專利名稱：海洋甾體化合物在制備治療神經(jīng)元損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
海洋留體化合物在制備治療神經(jīng)元損傷藥物中的應(yīng)用[技術(shù)領(lǐng)域]本發(fā)明涉及神經(jīng)性甾體化合物的應(yīng)用，具體地說涉及海洋甾體YC-1(24 —亞甲基一膽甾 一3 P ， 5 a , 6 e ， 19—四醇)在制備治療神經(jīng)元損傷藥物中的應(yīng)用。[背景技術(shù)]腦血管疾病是常見病、多發(fā)病，是目前嚴(yán)重危害人類健康的三大主要疾病之一，在疾病 譜中每年因腦血管疾病而死亡者，在日本占第二位，在美國占第三位，而在我國數(shù)年來均占 首位！腦血管疾病基本上可以認(rèn)為是種老年性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長而增高，55歲以上， 年齡每增加10歲，發(fā)病率增長一倍，隨著人類生活水平的提高和人類壽命的延長，社會人 口老齡化程度加劇，腦血管疾病的發(fā)病率在不斷上升；同時(shí)，由于生活方式的改變，近年來 腦血管疾病的患者還有年輕化的趨勢。在腦血管疾病中，缺血性腦血管病(簡稱腦缺血)約 占60% 80%，其主要發(fā)病基礎(chǔ)是腦動脈硬化癥。它是在全身動脈硬化的基礎(chǔ)上，腦動脈發(fā)生 彌漫性粥樣硬化、血管腔狹窄、小血管閉塞，使腦實(shí)質(zhì)的供血量減少，嚴(yán)重者會導(dǎo)致腦血栓 形成，血管完全閉塞，引起相應(yīng)供血部位的腦組織發(fā)生急性大面積梗塞性壞死，即所謂的"腦 卒中"或"中風(fēng)"，并最終導(dǎo)致腦功能障礙甚至永久喪失。腦缺血損傷的發(fā)病率、致殘率、 致死率以及復(fù)發(fā)率很高，而由其引起的偏癱、失語、癡呆等致殘結(jié)果更成為現(xiàn)代社會家庭的 沉重負(fù)擔(dān)。目甜對于缺血性腦損傷的治療目前側(cè)重于兩大方面①盡快改善和恢復(fù)缺血損傷腦組織 的血液供應(yīng)。②保護(hù)缺血腦組織免受代謝毒物的進(jìn)一步損害。早期再通閉塞的腦血管，是為 了在出現(xiàn)不可逆損害之前，給受累腦組織及時(shí)供血，以期阻斷殺死祌經(jīng)元的腦化學(xué)因子的連 鎖反應(yīng)，增加腦組織的耐受性，從而挽救半暗區(qū)腦組織功能；而保護(hù)神經(jīng)元?jiǎng)t是通過阻斷由 缺血所致各種有害病理過程的發(fā)生，從而防止或局限缺血所引起的腦損害，減少腦細(xì)胞死亡 和促進(jìn)功能恢復(fù)。雙管齊下、協(xié)同應(yīng)用，將使治療更具針對性和科學(xué)性，有望提高缺血性腦 損傷的療效。
改善和恢復(fù)缺血腦組織血液供應(yīng)的手段包括溶栓治療、抗凝治療和抗血小板凝集等。1. 溶栓治療20世紀(jì)80年代以來，溶栓治療尤其是超早期大劑量溶栓已成為缺血性腦 損傷的首選療法。但與安慰劑組相比溶栓治療顯著增加了致命性顱內(nèi)出血的發(fā)生率和其它原 因死亡的危險(xiǎn)性。因此溶栓治療風(fēng)險(xiǎn)大，對某些缺血時(shí)間較長的區(qū)域如缺血中心區(qū)和易損區(qū) 較易產(chǎn)生再灌注損傷、梗死后出血和嚴(yán)重腦水腫，需要嚴(yán)格掌握適應(yīng)證和用藥時(shí)間窗。2. 抗凝治療抗凝治療可阻止凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，對抗凝血酶的促進(jìn)纖維蛋白原 變成纖維蛋白的作用，阻止血小板聚集和破壞，但對己形成的血栓并無直接治療作用，故十 分強(qiáng)調(diào)早期應(yīng)用。但也有學(xué)者提出相反的看法，認(rèn)為發(fā)病后立即進(jìn)行抗凝治療，包括使用肝 素、低分子肝素、肝素因子或特殊的凝血酶抑制劑，未顯示出長期或短期的改善作用；雖然 可降低深靜脈血栓形成和腫動脈栓塞的危險(xiǎn)，但這一作用也被其發(fā)生顱內(nèi)外出血的危險(xiǎn)性所 抵消。3. 抗血小板凝集阿斯匹林具有抗血小板凝聚作用，現(xiàn)己被廣泛應(yīng)用于缺血性腦損傷 的治療，但其用量近年來一直未統(tǒng)一。實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)30 50mg/d阿斯匹林即可達(dá)到治療 目的，因此臨床上以小劑量作為治療及預(yù)防缺血性腦血管病的方法。新型抗血小板藥物一噻 氯匹啶近年多用于治療缺血性腦血管病，其臨床療效已得到公認(rèn)，且優(yōu)于阿斯匹林。4. 血液稀釋療法血液稀釋療法是通過降低血細(xì)胞比容而使血黏度下降，進(jìn)而增加局 部腦血流量起到治療作用。文獻(xiàn)報(bào)道早期采用等容血液稀釋，應(yīng)用半衰期較長的膠滲液，如 白蛋白或具有攜氧能力的合成蛋白Pentastarch等有望取得較好療效。選擇性血液成分稀釋 是在國內(nèi)外己應(yīng)用的血液稀釋療法和血液光量子療法的基礎(chǔ)上，針對缺血性腦損傷患者的血 液流變性不同類型改變或棄血漿、或棄血細(xì)胞的一種新療法。5. 