專利名稱：一種莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val.、廣西莪術(shù)Curcumakwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wengyujun Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，首載于《藥性論》，主要產(chǎn)于廣西、四川、浙江等地。其性溫味辛苦，具有破血行氣、消積止痛的功效，是臨床上較為常用的活血化瘀藥物。中醫(yī)理論認(rèn)為莪術(shù)辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具行氣破血，消積止痛之功效。莪術(shù)油為莪術(shù)中提取的揮發(fā)油，據(jù)藥理學(xué)研究報(bào)道，莪術(shù)油具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用，是一種具有發(fā)展前途的抗腫瘤、抗炎藥物。
由莪術(shù)油為主要成分的滴眼液在治療單純皰疹病毒性角膜炎(HSK)、流行性角結(jié)膜炎(EKC)已經(jīng)取得了很好的臨床療效。但是該滴眼液中藥物透過角膜屏障的能力較差，易隨眼液排出。半衰期很短，所以真正被眼部吸收的藥物比例小，而將藥物制成(聚)氰基丙烯酸正己酯毫微囊滴入眼中，它易透過角膜屏障，在結(jié)膜和角膜中粘附的藥量增加，吸附時(shí)間延長，而且在發(fā)炎眼中的粘附量比在正常的量高出4倍多，表明對發(fā)炎組織有一定的靶向性，所以利用這一特征制成的滴眼液可起到延長藥效，提高靶向性的作用，這也是此制劑的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)。此外(聚)氰基丙烯酸正己酯較其他丙烯酸衍生物的最大優(yōu)點(diǎn)是聚合過程簡單及所得的聚合物可生物降解。莪術(shù)油毫微囊化后可掩蓋莪術(shù)油的不良?xì)馕逗涂谖?，提高藥物的穩(wěn)定性，減少對胃的刺激性，使液態(tài)藥物固態(tài)化，因此而便于制劑及貯存。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，莪術(shù)油具有抗菌、抗病毒、抗炎作用和增強(qiáng)機(jī)體自身免疫力的雙向調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明的研究人員在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將莪術(shù)油制備成本發(fā)明的毫微囊滴眼液制劑。該滴眼液制劑具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用，與此同時(shí)提高了藥物在結(jié)膜和角膜中的吸附時(shí)間，使療效得到顯著提高，使藥物具有更明顯的靶向作用。
本發(fā)明的目的是公開一種具有抗菌、抗病毒、抗炎作用、療效好、吸附時(shí)間長，靶向作用明顯的的滴眼液制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開上述滴眼液制劑的制備方法。
本發(fā)明通過以下方案實(shí)現(xiàn)一、制備方法(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油1-10重量份，氰基丙烯酸烷酯6-40重量份，增溶劑1-10重量份，抗氧劑0.5-5重量份，防腐劑0.01-0.03重量份，增粘劑0.1-100重量份，滲透壓調(diào)節(jié)劑0.1-100重量份；(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值至適宜范圍，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入氰基丙烯酸烷酯，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得粒徑為10-1000nm的毫微囊；(3)將上述毫微囊與增溶劑混勻，再加入滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、增粘劑、防腐劑，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
滴眼液中揮發(fā)油的增溶劑以吐溫-80最為常用，但是高濃度對眼有可能產(chǎn)生刺激性，同時(shí)對抑菌劑的抑菌作用產(chǎn)生一定的影響，本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量試驗(yàn)，確定增溶劑吐溫-80的合適濃度為0.1％-1％，優(yōu)選濃度0.5％。
為防止本發(fā)明滴眼液中含有的藥物被氧化，避免溶液發(fā)生變色、混濁、沉淀等現(xiàn)象，因此需加入抗氧劑使其利于穩(wěn)定存放；本發(fā)明制備方法采用NaHSO3作為抗氧劑，優(yōu)選用量為0.1～0.2％。
本發(fā)明選擇苯扎氯銨作為抑菌劑，其有效濃度為0.001％～0.003％，本品優(yōu)選濃度為0.002％。
二、藥理實(shí)施例為了充分證明本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液的藥理作用，本發(fā)明研究人員以臨床上治療眼科疾病效果好，并以被認(rèn)可的西藥為陽性對照藥，進(jìn)行了以下的藥效學(xué)試驗(yàn)。
