基和超氧離子的清除作用結(jié)果圖。說(shuō)明在兩種不同的產(chǎn)生羥基和超氧離子的體系中觀察ZL2004的清除作用。縱坐標(biāo)表示清除率，橫坐標(biāo)表示濃度。數(shù)據(jù)來(lái)自六次試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖2為ZL2004及維生素C對(duì)大鼠腦組織中丙二醛(MDA)的抑制結(jié)果圖。
圖3為ZL2004、氨基胍抑制AGEs形成的速度圖。
圖4為ZL2004對(duì)PKC的抑制作用試驗(yàn)的電泳結(jié)果圖。其中controlPKC實(shí)驗(yàn)對(duì)照，HomSD大鼠腦組織勻漿(胞漿部分蛋白激酶C)，StauPKC抑制劑Staurospoine，Negative陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用的進(jìn)一步說(shuō)明，絕非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1從粵蛇葡萄中提取ZL2004。
取葡萄科蛇葡萄屬植物粵蛇葡萄的干燥全株或嫩葉或根，原料藥經(jīng)粉碎后，先用10倍體積量的95％酒精浸泡過(guò)夜，濾過(guò)。藥渣再用8倍體積量的95％酒精回流提取3次。濾過(guò)。合并濾液。回收酒精至有固體析出，加入適量水，加熱使固體溶解。乘熱加入溶液總量1％-2％的粉末活性炭，煮沸10分鐘，乘熱過(guò)濾。濾液再如上法經(jīng)靜置、析晶、水溶解、活性碳除雜質(zhì)及重結(jié)晶，共3次。最后收集結(jié)晶，真空40℃干燥后，得微黃色粉末或白色針狀結(jié)晶。
取上述提取的ZL2004 100克，溶解于適量2％的吐溫-80中，再加入適量甘露醇，經(jīng)凍干，制成皮下或肌注注射用粉針劑。
實(shí)施例2從顯齒蛇葡萄中提取ZL2004，并制成片劑。
取顯齒蛇葡萄的干燥的全株或嫩葉或根，原料藥經(jīng)粉碎后，先用8倍體積量的藥用酒精(50％)浸泡過(guò)夜，濾過(guò)。藥渣再用8倍體積量的50％酒精回流提取3次。濾過(guò)。合并濾液?；厥站凭劣泄腆w析出，加入適量水，加熱使固體溶解。乘熱加入溶液總量2％-4％的粉末活性炭，煮沸10分鐘，趁熱過(guò)濾。濾液再如上法經(jīng)靜置、析晶、水溶解、活性碳除雜質(zhì)及重結(jié)晶，共4次。最后收集結(jié)晶，真空40℃干燥后，得微黃色粉末或白色針狀結(jié)晶。
取上述提取的ZL2004，加淀粉制粒，加滑石粉、硬脂酸鎂壓片，制成ZL2004片劑。
實(shí)施例3將實(shí)施例2中的顯齒蛇葡萄，換成小葉蛇葡萄，其提取方法同實(shí)施例2。取上述提取的ZL2004，用含適量乙醇20％的丙二醇溶解，再加入甘露醇，制成ZL2004供靜脈注射用粉針劑。
實(shí)施例4將實(shí)施例1中的粵蛇葡萄換成蛇葡萄，其提取方法同實(shí)施例1，按常規(guī)方法制成膠囊。
實(shí)施例5將實(shí)施例1中的粵蛇葡萄換成光葉蛇葡萄，回流提取的酒精濃度換為50％，其提取工藝同實(shí)施例1，按常規(guī)方法制成口服液。
實(shí)施例6ZL2004抗氧化作用試驗(yàn)實(shí)施例6、7、8的ZL2004采用該化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，制備成1mg/ml的水溶液。
1、對(duì)氧自由基的清除作用·OH清除劑可以抑制鄰二氮菲-Fe2+氧化體系中A536的降低，并可通過(guò)A536值比較·OH清除劑的清除能力。在實(shí)驗(yàn)條件下，觀察A536值變化，反應(yīng)·OH氧化作用及ZL2004對(duì)·OH的清除效率。結(jié)果表明，ZL2004可濃度依賴性地清除·OH(圖1)，ED50為29.4μM。同樣，ZL2004對(duì)O2·-也具有一定的清除能力(圖1)。O2·-清除劑可抑制鄰苯三酚自氧化過(guò)程，使體系的A322特征吸收峰減弱。ZL2004清除O2·-的ED50為88.9μM。150μM VitC對(duì)·OH的清除率43.07±4.11％，低于40μM的ZL2004(59.09±4.97％，p＜0.01)；對(duì)O2·-的清除率為30.53±3.03％，低于80μM的ZL2004(48.96±6.21％，p＜0.01)。