擴(kuò)血管藥物的治療常用藥物如腦益嗪、罌粟堿、碳酸氫鈉以及鈣拮抗劑尼莫地平 等。但有人對應(yīng)用血管擴(kuò)張藥提出異議，認(rèn)為在缺血性腦血管病急性期(發(fā)病后1 3周) 應(yīng)用血管擴(kuò)張藥易引發(fā)再灌注損傷，加重缺血區(qū)和半暗區(qū)腦組織的損害。另一方面，對缺血腦組織和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)已成為當(dāng)今腦缺血損傷治療的研究熱點(diǎn)， 許多神經(jīng)保護(hù)劑正在臨床開發(fā)試用中。目前認(rèn)為，神經(jīng)保護(hù)劑治療急性缺血性腦損傷的主要 作用途徑有阻止CV'的內(nèi)流、清除自由基、使用興奮性氨基酸受體拮抗劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子 和Y-氨基丁酸受體激動劑等，其中研究較多的包括 1. 鈣通道阻滯劑研究最早、最廣泛的是二氫吡啶類藥物，以尼莫地平為代表，該藥 為電壓敏感鈣通道拮抗劑，具有脂溶性，容易通過血腦屏障。在3719例患者的隨機(jī)對照研 究中，口服120mg未見有顯著意義；但在發(fā)病12小時(shí)內(nèi)接受治療的患者，其不良結(jié)果的危險(xiǎn)性下降了3挑。目前對于發(fā)病6小時(shí)內(nèi)尼莫地平治疔臨床m期研究還在荷蘭進(jìn)行。鎂的小樣本研究表明，患者對該藥有良好耐受性，治療組大多數(shù)患者神經(jīng)功能改善，病后6個(gè)月再 入院機(jī)會減少。 一組包含60例患者的研究顯示，硫酸鎂定期治療后，治療組病死率和傷殘 率為30%,安慰劑組為40%，該藥的確實(shí)療效仍在進(jìn)一步研究。2. 自由基清除劑急性腦缺血時(shí)，腦內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致祌 經(jīng)元損害。自由基還可使缺血半暗區(qū)的血管痙攣及血管內(nèi)凝血，使梗死范圍擴(kuò)大而加重腦組 織損傷，故清除自由基治療十分重要。維生素E、維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、激素、 甘露醇等是常用的自由基清除劑，對缺血的腦細(xì)胞可提供保護(hù)作用。3.谷氨酸釋放抑制劑作用機(jī)制是抑制突觸前谷氨酸的合成及釋放，動物實(shí)驗(yàn)顯示其有明 確的腦保護(hù)作用。但其臨床應(yīng)用還有待驗(yàn)證。實(shí)際上，世界各地的研究人員一直致力于解決缺血后腦細(xì)胞保護(hù)這道難題，但由于腦缺 血所致中樞神經(jīng)組織和細(xì)胞損傷的病理機(jī)制涉及復(fù)雜的時(shí)間和空間的級聯(lián)反應(yīng)和交互作用， 任何只針對其中單一環(huán)節(jié)或個(gè)別分子機(jī)制進(jìn)行干預(yù)的治療嘗試幾乎都注定收效甚微，因此盡 管在動物模型上己取得多種有希望的治療方法；盡管-一直在開發(fā)許多化合物進(jìn)行抗腦缺血作 用的研究，但是迄今為止絕大部分臨床試驗(yàn)的結(jié)果都令人失望，原因可能就在于忽視了腦缺 血引起的細(xì)胞損傷過程具有多階段、多中心機(jī)制和多向性的特點(diǎn)。整體來看，人們對腦缺血損傷的機(jī)制和病理改變雖然有比較深入的了解，但是相應(yīng)的有 效治療手段仍然缺乏，臨床上還只能以溶栓、再通為主，然而這樣的處理只解決了血供問題， 對缺血后的神經(jīng)細(xì)胞損傷特別是再灌注損傷和遲發(fā)性死亡這些重要環(huán)節(jié)基本上無能為力，且 應(yīng)用中還存在出血的危險(xiǎn)和其他明顯的限制。在我國，盡管總體療效并不理想，但每年光是 用于治療中風(fēng)的支出就高達(dá)近百億元人民幣，還未算上可能延及患者一生的漫長的腦損傷康 復(fù)和神經(jīng)功能維持過程所必需的巨額費(fèi)用。因此，尋找能作用在缺血腦損傷過程的多個(gè)環(huán)節(jié)、 干預(yù)其發(fā)生發(fā)展的多種機(jī)制的藥物就具有非凡的意義，將對腦缺血損傷的有效緩解和治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，既大大減輕r社會、家庭和個(gè)人的精祌和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，又可以在潛力巨大的醫(yī) 藥市場占據(jù)一席之地，從而帶來極為顯著的杜會效益和經(jīng)濟(jì)效益。因此，有藥理學(xué)家預(yù)測，最終能投入臨床實(shí)用、高效對抗腦缺血損傷的希望之星將出自 具備多靶點(diǎn)作用機(jī)制的化合物。在眾多的研究和開發(fā)對象當(dāng)中，神經(jīng)活性甾體由于對神經(jīng)系 統(tǒng)具有廣泛效應(yīng)而日益受到關(guān)注。神經(jīng)活性甾體(neuroactive steroids, NASs)是天然存在或者人工合成的在神經(jīng)組織具有活性的所有甾體激素的統(tǒng)稱。