專利名稱：白藜蘆醇苷用于制備治療帕金森病藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白藜蘆醇苷的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
帕金森病(PD)是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(NDN)特征性缺失為主要病理改變的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，臨床上以靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)調(diào)節(jié)障礙為主要特征，其發(fā)病率可隨年齡的增加而提高。50歲以上為500人/10萬(wàn)，60歲以上則達(dá)每年1000人/10萬(wàn)，患病率之高，使之成為僅次于腦血管病的神經(jīng)系統(tǒng)常見病。
雖然PD的發(fā)病機(jī)制已逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，與遺傳、環(huán)境因素、感染、衰老、氧化應(yīng)激、過(guò)多的自由基形成及神經(jīng)生長(zhǎng)因子缺乏等有關(guān)，是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。但關(guān)于黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生特異性退行性病變的原因，至今仍未得到明確的闡述。但有足夠的證據(jù)表明PD患者黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元受到氧化應(yīng)激損害。在PD患者死后尸檢中發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)中一些氧化損害的標(biāo)志物明顯增加，包括脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛及過(guò)氧化氫(H2O2)，蛋白質(zhì)和DNA的氧化產(chǎn)物碳酰化蛋白及8-羥基鳥苷酸，鐵聚集而鐵蛋白沒(méi)有變化，還原型谷胱甘肽(GSH)水平下降而氧化型谷胱甘肽(GSSG)無(wú)變化，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTT)活性增加，據(jù)認(rèn)為是對(duì)GSH降低的代償性反應(yīng)。在PD殘余多巴胺神經(jīng)元中還發(fā)現(xiàn)另一脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物4-hydroxynonenal增多，該物質(zhì)能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并增加對(duì)細(xì)胞的毒性。PD患者黑質(zhì)區(qū)Lewy小體中硝基酪氨酸免疫染色增強(qiáng)，提示一氧化氮(nitric oxide，NO)自由基和過(guò)氧化亞硝酸鹽陽(yáng)離子(ONOO-)也參與了細(xì)胞的氧化損害。也有實(shí)驗(yàn)表明突變的α-SN過(guò)度表達(dá)增加了神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的易感性。無(wú)疑，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)PD的確存在廣泛的氧化損害。
正常情況下，細(xì)胞代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生有害的自由基，但機(jī)體的防御體系限制了自由基的水平及其對(duì)細(xì)胞的損害。機(jī)體對(duì)抗自由基的物質(zhì)包括各種自由基清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)，超氧化物歧化酶為自由基清除的第一道防線，其主要功能是清除超氧陰離子(·O2+)；谷胱苷肽過(guò)氧物(glutathione peroxidase，GPx)及過(guò)氧化氫酶則主要清除H2O2；此外還有一些小分子在對(duì)抗氧化損害中也起重要作用，如GSH、β-胡蘿卜素、泛醇、維生素E及維生素C等。生理?xiàng)l件下，自由基的產(chǎn)生與清除相互平衡。任何原因引起的機(jī)體某一個(gè)或多個(gè)抗氧化物缺陷或者自由基產(chǎn)生過(guò)多都可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)自由基清除不足，過(guò)多的自由基則產(chǎn)生氧化應(yīng)激。
正常大腦黑質(zhì)特別容易受到氧化損害，其原因包括①.腦組織含高濃度的不飽和脂肪酸。②.大腦接受了與其重量不成比例的氧耗。③.自身保護(hù)機(jī)制相對(duì)薄弱，如與肝臟相比，大腦幾乎無(wú)過(guò)氧化氫酶，而GSH、GSH-Px及維生素E等明顯減少。④.多巴胺神經(jīng)元中的神經(jīng)黑素對(duì)Fe3+的高親和力使黑質(zhì)中聚集高濃度的Fe3+，并可隨時(shí)轉(zhuǎn)為活化的Fe2+。因此推測(cè)PD的發(fā)生正是由于自由基的產(chǎn)生與清除之間正常的平衡受到了嚴(yán)重的破壞，最終導(dǎo)致了多巴胺神經(jīng)元死亡。