本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液由溫州醫(yī)學(xué)院藥物制劑研究室提供，規(guī)格為8ml/瓶；阿昔洛韋滴眼液，安徽三超藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為8mg/8ml/瓶；醋酸氫化可的松滴眼液，廣州東康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，15mg/5ml；鹽酸曲馬多注射液，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
新西蘭家兔、昆明小鼠、SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；BALB/c小鼠，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
單純皰疹病毒1型(HSV-I)，腺病毒8型(Ad-8)購自中國科學(xué)院病毒研究所，測得半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)為10-6與10-5。Hep-2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。
標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922株，金黃色葡萄球菌ATCC25925株，甲型溶血性鏈球菌32209株，肺炎球菌32401株，綠膿桿菌CMCC(B)10102株，白色假絲酵母菌CMCC(F001002)，以上標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干菌株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥品生物制品鑒定所中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心，試驗(yàn)前傳代備用。
臨床分離株金黃色葡萄球菌，甲型溶血性鏈球菌，乙型溶血性鏈球菌，肺炎球菌，肺炎克雷伯菌臨床分離株由中山大學(xué)第三醫(yī)院提供。
DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司產(chǎn)品。按說明配好后調(diào)PH值6.9-7.2，濾過消毒，分裝并4℃保存。用前根據(jù)需要配成10％滅活胎牛血清完全培養(yǎng)基，水浴至37℃，加入2mmol/L谷氨酰胺和1％青、鏈霉素，NaHCO3調(diào)pH約7.2。
胎牛血清杭州市四季青生物工程材料有限公司，特級，無支原體。用前至50℃水浴中30min滅活。
MH培養(yǎng)基、沙保弱氏培養(yǎng)基、5％小牛血清肉湯、血平板培養(yǎng)基按《現(xiàn)代微生物培養(yǎng)基和試劑手冊》制備。
YZ-5CS照相裂隙燈顯微鏡，蘇州醫(yī)藥器械廠生產(chǎn)。
1、對實(shí)驗(yàn)小鼠單純皰疹病毒性角膜炎的治療作用6周齡BALB/c小鼠72只，雌雄各半，分設(shè)正常對照組(12只)、模型對照組(12只)、阿昔洛韋滴眼液組(12只)、莪術(shù)油毫微囊滴眼液高劑量組(12只)、莪術(shù)油毫微囊滴眼液中劑量組(12只)和莪術(shù)油毫微囊滴眼液低劑量組(12只)。
角膜HSV-1感染BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)麻醉，用無菌1號(hào)針頭呈“#”形劃傷每只小鼠左眼角膜，正常對照組點(diǎn)滴5μl生理鹽水于角膜表面，其余小鼠點(diǎn)滴5μl HSV-1于角膜表面，同時(shí)輕輕按摩眼瞼約30s。角膜感染HSV-1的小鼠在感染后24h按雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、阿昔洛韋滴眼液組、莪術(shù)油毫微囊滴眼液高劑量組(原液)、莪術(shù)油毫微囊滴眼液中劑量組(1/2原液)和莪術(shù)油毫微囊滴眼液低劑量組(1/4原液)。
治療藥物的給予HSV-1的感染后24h，阿昔洛韋滴眼液8μl/次，莪術(shù)油毫微囊滴眼液組高、中、低三個(gè)劑量組分別給予三種濃度的滴眼液8μl/次，一天四次，間隔3h，連續(xù)給藥11天。模型組不給任何藥物和溶劑。
觀察指標(biāo)角膜熒光染色于感染后第3天、5天、7天、9天和12天用熒光素鈉染色，在裂隙顯微鏡下觀察病灶部位著色情況，按下述標(biāo)準(zhǔn)評分0分角膜基質(zhì)清晰透明，無著色；1分角膜基質(zhì)稍渾濁，點(diǎn)狀病灶數(shù)＜10，著色范圍為角膜面積1/4以內(nèi)；2分角膜基質(zhì)中度渾濁，點(diǎn)狀病灶數(shù)10～20或出現(xiàn)短樹枝狀病灶，著色范圍為角膜面積1/4～1/2；3分角膜基質(zhì)重度渾濁，點(diǎn)狀病灶數(shù)10～20或出現(xiàn)樹枝狀、地圖狀病灶，但仍可判斷瞳孔緣的位置，著色范圍為角膜面積1/2～3/4；4分角膜基質(zhì)完全渾濁，失去后部特征，出現(xiàn)密集樹枝狀或成片地圖狀病灶，著色范圍為角膜面積3/4以上。
試驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的HSV-1能成功感染BALB/C小鼠，在角膜接種病毒后的第3天，熒光素鈉染色顯示角膜可出現(xiàn)點(diǎn)狀、短樹枝狀病灶；并有隨著時(shí)間的推移而加重的趨勢，至第8天以后，病情趨于穩(wěn)定。莪術(shù)油毫微囊滴眼液給藥治療后，熒光素鈉染色表明高、中劑量組隨治療時(shí)間的延長，角膜病變有減輕的趨勢，其中中劑量組減輕的程度不如阿昔洛韋滴眼液；低劑量組病變減輕的趨勢不明顯。詳見表1。
表1 對實(shí)驗(yàn)性小鼠I型單純皰疹病毒性角膜炎病變范圍的影響


與模型組比較，*P＜0.05，*P＜0.01。
結(jié)果顯示，莪術(shù)油毫微囊滴眼液對實(shí)驗(yàn)小鼠單純皰疹病毒角膜炎有治療作用，高濃度的莪術(shù)油毫微囊滴眼液的治療作用不亞于阿昔洛韋滴眼液。
2、對實(shí)驗(yàn)家兔單純皰疹病毒性角膜炎的治療作用HSV-I對Hep-2的TCID50的測定將經(jīng)過傳代后HSV-I作10-1-10-8對數(shù)比例稀釋，接種于已長成單層的Hep-2細(xì)胞上，每稀釋度接種4孔，每孔0.1ml，37℃吸附90min后，棄之，用維持液洗數(shù)次后換維持液，同時(shí)增設(shè)正常細(xì)胞對照，置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，逐日觀察記錄CPE(細(xì)胞病變)出現(xiàn)情況，按Reed andMuench法計(jì)算TCID50。實(shí)驗(yàn)測得實(shí)驗(yàn)用HSV-I毒株對Hep-2的TCLD50為10-6。
模型制備取健康無眼疾白色家兔50只，雌雄兼用，雙眼均經(jīng)點(diǎn)0.25％氯霉素每2小時(shí)1次，每天5次，三天后開始造模，雙眼滴0.25％的卡因表面麻醉后，用5號(hào)注射針頭在家兔角膜劃“井”字(深度僅限上皮層)，取定量移液管在兔下眼瞼內(nèi)滴入105TCID50HSV-I 100μl，閉合眼瞼按摩30秒。感染48小時(shí)后，動(dòng)物有畏光、流淚，角膜出現(xiàn)點(diǎn)、條、片、塊、樹枝或地圖狀病變，參照文獻(xiàn)方法并適當(dāng)修改對病變進(jìn)行評分，按病情輕重進(jìn)行隨機(jī)分組為5組，分別為溶劑對照組(10只)，阿昔洛韋滴眼液組(10只)，莪術(shù)油毫微囊滴眼液高、中、低劑量組(分別10、10、10只)。對照組給等體積溶劑，阿昔洛韋滴眼液給0.1ml/次；莪術(shù)油毫微囊滴眼液組高、中、低三個(gè)劑量組(劑量多少？)分別給予三種濃度的莪術(shù)油毫微囊滴眼液0.1ml/次，一日五次，間隔2小時(shí)，連續(xù)給藥14天。
觀察指標(biāo)(1)角膜熒光素染色感染48小時(shí)后3、5、7、9、11、13、15天用熒光素鈉染色一次，在裂隙燈顯微鏡下觀察病灶部位著色情況，按下述標(biāo)準(zhǔn)乙醇提取物、水提取物、水提醇沉物、揮發(fā)油和蘇合香及冰片合在一起為本發(fā)明的制劑的藥物活性成分。
所述顆粒劑的制備步驟如下將上述所得提取物，加入一定量的填充劑、矯味劑、潤滑劑，制粒，即得顆粒；膠囊劑的制備步驟如下將上述所得提取物，與藥粉制粒，加入潤滑劑填充，即得膠囊劑；咀嚼片的制備方法如下將上述所得提取物，加入一定量的填充劑、矯味劑、潤滑劑，制粒，干燥，壓片，即得咀嚼片。
所述的填充劑選自乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、微晶纖維素、甘露醇、預(yù)膠化淀粉、山梨醇、木糖醇等中的一種或幾種的混合物；所述的矯味劑選自水甜橙粉末香精、麥芽糖醇、糖精鈉、蛋白糖、蔗糖、阿斯巴甜、甜菊苷、薄荷腦、薄荷油中之一或其中幾種的混合物；適宜的潤滑劑包括硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠等其中的一種或多種。
以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果為了證明改變工藝后的臨床可行性，我們對該藥物進(jìn)行了其主要藥效學(xué)、毒理學(xué)研究，觀察其治療作用，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1、對體內(nèi)靜脈血栓形成的影響大鼠24只隨機(jī)分為3組，每組8只。除模型組外，分別給藥，劑量見表1，給藥后2h，動(dòng)物麻醉，腹部正中切開腹腔，剝離下腔靜脈備用。在左腎靜脈下方用粗絲線結(jié)扎下腔靜脈，縫合腹腔，結(jié)扎4h后，處死大鼠，打開腹腔，在結(jié)扎下方2cm處夾閉管腔，取出瘀血段血管，剖開管腔，取出血栓，放在濾紙上，吸干血液，用微量電子天秤稱取血栓濕重(mg)，然后將血栓在室溫下放置24h，稱取血栓干重(mg)。
結(jié)果與模型組比較，各治療組大鼠靜脈血栓干重、濕重明顯減輕(P＜0.05或P＜0.01)，中風(fēng)再造組血栓干重、濕重均低于步長腦心通組(P＞0.05)，見表1。
表1各組大鼠體內(nèi)靜脈血栓干重與濕重的比較(mg，x±s)

注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與腦心通組比較，△P＜0.052、對小鼠凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間的影響選體重為25～30g的昆明種小鼠30只，按性別隨機(jī)分3組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)對照組，給飲用水；陽性對照組，給腦血康7.2ml/kg(含生藥2.16g/kg)；中風(fēng)再造組(0.26g/kg)。每日給小鼠灌胃1次，連續(xù)10d。末次灌胃后1h，用毛細(xì)玻璃管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢，血液注滿后取出毛細(xì)管平放桌上，每30s折斷1次0.5cm的毛細(xì)管，觀察至出生，導(dǎo)管壁有1～2層細(xì)胞，上皮細(xì)胞排列稍紊亂，可向管腔內(nèi)形成突出，管腔內(nèi)可見稍多脫落的上皮細(xì)胞和分泌物；乳腺小葉體積增大，分葉較多，小葉腺泡為4～6個(gè)/小葉，腺泡腔有擴(kuò)張；間質(zhì)出現(xiàn)輕度增生。