NASs具有一般甾體激素的經(jīng)典作用方式，即通過結(jié)合神經(jīng)元內(nèi)特異的核受體如孕酮和雄激素受體，對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的多種受體和蛋白質(zhì)的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，稱為基因組效應(yīng)，過程涉及DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)修飾，所以起效較慢；NASs還能快速調(diào)制GABA受體、Glu受體、乙酰膽堿受體和胞內(nèi)Signml受體的活性，以非基因組方式直接影響情緒、神經(jīng)元的可塑性及興奮性、突觸傳遞和學(xué)習(xí)記憶等中樞活動。近年的一些研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，某些神經(jīng)活性甾體對神經(jīng)元的損傷、死亡以及多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有顯著的調(diào)節(jié)作用。例如，海人藻酸可以引起海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的丟失，而別孕烯醇酮(allopregnanolone. AL)能緩解海人藻酸的這種神經(jīng)毒性；在體外培養(yǎng)的海馬不可逆神經(jīng)毒性細(xì)胞模型(低氧和谷氨酸)中，AL也顯示出其神經(jīng)保護(hù)作用。脫氫表雄酮(dehydro印iandrosterone， DHEA)能降低Glu類似物和皮質(zhì)甾類的神經(jīng)毒性作用，但在人體內(nèi)的含量卻隨年齡增長而逐漸減少，被認(rèn)為與衰老過程中的神經(jīng)退行性變化相關(guān)；在可逆的兔脊髓缺血模型中，DHEA也具有神經(jīng)保護(hù)作用；在體外大鼠胚胎中樞皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧模型中， 一定濃度的DHEA能顯著增加神經(jīng)元存活率。雌激素是已知神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)的NAS,對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)毒性有良好的保護(hù)作用，與帕金森病(Parkinson' s Disease, PD)的性別差異相符；絕經(jīng)婦女卵巢停止產(chǎn)生雌激素，而大腦的淀粉樣蛋白前體濃度就增加并引起Af3沉積，給予雌激素又能明顯降低大腦的A日水平，提示了雌激素與阿爾茨海默病(Alzheimer' s Disease, AD)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)；雌激素對缺血、中風(fēng)和其它多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡有保護(hù)作用，還能延遲海人藻酸誘導(dǎo)的癲癇并保護(hù)癲癇狀態(tài)導(dǎo)致的海馬損傷；雌激素在幾種毒性模型中對神經(jīng)元都有明顯的保護(hù)效應(yīng)，提示了其激活受體、抗氧化、拮抗興奮毒性、調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)基因表達(dá)等多方面的作用。有研究學(xué)者近年的研究也發(fā)現(xiàn)雌二醇和睪丸酮具有類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，能夠促進(jìn)中摳神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生；雌二醇對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可以減少和延緩動物的癲癇發(fā)作，具有類似轉(zhuǎn)離子通道拮抗
劑的作用雌二醇和植物雌激素對去勢后大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)元退變具有保護(hù)作 用，能夠減少基底前腦膽堿能神經(jīng)元和海馬膽堿能神經(jīng)纖維的丟失，提高動物認(rèn)知能力。[發(fā)明內(nèi)容]海洋甾體YC-1(24 —亞甲基一膽甾一3e，5a，6e， 19一四醇)屬于氧代固醇類化合物， 具有不多見的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。研究資料顯示YC-1除具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的能力以外，還能通過非 基因組機(jī)制劑量依賴性地抑制谷氨酸誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元興奮毒性死亡，此保護(hù)作用并不 通過剛DA受體介導(dǎo)；YC-1也能劑量依賴性地抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，提示是 通過抑制c-Juri基因的表達(dá)及降低磷酸化c-Jun水平而發(fā)揮作用，PI3K/AKT存活通路可能參 與該調(diào)控過程；YC-1還能劑量依賴性地抑制缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡；在整體動物實(shí) 驗(yàn)中，無論是行為學(xué)指標(biāo)還是組織活性檢測都明確顯示YC-1對大鼠MCA0所致局灶性腦缺血 損傷具有極為顯著的防、治效果；對兔脊髓缺血損傷亦有顯著的防護(hù)作用。