2、ZL2004對(duì)丙二醛(MDA)的清除作用。
1、勻漿制備取組織塊(0.2-1g)在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙?jiān)嚫?，稱重，放入5或10毫升的小燒杯中。勻漿介質(zhì)的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，移液器取總量2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊(冰上操作)。
2、實(shí)驗(yàn)方法先將藥物與勻漿放入37℃溫育1h，藥物的終濃度均為1mg/ml，按照試劑盒說(shuō)明加樣，將樣品用漩渦混勻器混勻，試管口用保險(xiǎn)膜扎緊，95℃水浴80分鐘，取出后流水冷卻，然后3500-4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值。
從圖2可見ZL2004(1mg/ml)對(duì)大鼠腦組織中MDA具有抑制作用，且效果由于陽(yáng)性對(duì)照藥維生素C(1mg/ml)(物質(zhì)B、Q系陽(yáng)性對(duì)照物與本專利申請(qǐng)無(wú)關(guān))。
實(shí)施例7ZL2004抑制糖化終產(chǎn)物(AGEs)形成的作用。
1.試劑和藥物牛血清白蛋白(Bovine albumin serumV，BSA)Amresco分裝，葡萄糖(Glucose，GLU)，sigma公司，氨基胍(AminoguanidineHydrochloride，AG，lot219-956-7，Sigma)。
2.實(shí)驗(yàn)方法及步驟稱取0.991g葡萄糖及0.1g BSA，加入ZL2004(1mg/ml)及氨基胍鹽酸鹽(1mg/ml)，溶解于PBS中，定容至10ml，同時(shí)設(shè)有GLU+BSA，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。放入37℃培養(yǎng)箱中溫育。分別于溫育第0、7、14、28d測(cè)定熒光值，每組每次從溫育管中取出1ml測(cè)定。以激發(fā)波長(zhǎng)370nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm，測(cè)定熒光值。根據(jù)每次所測(cè)熒光值減去第一次基礎(chǔ)熒光值所得的值對(duì)時(shí)間作圖，以此來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)體外蛋白非酶糖基化的影響。抑制AGEs形成的作用根據(jù)AGEs形成的速度來(lái)評(píng)價(jià)，即用AGEs相關(guān)熒光值的單位時(shí)間變化速度來(lái)表示。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)體外AGEs形成的模型，根據(jù)AGEs形成的速度來(lái)評(píng)價(jià)抑制AGEs形成的作用。即用AGEs相關(guān)熒光值的單位變化速度，結(jié)果見圖3，來(lái)表示。從AGEs熒光值的單位時(shí)間變化率可以看出ZL2004(1mg/ml)具有明顯的預(yù)防體外非酶糖基化終產(chǎn)物形成的作用，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥氨基胍(AG，1mg/ml)。.