表3.赤貝乳結(jié)清對乳腺小葉增生大鼠乳腺組織病變的影響

結(jié)果正常對照組為正常乳腺組織；模型組動(dòng)物乳腺小葉小管及末梢導(dǎo)管呈不同程度擴(kuò)張，上皮細(xì)胞增生，導(dǎo)管壁為多層細(xì)胞，多數(shù)上皮細(xì)胞排列紊亂，向管腔內(nèi)形成突起，管腔內(nèi)可見大量脫落的上皮細(xì)胞和分泌物，乳腺小葉體積明顯增大，腺泡分葉增多，腺泡腔顯著擴(kuò)張以及間質(zhì)纖維組織增生，表明乳腺小葉增生病理模型復(fù)制是成功。與模型組比較，陽性藥對照組和受試品赤貝乳結(jié)清高劑量組乳腺小葉小管及末梢導(dǎo)管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞增生程度明顯減輕，乳腺小葉體積較小，腺泡分葉減少，腺泡腔未見明顯擴(kuò)張，間質(zhì)纖維組織增生明顯減輕，乳腺小葉組織病理病變的恢復(fù)接近空白對照組。其中以受試品高劑量組的作用最明顯。受試品赤貝乳結(jié)清中劑量組和低劑量組乳腺小葉小管、末梢導(dǎo)管擴(kuò)張及上皮細(xì)胞增生程度有所減輕，乳腺小葉體積稍小，腺泡分葉有所減少，腺泡腔可見輕微擴(kuò)張，間質(zhì)纖維組織增生減輕。表明受試品高劑量組對大鼠乳腺小葉增生模型的乳腺組織病理改變有明顯減輕作用。
4.血清雌二醇(E2)含量測定按“按血清雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒”方法，測大鼠血清雌二醇(E2)

*與病毒對照組比較，經(jīng)fisner精確概率法檢驗(yàn)P＜0.01。
采用Reed-Muench法計(jì)算，莪術(shù)油毫微囊滴眼液、阿昔洛韋抗單純皰疹病毒1型的EC50分別為0.162g/L、2.5μg/L。
表4 藥物對腺病毒3型致細(xì)胞病變作用的影響

*與病毒對照組比較，經(jīng)fisner精確概率法檢驗(yàn)P＜0.01。
采用Reed-Muench法計(jì)算，莪術(shù)油毫微囊滴眼液、阿昔洛韋抗單純皰疹病毒1型的EC50分別為0.22g/L、3.2μg/L。
4、體外抗菌試驗(yàn)4.1試驗(yàn)菌液配制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單孢菌、肺炎克雷伯菌接種于MH肉湯，置普通培養(yǎng)箱37℃、24小時(shí)培養(yǎng)；甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎球菌接種于5％小牛血清肉湯，5％ CO2培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)；白色假絲酵母菌接種于沙保弱氏肉湯，置普通培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)；比濁法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)種于平板測定菌液中活菌數(shù)即菌落形成單位(CFU)/ml。用稀釋液調(diào)配成106CFU/ml菌液備用。
4.2最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的MIC、MBC測定將莪術(shù)油毫微囊滴眼液用MH肉湯由50％(W/V)為起點(diǎn)進(jìn)行2ml/2ml連續(xù)二倍梯度稀釋，依次加入濃度為106CFU/ml的試驗(yàn)菌液0.05ml。同時(shí)設(shè)立細(xì)菌以及培養(yǎng)基對照。置4℃作用12小時(shí)，于普通培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。無細(xì)菌生長試管中所含最小藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。再依次將未見細(xì)菌生長各管的培養(yǎng)物分別吸取0.1ml涂于MH平板，置普通培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)，平板上菌落數(shù)小于5個(gè)的平板中所含最小藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。