研究還發(fā)現(xiàn)YC-1 及其同類物軟珊瑚膽甾烯可通過阻遏還原型谷胱甘肽耗竭等途徑間接發(fā)揮抗氧化作用；通過 膜穩(wěn)定作用明顯減少炎性因子PGE2的釋放從而發(fā)揮抗炎作用?？梢姡琘C-1是一種可能通過 多種作用機(jī)制、針對不同靶點(diǎn)有效對抗缺血腦損傷的化合物，具有發(fā)展為臨床抗腦缺血損傷 用藥的潛在價(jià)值。此外，興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及神經(jīng)元的凋亡、壞死在以PD (Parkinson' s Disease)、 AD (Alzheimer' s Disease)為主的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā) 展過程中扮演著十分重要的角色，因此，對這些致病性改變具有顯著干預(yù)作用的YC-1在抗 神經(jīng)退行性疾病藥物的研發(fā)過程中具有廣闊的前景。從南沙群島唇軟珊瑚中提取的氧代固醇類化合物海洋甾體YC-1對多種神經(jīng)元損傷都具 有保護(hù)作用，在有效保護(hù)劑量下未見毒性反應(yīng)；然而天然提取的海洋甾體YC-1產(chǎn)量有限， 不利于大規(guī)模生產(chǎn)；應(yīng)用化學(xué)合成的方法可解決這一問題。以廉價(jià)的豬去氧膽酸為原料，經(jīng) 14步有機(jī)反應(yīng)合成可得到目標(biāo)化合物YG-1;利用IR、剛R、 MS、 EA等技術(shù)對目標(biāo)化合物的 結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，可獲得其IR、 1H剛R、 13C麗R、 MS、 EA等數(shù)據(jù)。本發(fā)明為YC-1結(jié)構(gòu)、效能的優(yōu)化完善并完成臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，使之發(fā)展成為保 護(hù)神經(jīng)元的新型藥物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖1: YC-1(24 —亞甲基一膽甾一3e，5a,6e,19 —四醇)的合成路線。圖2: YC-1的碳核磁共振譜。圖3: YC-1的氫核磁共振譜。圖4: YC-1的紅外光譜。圖5: YC-1的質(zhì)譜。圖6: YC-1可減少永久性大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠的半球梗塞體積。圖7: YC-1對永久性大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠的保護(hù)作用。圖8: YC-1對兔脊髓缺血模型的神經(jīng)功能評分的影響。圖9: YC-1對兔脊髓缺血模型行為學(xué)的影響。圖10: YC-1可增加兔脊髓缺血后脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)目。圖11: HE染色顯示YC-1對兔脊髓缺血后脊髓前角神經(jīng)元的影響。圖12:相差顯微鏡揭示的給藥后的經(jīng)H/R處理的CGNs的形態(tài)。圖13: FDA活細(xì)胞染色表明海洋甾體YC-1抑制H/R引起的CGNs凋亡。圖14: Hoechst33258凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)分析表明YC-1可抑制H/R誘導(dǎo)的CGNs凋亡。圖15:相差顯微鏡揭示的給藥后的經(jīng)LK處理的CGNs的形態(tài)。圖16: FDA活細(xì)胞染色表明海洋甾體YC-1抑制LK引起的CGNs凋亡。圖17: Hoechst33258凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)分析表明YC-1可抑制LK誘導(dǎo)的CGNs凋亡。圖18:瓊脂糖凝膠電泳分析YC-1可減少LK誘導(dǎo)CGNs凋亡表現(xiàn)的DNA斷裂片斷。圖19: FDA活細(xì)胞染色表明海洋甾體YC-1抑制Glu引起的CGNs凋亡。[具體實(shí)施方式
]一、海洋甾體YC-1(24 —亞甲基一膽甾一3日，5a ,63， 19 —四醇)的合成以廉價(jià)的豬去氧膽酸為原料，經(jīng)14步有機(jī)反應(yīng)合成得到了目標(biāo)化合物YC-1及其相關(guān)類