實(shí)施例8 ZL2004對(duì)二?；视偷鞍准っ窩(PKC)的抑制作用。
1、試劑由PKC檢測(cè)試劑盒(Promega公司)提供，Staurosporine，Sigma公司。
2、蛋白激酶C半純化取200g左右SD大鼠，斷頭處死，取出腦組織，用PKC抽提液(4℃)洗滌，濾紙擦干，1g腦組織加入5ml抽提液，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿(15秒×5次)，勻漿105000×g離心1h分離可溶性和結(jié)合性酶，上清為胞漿部分蛋白激酶C。
3、試驗(yàn)方法將反應(yīng)體系PKC Reaction 5×Buffer(5μl)，C1Peptide(0.4g/μl)(5μl)，PKC Activator 5×Solution(5μl)，PeptideProtection Solution(可選)(1μl)放入37℃溫育箱中反應(yīng)2min。加入藥物與勻漿及PKC(control)37℃溫育30min，95℃水育10min終止反應(yīng)。將樣品放入4℃冰箱，注意避光。將樣品與1μl 80％甘油混合，0.8％瓊脂糖凝膠電泳100V 15分鐘。見條帶清晰分離后，將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)UV燈下，可見清晰條帶。用手術(shù)刀將膠切下，盡量使其體積接近250μl，將其放入一個(gè)1.5ml帶有刻度的離心管中，95℃加熱至膠溶解。若膠的體積不夠250μl，用水補(bǔ)足。取125μl熱瓊脂糖，與75μl膠溶解液(已預(yù)熱至室溫，并被充分混勻)和50μl冰醋酸混合，迅速混勻。取250μl置于96孔板中。570nm讀取吸收率?？瞻捉M為液體瓊脂糖。
4.實(shí)驗(yàn)步驟(1)將PKC標(biāo)準(zhǔn)品用PKC稀釋液稀釋至2.5μg/ml。
(2)將PKC Activator 5×Solution超聲20-30秒或至液體變暖。
(3)按照以下比例在0.5mL離心管內(nèi)混合試劑及樣品，在加樣之前，保持操作在冰上進(jìn)行。
陽(yáng)性對(duì)照PKC Reaction 5×Buffer 5μlC1 Peptide(0.4g/μl)5μlPKC Activator 5×Solution(超聲后) 5μlPeptide Protection Solution(可選) 1μlPKC(2.5μg/ml)4μl加去離子水至25μl樣品對(duì)照PKC Reaction 5×Buffer 5μlC1 Peptide(0.4g/μl)5μlPKC Activator 5×Solution(超聲后) 5μlPeptide Protection Solution(可選) 1μl勻漿4μl加去離子水至25μl
陰性對(duì)照PKC Reaction 5×Buffer 5μlC1 Peptide(0.4 g/μl) 5μlPKC Activator 5×Solution(超聲后) 5μlPeptide Protection Solution(可選)1μl加去離子水至25μlStanderd PKC assayPKC Reaction 5×Buffer 5μlC1 Peptide(0.4g/μl)5μlPKC Activator 5×Solution(超聲后) 5μlPeptide Protection Solution(可選) 1μlZL2004 (Staurospoine)4μl加去離子水至25μl(ZL2004濃度為1mg/ml，Staurospoine濃度為1×10-5mol/l)將反應(yīng)體系放入37℃溫育箱中反應(yīng)2min。加入藥物與勻漿及PKC(control)37℃溫育30min，95℃水育10min終止反應(yīng)。將樣品放入4℃冰箱，注意避光。將樣品與1μl 80％甘油混合，0.8％瓊脂糖凝膠電泳100V 15分鐘。見條帶清晰分離后，將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)UV燈下，可見清晰條帶。用手術(shù)刀將膠切下，盡量使其體積接近250μl，將其放入一個(gè)1.5ml帶有刻度的離心管中，95℃加熱至膠溶解。若膠的體積不夠250μl，用水補(bǔ)足。取125μl熱瓊脂糖，與75μl膠溶解液(已預(yù)熱至室溫，并被充分混勻)和50μl冰醋酸混合，迅速混勻。取250μl置于96孔板中。570nm讀取吸收率?？瞻捉M為液體瓊脂糖。
5.試驗(yàn)結(jié)果PepTagC1肽是帶有特異熒光的一種短肽，組織中PKC可使其磷酸化，磷酸化的底物肽帶有負(fù)電荷，非磷酸化的底物帶有正電荷，在瓊脂糖凝膠上表現(xiàn)為向兩極電泳。如果正極方向上熒光弱，表明磷酸化底物少，即PKC被抑制，從圖4可見ZL2004(1mg/ml)對(duì)正常大鼠腦組織PKC的抑制作用接近陽(yáng)性對(duì)照藥Staurospoine(1×10-5mol/l)。此為半定量實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的注射劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的口服劑型。
4.3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備抗氧化劑藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的口服劑型。
7.3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備二?；视偷鞍准っ窩抑制劑藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的口服劑型。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-二氫黃酮在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑藥物中的應(yīng)用，其特征在于采用藥學(xué)上可接受的輔料制備成的靶向制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及3，5，7，3’，4’，5’－六羥基－2，3－二氫黃酮在制藥中的新用途，即該物質(zhì)在制備糖化終產(chǎn)物抑制劑、抗氧化劑和二?；视偷鞍准っ窩抑制劑藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1846695SQ20061003377
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日
發(fā)明者朱邦豪, 劉德育 申請(qǐng)人:中山大學(xué)