4.3甲型溶血性鏈球菌，肺炎球菌的MIC、MBC的測定將莪術(shù)油毫微囊滴眼液用含5％小牛血清的MH肉湯由50％為起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)二倍梯度稀釋，加入106CFU/ml的菌液0.05ml，設(shè)立細(xì)菌及培養(yǎng)基對照，4℃作用12小時(shí)，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。無細(xì)菌生長試管中所含藥物最小濃度為MIC。將無細(xì)菌生長試管中培養(yǎng)物0.1ml依次轉(zhuǎn)染到營養(yǎng)平板(甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌接種于血平板，卡他球菌接種于巧克力色平板)，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃、48小時(shí)培養(yǎng)，平板上菌落數(shù)小于5個(gè)的平板所含藥物最小濃度為MBC。4.3試驗(yàn)結(jié)果見表5和表6。
表5 莪術(shù)油毫微囊滴眼液對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC


“一”表示未見明顯抑菌或殺菌現(xiàn)象從表5可見，莪術(shù)油毫微囊滴眼液提取液對試驗(yàn)所選用的5株標(biāo)準(zhǔn)菌株均有較明顯的抑制和滅活作用，其MBC為MIC的1-4倍。
表6 莪術(shù)油毫微囊滴眼液對臨床分離菌株的MIC、MIC50、MIC90及MBC

從表6中可見，莪術(shù)油毫微囊滴眼液對試驗(yàn)所選用的臨床分離菌株均有一定的抑制和滅活作用，其MBC為MIC的2-4倍。
5、莪術(shù)油毫微囊滴眼液的抗炎作用5.1對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響取昆明種小鼠50只，18-22g剪去右耳周圍的毛，隨機(jī)分為五組，即溶劑組，醋酸氫化可的松滴眼液，莪術(shù)油毫微囊滴眼液高、中、低三個(gè)劑量組。用微量移液器吸取25μl受試藥液涂于右耳耳廓兩側(cè)，一日三次，連續(xù)給藥五日，于末次給予30min后，以25μl二甲苯涂于右耳耳廓兩側(cè)，15min后脫臼處死，用6mm的打孔器將小鼠雙耳相同部位打孔取材，分別精密稱重，以兩耳重量差值作為腫脹度指標(biāo)，比較藥物組與溶劑組的差異，并求出抑制率。
結(jié)果表明，莪術(shù)油毫微囊滴眼液的三個(gè)劑量對小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用，醋酸氫化可的松滴眼液也表現(xiàn)出明顯的抑制作用，詳見表7。
表7 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(n＝10，x±s)

與溶劑組比較*p＜0.05，與致炎前自身比較均P＜0.05。
5.2對雞蛋清所致大鼠足跖腫脹的影響采用大鼠足跖腫脹試驗(yàn)來觀察莪術(shù)油毫微囊滴眼液的抗炎消腫作用。170-190g SD大鼠50只，隨機(jī)分成五組，分別為溶劑組，氫化可的松組，眼滴莪術(shù)油毫微囊滴眼液高、中和低三個(gè)劑量組。各組按相應(yīng)劑量涂于足跖，于致炎前每日涂3次，連續(xù)五日，末次給藥后30分鐘，在大鼠足跖部皮下注射新鮮配制的1％雞蛋清0.05ml致炎，用足跖容積測定儀測量致炎前后大白鼠足跖關(guān)節(jié)以下的容積變化，計(jì)算并比較致炎后0.5h、1h、2h、4h各組大鼠致炎前后足體積的差值為腫脹度，比較各組腫脹度的差異。
結(jié)果表明，莪術(shù)油毫微囊滴眼液的高、中、低劑量在給藥后1h-4h均抑制大鼠足跖腫脹的作用，與對照組比較2h后皆有顯著性差異。結(jié)果見表8。
表8 對瓊脂致大鼠足跖腫脹的影響(n＝10，x±s)

與溶劑組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與致炎前自身比較均P＜0.01。
6、熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)取昆明種小鼠60只，均雌性，18～22g。給藥前1日先經(jīng)篩選，用熱板測痛儀55±5℃刺激，測定每只鼠出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時(shí)間(秒)即致痛潛伏期，選取痛閾值在5～30秒的合格小鼠，按痛閾值隨機(jī)分為5組，實(shí)驗(yàn)時(shí)同上法測定每鼠給藥前痛閾值(T0)，隨即尾靜脈給藥空白對照組ip溶劑0.2ml/10g，陽性對照組ip鹽酸曲馬多注射液50mg/kg，給藥組分別ip三種濃度的莪術(shù)油毫微囊滴眼液0.2ml/10g體重。給藥后30min同上法測定每鼠給藥后痛閾值(T1)，與給藥前比較，計(jì)算痛閾提高百分率％＝(T1-T0)/T0×100。結(jié)果見表9。
表9 莪術(shù)油毫微囊滴眼液對小鼠熱板致痛的影響(X±SD)

與空白對照組比，*P＞0.05，**P＜0.05。
由表9可見，莪術(shù)油毫微囊滴眼液能提高小鼠熱板致痛的痛閾值，高劑量給藥組作用顯著，中低劑量組沒明顯作用，陽性藥物鹽酸曲馬多注射液有明顯的鎮(zhèn)痛作用。
以上藥理試驗(yàn)結(jié)果說明莪術(shù)油毫微囊滴眼液對實(shí)驗(yàn)性小鼠、家兔單純皰疹性角膜炎試驗(yàn)有良好的作用，表現(xiàn)為可明顯減輕角膜的病理改變和減少病毒分離率，加快痊愈時(shí)間。體外抗菌、抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示莪術(shù)油有較強(qiáng)的清熱解毒，對HSV-1與AD-8均有較強(qiáng)抑制作用，對金黃色葡萄球菌、大腸埃氏菌、肺炎球菌等五侏標(biāo)準(zhǔn)菌株及120株臨床菌株均表現(xiàn)出一定的抗菌作用，小鼠耳廓腫長試驗(yàn)和大鼠足跖腫脹試驗(yàn)均表明莪術(shù)油毫微囊滴眼液的較好的抗炎作用，鎮(zhèn)痛試驗(yàn)表明莪術(shù)油沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用。綜上所述莪術(shù)油毫微囊滴眼液有抗菌、抗病毒、抗炎等作用，對病毒性角、結(jié)膜炎有良好的治療作用基礎(chǔ)。