似物，并利用波譜技術(shù)對各中間體及目標(biāo)化合物進(jìn)行表征。1、 YC-1 (24—亞甲基一膽甾一3 5 6 19—四醇)的合成路線，見圖1。 2 、 YC-1合成工藝條件優(yōu)化(1) 3—乙酰氧基一膽甾一5—溴一6—羥基—24 —酮的合成該步反應(yīng)3 —乙酰氧基一膽甾一5 —烯一24—酮和N—溴代丁二酰亞胺反應(yīng)而得，產(chǎn) 物中存在多種異構(gòu)體，產(chǎn)率較低，通過選擇溶劑、反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件對其反應(yīng)過程進(jìn)行優(yōu) 化；通過重結(jié)晶、溶劑沉淀、柱層析等純化方法對其分離方法進(jìn)行研究。(2) —乙酰氧基一膽甾一5—溴一6 19—環(huán)氧一24 —酮的合成該步反應(yīng)3 —乙酰氧基一膽甾一5 —溴一6 —羥基一24 —酮中的6 —羥基發(fā)生 遠(yuǎn)程氧化關(guān)環(huán)而得，分別采用了四醋酸鉛、二乙酰碘代苯在紫外燈光照及超聲波兩種條件下 進(jìn)行氧化反應(yīng)，對該工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。(3) 3 19 — 二乙酰氧基一5 6—環(huán)氧—24—酮的合成3 19—二乙酰氧基一5 6—環(huán)氧一24 —酮由3 19 — 二乙酰氧基一5 — 烯一24 —酮的5， 6 —位雙鍵氧化制得，不同的氧化劑氧化產(chǎn)物的順反比例不同，產(chǎn)率不同， 采用三種氧化劑間一氯過氧苯甲酸、雙氧水/甲酸體系及高錳酸鉀/硫酸銅體系對5,6—位 雙鍵進(jìn)行氧化，進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。3、 目標(biāo)化合物YC-l及各中間體的表征利用IR、陋R、 MS、 EA等技術(shù)對目標(biāo)化合物及各中間體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，獲得它們的IR、 1H剛R、訓(xùn)MR、 MS、 EA等數(shù)據(jù)。其中YC-1的波譜數(shù)據(jù)如下 熔點(diǎn)223—225。C元素分析C28H4804 測定值C，75. 20; H, 10. 36 理論值C，74. 95; H， 10. 78, MS: [M-H20] 432,IR: 3416， 3028， 2936, 2868, 1642, 1464, 1377， 1057 'HNMR(DMSO)5.25(1H，d，6e-0H)， 4. 71 (1H, d， >1. 5Hz'28-CH), 4. 65(1H， d， ,1. 5Hz, 28-CH), 4. 51(1H,d, 19-0H)，4. 16(1H，d，3—CH)， 4. Ol(lH, d, 19-CH)， 3. 84 (1H, ra， 3—CH), 3. 64 (1H， s, 5-0H), 3.23 (lH,m，6-CH),2. 25(1H，m'25-CH), 1. 13 (6H， d, 26-CH3， 27—CH3), l.Ol(犯，s， 19 —CH3)， 0.87(3H,d, 21—CH3)， 0.67(3H，s，18-CH3).13CNMR(DMS0)156.6(C), 107.3(CH2)， 75.4(C), 74.7咖,66.7咖，63.0(CH2)， 57.4(CH), 56.7(CH), 45.9(CH), 43.5(C), 43.3(CH), 42.8(C), 41.3(CH2),肌9(CH), 37.4(CH2)， 36. l(CH), 33.9(CH2〉， 31.8(CH2), 31.4(CH2), 30.5(CH2)， 28.7(CH2), 27.9(CH2)， 24.70(CH2), 22.64(CH3), 22.57(CH3), 19.4(CH3), 13. 1 (CH3).4、 設(shè)計(jì)合成YC-1的類似物(1) 3 —羥基膽甾系列類似物(2) 3 6 —二羥基膽甾系列類似物(3) 3 5,6—三羥基膽甾系列類似物(4) 3 19 — 二羥基膽甾系列類似物(5) 5,6 19 —四羥基膽甾系列類似物(6) 3 —羥基膽甾的二聚體(7) 3 5 6 19 —四羥基膽甾的二聚體(8) 上述各系列中17位側(cè)鏈為24—羰基、24 —亞甲基、24 —羥基、24—腙等，并利用 IR、麗R、 MS、 EA等技術(shù)對目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。5、 甾體結(jié)構(gòu)修飾研究YC-1的水溶性較差，為改善其溶解性能，以3 —羥基一膽甾一5 —烯一24 —酮為模型， 對3 —位羥基親水性修飾。(1) 膽甾一5—烯—24—酮一3—羥基一磺酸酯的合成研究(2) 聚乙二醇修飾的3 —羥基一膽甾一5—烯一24—酮的合成研究二、 YC-1及其類似物對MCA0致大鼠腦缺血模型的作用 方法大鼠大腦中動脈栓塞模型(MCM))的制備健康雄性SD大鼠25只，隨機(jī)分成3組，分別為YC-1組(n-ll)即在栓塞大腦中動脈后 10ndn、 6h、 24h至7d，連續(xù)腹腔注射12mg. Kg-1的YC-1; DMSO組(n=ll)以同樣方式注射等 容量DMS0(lml Kg-1); Sham組(『3)僅插入較短栓線未栓塞MCA。1. 參照Zea Longa (Longa EZ， Weinstein PR， Car丄son S, Cummins R. Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989， 20: 84—91)等制備方法進(jìn)行改良大鼠術(shù)前一晚禁食，自由飲水；麻醉前l(fā)Omin腹注硫酸阿托品(0.5mg/Kg);采用10"X^.合氯醛3.5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉大鼠，以大鼠后肢回縮反射 及角膜反射消失為麻醉指標(biāo)，麻醉后仰臥固定，于頸中線切開皮膚、皮下組織，分離左 頸部皮膚與二腹肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌，在三肌形成的三角區(qū)暴露頸總動脈 (co隱om cartid artery ， CCA)分叉，以及由其發(fā)出的頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA)和頸外動脈(external carotid artery, ECA)。結(jié)扎頸總動脈CCA，在 咽升動脈起始處結(jié)扎ECA。在頸內(nèi)動脈近端備線，頸總動脈分叉處切口，將長5cm的尼 龍栓線插入ICA向心端，當(dāng)進(jìn)栓線約為17 18mm左右，要感到有阻力。此時(shí)，栓線進(jìn)入 頸內(nèi)動脈，入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源，從阻斷血流開始計(jì)時(shí)。 扎緊備線，剪去多余線頭，傷口以碘酒消毒，最后縫合皮膚，手術(shù)完畢回籠飼養(yǎng)。假手 術(shù)組除插線較短栓線(10mm)未及MCA起始處外，其余步驟同上。實(shí)驗(yàn)過程中使用美體康 電子溫度儀測量直腸溫度，動物體溫嚴(yán)格控制在36. 5 37. 5°C。 結(jié)果肉眼觀察假手術(shù)組腦組織顏色、形態(tài)正常、無蒼白和腫脹。DMSO組大鼠的腦組織 可見明顯的蒼白腫脹；YC-1組腦組織無明顯的蒼白和腫脹。TTC染色顯示，YC-l組梗塞體積 較DMSO組明顯減少(梗塞面積分別為32±11%和62±8%);假手術(shù)組無缺血。三、YC-1對腹主動脈夾閉致兔脊髓缺血模型的作用 方法脊髓缺血模型制作24只雄性新西蘭大白兔均分為3組(n-8): YC-1組即在脊髓缺血前30分鐘經(jīng)耳緣靜脈 注射8mg.Kg-1海洋甾體YC-1; DMSO組即在脊髓缺血前30鐘同樣方式注射等容量 DMS0(M . Kg-l); Sham組叩僅僅暴露腹主動脈，而不阻斷它。參照J(rèn)ohnson等方法制作兔脊髓缺血模型。動物術(shù)前禁食過夜，自由飲水。3%戊巴比妥鈉30mg. Kg-1經(jīng)耳緣靜脈麻醉動物，經(jīng)另側(cè)耳緣靜脈置一靜脈留置針(24G)，用于術(shù)中注藥、輸液。取右側(cè)耳動脈置一動脈留置針(24G)，用于監(jiān)測術(shù)中近端動脈壓及采血樣用。取一側(cè)股動脈置一動脈留置針(24G),用于監(jiān)測術(shù)中遠(yuǎn)端動脈壓。動物仰臥位，取腹正中切口 ，暴露腹主動脈。經(jīng)耳緣靜脈給予150U.Kg-1肝素后，在左腎動脈起點(diǎn)以下0.5 1.0cm處用動脈夾阻斷腹主動脈，造成兔脊髓缺血。阻斷腹主動脈后，遠(yuǎn)端動脈壓立刻下降，股動脈搏動消失。缺血20分鐘后移去動脈夾開放腹主動脈，恢復(fù)血流，然后關(guān)閉腹腔。術(shù)畢，肌注慶大霉素4 萬U，動物被放回飼養(yǎng)籠，觀察48小時(shí)。術(shù)中持續(xù)監(jiān)測近端動脈壓、遠(yuǎn)端動脈壓及心率 (Spacelab，美國)。用加熱墊和烤燈維持動物直腸溫度38. 5±0. 5'C。分別于缺血前10 分鐘、缺血后10分鐘和再灌注10分鐘經(jīng)兔耳動脈采血監(jiān)測血?dú)?AVL-2， Switzerland)和 血糖(One Touch II， USA)。結(jié)果各組動物神經(jīng)功能評分結(jié)果詳見圖l。假手術(shù)組兔的后肢神經(jīng)功能在整個(gè)觀察期間完全.TE常(4分)；而DMSO組中沒有一K兔能夠站立CPA組中有6只兔能夠站立，另2只兔 后肢也有明顯的運(yùn)動。YC-l組和Sham組的神經(jīng)功能評分在各觀察時(shí)間點(diǎn)均明顯高于DMSO組 (p<0.05)。組織病理學(xué)檢測表明在DMS0組，腰段脊髓有嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為運(yùn)動神經(jīng)元 的減少、尼氏體及核消失、空泡變性；而在YC-l組，腰段脊髓損傷明顯減輕。見圖3。與DMS0 組相比，CPA組和Sham組的脊髓前角正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯增多(p <0.01)。見圖4。四、YC-1及其類似物對缺氧誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元死亡的作用方法1.