近年來(lái)對(duì)PD的治療研究已取得了新的進(jìn)展，研發(fā)出不少新藥，歸納目前臨床上常用的藥物主要有以下幾類1.擬多巴胺藥左旋多巴、卡比多巴、司立吉蘭；2.中樞抗膽堿藥苯海索、苯扎托品。還有其他的金剛烷胺、溴隱亭、培高利特。這些藥物的治療目標(biāo)都在于恢復(fù)DA能和Ach能神經(jīng)系統(tǒng)功能的平衡狀態(tài)。但多存在療效不確切或毒副作用大等缺點(diǎn)，并且它們是依據(jù)相應(yīng)發(fā)病機(jī)理中的某一環(huán)節(jié)而進(jìn)行的嘗試，都是一些“治標(biāo)”的方法，不能有效防治PD的迅速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白藜蘆醇苷的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。實(shí)際上本發(fā)明涉及白藜蘆醇苷在治療帕金森病的藥中的應(yīng)用。
目前發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇苷(trans-Resveratrol-3-O-D-glycoside，piceid)是自虎杖中提取的一種單體，是白藜蘆醇與葡萄糖結(jié)合的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)式 它們均屬于虎杖成分中的芪類化合物，即羥基二苯乙烯類化合物，為白色粉末；結(jié)構(gòu)有順?lè)词絻煞N，Mr390。
白藜蘆醇苷現(xiàn)已證明主要存在于種子植物中，迄今至少在21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中被發(fā)現(xiàn)，許多含有白藜蘆醇苷的植物是常見的藥用植物，如決明、藜蘆、虎杖等，有的甚至是常用食物，如葡萄、桑子、鳳梨和花生，其中含白藜蘆醇苷最多的藥用植物是虎杖，而含量最高的食物則是葡萄。此外，紅葡萄酒中含有較多量的白藜蘆醇苷。
本發(fā)明主要通過(guò)建立6-羥多巴(6-OHDA)毀損的PD大鼠模型和MPTP誘導(dǎo)C57BL小鼠PD模型，確定白藜蘆醇苷對(duì)PD動(dòng)物模型鼠運(yùn)動(dòng)共濟(jì)失調(diào)、運(yùn)動(dòng)障礙和腦組織氧化應(yīng)激水平的改善作用；并圍繞6-OHDA如何損害整個(gè)SN和VTA區(qū)域的DA神經(jīng)元，進(jìn)而影響到健側(cè)的中腦組織及MPTP如何經(jīng)單胺氧化酶-B(monoamine oxidase-B，MAO-B)轉(zhuǎn)化成M PP+才對(duì)神經(jīng)元起損傷作用，得到白藜蘆醇苷抗6-OHDA，M PTP毒性的的作用機(jī)制。還通過(guò)離體的細(xì)胞培養(yǎng)，觀察白藜蘆醇苷濃度依賴性的拮抗MPTP的毒性作用以及白藜蘆醇苷促進(jìn)海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇苷(Piceid)具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及自由基清除作用，對(duì)人血PMNs呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的自由基、黃嘌呤-黃嘌呤體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基、VitC-Cu2+體系產(chǎn)生的一氧化碳自由基具有抑制或清除作用，其IC50為14～29μmol/L；抑制酵母多糖誘導(dǎo)的巨嗜細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化；對(duì)Fe2+所致人工細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化也具有很強(qiáng)的抑制作用。白藜蘆醇苷能夠抑制氧化玉米油喂飼大鼠肝臟過(guò)氧化類脂堆積，降低血清游離脂肪酸和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量。而給予白藜蘆醇苷則能明顯改善或阻止上述指標(biāo)的變化。這些發(fā)現(xiàn)和結(jié)果提示白藜蘆醇苷的作用機(jī)制就是清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，使氧自由基產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，從而延緩PD的病情進(jìn)展。


圖1是本發(fā)明中白藜蘆醇苷對(duì)6-羥多巴制備的PD大鼠模型的保護(hù)作用；圖2是白藜蘆醇苷對(duì)6-羥多巴損毀大鼠腦組織MDA水平和SOD活力的影響；圖3是PD模型大鼠海馬齒狀回有較少的神經(jīng)前體細(xì)胞；圖4是PD模型大鼠經(jīng)白藜蘆醇苷治療后海馬齒狀回有較多的神經(jīng)前體細(xì)胞；圖5是白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠轉(zhuǎn)桿活動(dòng)能力的影響；圖6是白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響；圖7是白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠腦組織MDA水平和SOD活力影響；圖8是MPTP對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響；圖9是白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增值降低的拮抗作用。
具體實(shí)施例方式
下面描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重200-250g，合格證號(hào)粵檢證字第2004A067號(hào)；8w齡雄性C57BL小鼠，體量25-27g，合格證編號(hào)粵檢證字第2004A065號(hào)；所有動(dòng)物安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水，人工晝夜節(jié)律(12h-12h)。
2.試劑6-羥基多巴(6-OHDA)，純度為99％，購(gòu)自Sigma公司。維生素C注射液，產(chǎn)地批號(hào)0501101。