三、刺激性試驗(yàn)單次用藥眼刺激性試驗(yàn)取健康無眼疾白色家兔8只，將0.1ml莪術(shù)油毫微囊滴眼液滴入于家兔右側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)以0.1ml作溶媒對照。給受試物后，用手將動(dòng)物眼瞼被動(dòng)閉合10秒。記錄給莪術(shù)油毫微囊滴眼液后6、24、48、72小時(shí)至7天的局部反應(yīng)情況。按表10的要求，將每只家兔與莪術(shù)油毫微囊滴眼液接觸后角膜、虹膜和結(jié)膜的平均分值及眼刺激反應(yīng)的綜合平均分值(即三種平均分值的總和)。而后以表11的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，判斷給莪術(shù)油毫微囊滴眼液后6、24、48、72小時(shí)至第七天時(shí)的刺激分值，并以最高分值為準(zhǔn)，判定莪術(shù)油毫微囊滴眼液對眼刺激性的反應(yīng)程度。
結(jié)果滴入莪術(shù)油毫微囊滴眼液的右眼在用藥6小時(shí)后有一只家兔結(jié)膜有一點(diǎn)輕度充血，其余動(dòng)物未見明顯改變。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)平均分均小于3，由此可判定莪術(shù)油毫微囊滴眼液一次滴眼沒有刺激性。
多次給藥眼刺激性試驗(yàn)取健康無眼疾白色家兔8只，將家兔右眼下眼瞼拉成杯狀，把0.1ml莪術(shù)油毫微囊滴眼液滴入于右側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，用手將動(dòng)物眼瞼被動(dòng)閉合10秒。另一側(cè)作溶媒對照，記錄每天末次給莪術(shù)油毫微囊滴眼液后1小時(shí)局部反應(yīng)情況。同時(shí)觀察全身反應(yīng)。每小時(shí)滴眼1次，每天6次，連續(xù)滴7天。停藥后再觀察七天。按表10的要求，將每只家兔與莪術(shù)油毫微囊滴眼液接觸后角膜、虹膜和結(jié)膜的平均分值及眼刺激反應(yīng)的綜合平均分值(即三種平均分值的總和)。而后以表11的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察每天給莪術(shù)油毫微囊滴眼液后的刺激分值，判定莪術(shù)油毫微囊滴眼液的眼刺激性程度。
結(jié)果在給藥的七日及停藥七日的過程中對家兔的飲食、活動(dòng)、大小便及精神狀態(tài)等一般體征沒有明顯影響，除個(gè)別家免體重略有下降外，整體對家兔體重沒有明顯影響。莪術(shù)油毫微囊滴眼液與空白溶劑連續(xù)滴七日及停藥后七日的眼刺激分值，結(jié)果同溶劑對照組比較可見莪術(shù)油毫微囊滴眼液2只家兔在給藥2-4天內(nèi)量比較準(zhǔn)確，分散也很均勻。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明組合物中的病原體滅活劑呈固態(tài)，不僅保證了病原體滅活光敏劑的穩(wěn)定性，而且對病原體滅活劑及其相關(guān)輔料采用了高溫除熱原、無菌過濾的制備工藝，從而解決了目前血漿或血液成分進(jìn)行光化學(xué)病原體滅活的病原體滅活劑的科學(xué)制備和添加問題。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將處方量的亞甲藍(lán)和葡萄糖加入到50ml注射用水中，充分溶解，加熱至70℃，再向溶液中加入經(jīng)活化的針用活性炭0.12g，保溫?cái)嚢枞昼?，趁熱過濾，過濾用微孔濾膜的孔徑小于0.22um，過濾后無微粒的中間體溶液再用精濾好的注射用水加至100ml定容后，備用。然后在每片潔凈的藥用滌綸薄膜滴加上述病原體滅活劑中間體溶液10ul，在100級層流罩下晾干，經(jīng)含量、無菌、熱原、微粒等檢驗(yàn)合格后，即制得固體的血液或血液成分病原體滅活劑組合物，與載體一起使用可應(yīng)用于血液病原體滅活裝置。具體的處方見表一表一

該實(shí)施例制備的滌綸薄膜吸附亞甲藍(lán)組合物的含量經(jīng)檢測為20.8ug/片，無菌，熱原檢測合格，微粒檢測符合2005年二部藥典附錄ixC規(guī)定，符合注射用要求。
該實(shí)施例制備的滌綸薄膜吸附亞甲藍(lán)組合物的病原體滅活驗(yàn)證驗(yàn)證方法和效果見表二表二

多次用藥后2/8例家兔在連續(xù)用藥兩天后結(jié)膜出現(xiàn)輕到中度充血，到第六日后恢復(fù)正常，停藥后未見異常改變，根據(jù)眼刺激性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，多次給藥眼刺激性綜合平均分值最高值為0.66，屬于無刺激性，結(jié)果表明莪術(shù)油毫微囊滴眼液連續(xù)用藥沒有明顯刺激性。