大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons, CGNs)的培養(yǎng)按Yan等的方法(w，取出生7 8d，體重約15 20g的清潔級SD大鼠，無菌條件下分離小腦，置無Ca"、 Mg" Kreb' s液(解剖液)中去除腦膜和血管，用眼科剪剪成1 miif大小的組織塊，然后在含0.25g* L—'胰酶的消化液中37'C消化15分鐘，隨即加入0.5 g. L/'胰酶抑制劑和0.05g丄—1 DNase I的吹散液終止消化，并吹散為單個(gè)細(xì)胞懸液，以200g離心5分鐘，沉淀用吹洗液洗1次，再以200g離心5分鐘，棄上清液，沉淀用含10y。(v/v)胎牛血清和25mMKCl的BME培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為1.5-1.8Xl(f個(gè)細(xì)胞/ml，接種于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)包被的培養(yǎng)皿中，置于5% 0)2及37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后24小時(shí)加入10 nniol.L—1 Ara-C以抑制非祌經(jīng)元細(xì)胞的生長和增殖，使小腦顆粒神經(jīng)元的純度在95%以上。培養(yǎng)第7d加入葡萄糖至5mM，以補(bǔ)充細(xì)胞代謝所需能量。第8天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.小腦顆粒祌經(jīng)元缺氧/再給氧(H/R)損傷模型的建立參照Seko (SekoY, Tobe K， UekiK， et al. Hypoxia and hypoxia/reoxygenation activate Raf-1， mitogen-activatedprotein kinase kinase, mitogen-activated protein kinases, and S6 kinase in culturedrat cardiac myocytes. Circ Res. 1996 Jan;78(1) :82-90)等方法制備缺氧/再給氧模型。將CGNs置于放有耗氧劑和指示劑的密閉盒中并于37X:下放置3h,然后將細(xì)胞置于5% C02
及37'C培養(yǎng)箱中進(jìn)行再給氧處理。3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和神經(jīng)元存活率的測定按Yan (Yan G M， Irwin R P， Lin S Z， et al. Diphenylhydantoin induces apoptotic cell death of cultured rat cerebellar granule neurons. J Pharmacol Exp Ther， 1995， 274(2): 983-8)等的方法進(jìn)行，主要為 小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)在35國的培養(yǎng)皿中，第8 d，各因素處理相應(yīng)時(shí)間后，移去培養(yǎng)基， 用含Ca"、 Mg"的4。C PBS洗2次，40g. L—'多聚甲醛液(4 °C ，溶于PBS)固定10min，移 去固定液，用蒸餾水清洗2次，置4'C下自然晾干，然后在倒置熒光顯微鏡(Olympus)下觀察 形態(tài)學(xué)變化，并隨機(jī)拍照。結(jié)果相差顯微鏡下觀察，缺氧前，小腦顆粒神經(jīng)元胞體飽滿透亮，細(xì)胞突起以及由之 構(gòu)成的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)緊密，清晰而完整；缺氧3h再給氧24h后(H/R)，神經(jīng)元胞體縮小，結(jié)構(gòu)不 清，突起和網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)紊亂、斷裂；加入10MK801或12yM YC-1或12uM YC-2 3h后再 進(jìn)行H/R處理，絕大部分CGNs均能保持胞體完整、飽滿透亮，突起及網(wǎng)絡(luò)緊密、清晰而完 整。FDA染色分析，H/R后，神經(jīng)元的存活率明顯降低(16. 56±3. 21%);加入10uMMK801 或12uMYC-1、 YC-2后，細(xì)胞存活率分別達(dá)86. 73±3.21%、 84. 29± 1. 26%和83. 54±4. 78%。Hoechst33258染色顯示，正常CGNs胞核完整，染色質(zhì)分布均勻；H/R后，CGNs胞核染 色質(zhì)固縮邊聚，出現(xiàn)凋亡小體；而加入12iiM YC-l、 YC-2的CGNs經(jīng)過H/R處理后，大部分 CGNs的核形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻。五、YC-1及其類似物對復(fù)極化誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元死亡的作用方法大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和神經(jīng)元存活率的測定、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和神經(jīng)元存活率的測定同前；瓊脂糖凝膠電泳參照文獻(xiàn)m,將小腦顆粒神經(jīng)元種植在35 mm2的培養(yǎng)皿中。