四、制備實(shí)施例實(shí)施例1(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油5g，冰片25g，聚氰基丙烯酸正己酯40g；(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油5g與冰片25g溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值2-3，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入聚氰基丙烯酸正己酯40g，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得毫微囊。
(3)將上述毫微囊與80ml吐溫-80混勻，攪拌加入到上述提取物溶液中，再加入41g氯化鈉、10g亞硫酸氫鈉、10g甲基纖維素、0.2g苯扎氯銨，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝成1000支，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
實(shí)施例2(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油3g，冰片15g，聚氰基丙烯酸正己酯24g；(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油3g與15g溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值2-3，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入聚氰基丙烯酸正己酯24g，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得毫微囊。
(3)將上述毫微囊與30ml吐溫-80混勻，攪拌加入到上述提取物溶液中，再加入31g氯化鈉、7g亞硫酸氫鈉、6g甲基纖維素、0.1g苯扎氯銨，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝成1000支，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
實(shí)施例3(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油10g，冰片50g，聚氰基丙烯酸正丁酯80g；(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油10g與冰片50g溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值2-3，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入聚氰基丙烯酸正丁酯80g，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得毫微囊。
(3)將上述毫微囊與160ml吐溫-80混勻，攪拌加入到上述提取物溶液中，再加入82g氯化鈉、30g亞硫酸氫鈉、20g甲基纖維素、0.4g苯扎氯銨，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝成1000支，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
實(shí)施例4(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油4g，冰片20g，聚氰基丙烯酸正丁酯32g；(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油4g與冰片20g溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值2-3，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入聚氰基丙烯酸正丁酯32g，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得毫微囊。
(3)將上述毫微囊與60ml吐溫-80混勻，攪拌加入到上述提取物溶液中，再加入35g氯化鈉、13g亞硫酸氫鈉、10g甲基纖維素、0.15g苯扎氯銨，充分?jǐn)嚢瑁偌恿姿猁}緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝成1000支，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
實(shí)施例5(1)本發(fā)明的莪術(shù)油毫微囊滴眼液中莪術(shù)油2g，冰片10g，聚氰基丙烯酸正己酯16g(2)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油2g與冰片10g溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值2-3，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入聚氰基丙烯酸正己酯16g，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得毫微囊。
(3)將上述毫微囊與20ml吐溫-80混勻，攪拌加入到上述提取物溶液中，再加入14g氯化鈉、8g亞硫酸氫鈉、4g甲基纖維素、0.04g苯扎氯銨，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝成1000支，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液。
權(quán)利要求
1.一種莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑及其制備方法，其特征在于，莪術(shù)油1-10重量份，氰基丙烯酸烷酯6-40重量份，增溶劑1-10重量份，抗氧劑0.5-5重量份，防腐劑0.001-0.003重量份，增粘劑0.1-100重量份，滲透壓調(diào)節(jié)劑0.1-100重量份。
2.按權(quán)利要求1所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑，其特征在于氰基丙烯酸烷酯選自聚氰基丙烯酸己酯，聚氰基丙烯酸戊酯，聚氰基丙烯酸丁酯，α-氰基丙烯酸己酯，α-氰基丙烯酸戊酯和α-氰基丙烯酸丁酯。
3.按權(quán)利要求1所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)藥物載體的制備方法將莪術(shù)油溶解在含有右旋糖酐或非離子型表面活性劑的酸性水溶液中，調(diào)解pH值至適宜范圍，在連續(xù)攪拌下，緩緩加入氰基丙烯酸烷酯，兩者發(fā)生聚合反應(yīng)，即得粒徑為10-1000nm的毫微囊。(2)將上述毫微囊與增溶劑混勻，再加入滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、增粘劑、防腐劑，充分?jǐn)嚢?，再加磷酸鹽緩沖溶液至1000ml，微孔濾膜濾過，濾液分裝，即得本發(fā)明莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑。
4.按權(quán)利要求1或權(quán)利要求3所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液，其特征在于非離子型表面活性劑選自脂肪酸山梨坦(Span)類物質(zhì)、聚山梨酯(Tween)類物質(zhì)、聚氧乙烯脂肪酸酯(Myrij)類物質(zhì)、聚氧乙烯脂肪醇醚(Brij)類物質(zhì)、聚氧乙烯—聚氧丙稀共聚物。
5.按權(quán)利要求4所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液，其中所說的脂肪酸山梨坦(Span)類物質(zhì)可選自月桂山梨坦(Span 20)、棕櫚山梨坦(Span 40)、硬脂山梨坦(Span 60)、三硬脂山梨坦(Span 65)、油酸山梨坦(Span 80)、三油酸山梨坦(Span 85)、或其混合物；所說聚山梨酯(Tween)類物質(zhì)可選自聚山梨酯20(Tween 20)、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80(Tween 80)、聚山梨酯85、或其混合物；所說的聚氧乙烯脂肪酸酯(Myrij)類物質(zhì)可選自聚氧乙烯40硬脂酸酯；所說的聚氧乙烯脂肪醇醚(Brij)類物質(zhì)可選自Brij30、Brij35、平平加O、埃莫爾弗(Emolphor)、西土馬哥(Cetomacrogol)EL或其混合物；所說的聚氧乙烯—聚氧丙稀共聚物可選自泊洛沙姆(Poloxamer)188、泊洛沙姆(Poloxamer)237、或其混合物。
6.按權(quán)利要求1或權(quán)利要求3所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑的制備方法，其特征在于調(diào)解pH值至適宜范圍可包括pH2-3，pH3-4，pH4-5，pH5-6。
7.按權(quán)利要求1所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑的制備方法，其特征在于增溶劑吐溫-80的優(yōu)選濃度0.5％。
8.按權(quán)利要求1所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑的制備方法，其特征在于制備方法中采用NaHSO3作為抗氧劑，用量為0.1～0.2％。
9.按權(quán)利要求1所述的莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑的制備方法，其特征在于制備方法中采用苯扎氯銨作為抑菌劑，優(yōu)選濃度為0.002％。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種莪術(shù)油毫微囊滴眼液制劑及其制備方法，其特征在于它是莪術(shù)油與聚氰基丙烯酸正己酯制成毫微囊，毫微囊與增溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧劑、增粘劑、防腐劑制備而成；本發(fā)明還公開了上述滴眼液制劑的制備方法。該滴眼液制劑具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用，與此同時(shí)提高了藥物在結(jié)膜和角膜中的吸附時(shí)間，使療效得到顯著提高，使藥物具有更明顯的靶向作用。藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的滴眼液能很好的治療眼科方面的疾病。
文檔編號(hào)A61K9/50GK1857675SQ20061003425
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者胡淑平, 藺勝照, 傅紅興, 李校堃, 何峰, 于平野 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院