第8天，加入各種藥物24h后，移去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，將收集的細(xì)胞用低溫高速離心機(jī)(Biofuge22R， Heraeus，德國)離心(5 000rpm， 4'C,5min),再將細(xì)胞團(tuán)塊加入600u L含有IO mmol. L—1 Tris-HC1,10隱ol. L—' EDTA和2 g. LH Triton X-100(pH 7. 5)的緩沖液中15min，離心(12 000rpm， 4。C， 10min)。上清加等體積酚抽提1次，離心。上清用等體積的酚、氯仿(i:l)混合液抽提l次，離心。取上清，加入300 mmoLL—'的乙酸 鈉和等體積的異丙醇，沉淀過夜。離心后，用70%乙醇洗滌2 3次，干燥后加入TE[Tris 10畫1丄—';EDTA 1.0國l丄—'(pH 7.4)和0. 6 g. L—'的RNase A ]37。C溫育30min，樣品放 在20 g. L—1的瓊脂糖凝膠上電泳lh，溴乙淀染色后在紫外燈下觀察拍照。結(jié)果體外培養(yǎng)8天的大鼠CGNs在含25rnM KC1的無血清BME培養(yǎng)基中，相差顯微鏡下 觀察其胞體及突起完整換成5rnM KC1的無血清BME培養(yǎng)24h后，神經(jīng)元胞體皺縮，突起斷 裂；FDA熒光染色法分析表明，僅有40.2±14.04%的CGN.s存活。如果在更換為低鉀培養(yǎng)基 前3h和同時(shí)加入12 y M YC-1或YC-2后，再繼續(xù)培養(yǎng)24h, CGNs大部分都能保持胞體和突起 的完整；FDA染色顯示，分別有94.3±14.02%和84.2±13.34%的細(xì)胞存活。這表明海洋甾體 YC-1和YC-2可以明顯提高低鉀培養(yǎng)的大鼠CGNs的存活率。六、YC-1及其類似物對谷氨酸誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元死亡的作用方法大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)(phase contrast microscopy)觀察神經(jīng)元的胞體及突起形態(tài)；二乙酸熒光素(fluorescein diacetate， FDA) 染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolic activity)和存活率(viability)。結(jié)果體外培養(yǎng)8天的大鼠CGNs，給予150wM谷氨酸(Glu)， 24h后用相差顯微鏡觀 察，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞體明顯縮小，細(xì)胞核固縮，突起斷裂或消失。在加入Glu前l(fā)h給予12wM 的YC-1或YC-2， 24h后觀察發(fā)現(xiàn)，YC-1和YC-2均能明顯的抑制Glu引起的CGNs凋亡。FDA 法測定CGNs的存活率發(fā)現(xiàn)，與Glu對照組(29. 5±8.23%)相比，12 YC-1和YC-2能 明顯提高CGNs的存活率(分別為92.6士2. 59%和91.6±10. 11"。
權(quán)利要求
1、海洋甾體化合物在制備治療神經(jīng)元損傷藥物中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其特征在于該海洋甾體化合物為24 —亞甲基一膽甾一3(3，5a,6卩，19一四醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋甾體YC-1(24-亞甲基-膽甾-3β，5α，6β，19-四醇)在制備治療神經(jīng)元損傷藥物中的應(yīng)用。從南沙群島唇軟珊瑚中提取的氧代固醇類化合物海洋甾體YC-1對多種神經(jīng)元損傷都具有保護(hù)作用，在有效保護(hù)劑量下未見毒性反應(yīng)；然而天然提取的海洋甾體YC-1產(chǎn)量有限，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；應(yīng)用化學(xué)合成的方法可解決這一問題。本發(fā)明為YC-1結(jié)構(gòu)、效能的優(yōu)化完善并完成臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，使之發(fā)展成為保護(hù)神經(jīng)元的新型藥物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號A61K31/56GK101164540SQ20061003692
公開日2008年4月23日 申請日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者劉愛伶, 桑韓飛, 蘇興文, 翔 蔡, 邱鵬新, 巍 銀, 顏光美, 黃奕俊 申請人:中山大學(xué)