阿樸嗎啡，購(gòu)自Sigma公司。
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)，Sigma公司產(chǎn)品，SOD、MDA測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。
培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基(高糖)，Hyclone產(chǎn)品；20％小牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品，購(gòu)自威佳生物工程公司。置56℃水浴中30min以滅活補(bǔ)體。注射用青霉素，硫酸鏈霉素，石家莊石藥集團(tuán)產(chǎn)品。
3.藥物白藜蘆醇苷注射液(Piceid；深圳海王藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)03030301)，黃色澄清液體。
左旋多巴，購(gòu)自Sigma公司。
4.溶液配制多聚賴氨酸氫溴化物溶解于150mmol/L硼酸鈉緩沖液中，(pH8.4)，終濃度為1mg/ml，抽濾滅菌。
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)配制用pH5.0的醋酸鈉緩沖液(0.1mol/L)配制NGF(2.5S)250μg/ml貯存液，使用前再用培養(yǎng)液稀釋，貯存液的濃度太低，活性容易喪失，貯存液應(yīng)凍存于-80℃，一旦凍融后不宜再凍存，所以應(yīng)將其分裝成小份凍存，凍融后的NGF貯存液可分裝于EP管中，置于4℃貯存，其活性可保存數(shù)月。
5.儀器超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)；NU2600E型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Precision公司生產(chǎn)；TGL-166A型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；LD5-2A型臺(tái)式高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；勻漿器，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；∑960型酶標(biāo)儀，Metertech公司生產(chǎn)；XDS-1B型倒置相差顯微鏡，日本Olyplus公司生產(chǎn)；722型光柵分光光度計(jì)，山東高密分析儀器廠；LBY-NJ2血液凝聚儀，北京普利生儀器中心；MFV-1100/1200型電磁流量計(jì)，日本Nihon Kohden公司；江灣I-C型立體定位儀，上海第二軍醫(yī)大學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
實(shí)施例一白藜蘆醇苷對(duì)6-OHDA制備的PD大鼠模型的保護(hù)作用(一)6-OHDA損毀大鼠黑質(zhì)制作帕金森病(PD)模型SD雄性大鼠隨機(jī)分成2組，分別為假手術(shù)組和模型組。10％的水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于立體定向儀，齒棒低于耳間線水平，使前后囟位于同一水平上，剪去顱頂?shù)氖竺?，碘酒擦拭后，正中切開皮膚，暴露前后囟，純雙氧水擦拭顱骨表面，使前后囟充分顯示，用牙科鉆在顱骨表面注藥點(diǎn)處鉆1個(gè)約2mm的小孔。調(diào)整微量注射器針尖的位置，參照包新民等的《大鼠腦立體定向圖譜》在前囟4.4mm，矢狀縫(右)1.3mm，顱骨下8.5mm點(diǎn)注射8μg/4μl含0.2％抗壞血酸的6-OHDA鹽溶液。注射速度為0.5μL/min，術(shù)畢留針10min后以1mm/min的速度退針，磺胺粉封閉顱孔，縫合頭皮，碘酒擦拭縫合處，置籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組用同樣方法向坐標(biāo)點(diǎn)注射4μl的生理鹽水。毀損術(shù)后7天，腹腔注射阿樸嗎啡0.5mg/kg誘發(fā)大鼠穩(wěn)定的向毀損對(duì)側(cè)作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，給藥10min后觀察其行為，記錄30min的旋轉(zhuǎn)情況，每分鐘旋轉(zhuǎn)次數(shù)至少7次以上，被視為達(dá)到PD模型要求。
(二)BrdU給藥和組織取材方法選取PD模型大鼠4只，各組大鼠于第13天腹腔注射BrdU(50mg/kg，BoehringerMannheim)2次，間隔12hr，最后一次腹腔注射BrdU后12hr即第14天處死取材、切片。使用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記比較海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。
組織取材方法戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，4％多聚甲醛室溫下經(jīng)左心室灌注固定，斷頭取海馬組織。經(jīng)后固定、脫水處理后，選擇海馬部位應(yīng)用恒冷箱切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，每隔150μm取腦片1張，片厚30μm，收集于0.01mol/L KPBS中待用。
(三)免疫組織化學(xué)方法取所得切片依次入50％甲酰胺(Sigma)/2×SSC(65℃2hr)、2N HCL(37℃30min)、0.01mol/L硼酸液(室溫下10min)、含0.03％Triton X-100的0.01mol/L KPBS(室溫下30min)。之后入小鼠抗BrdU抗體(1∶1000，Sigma)4℃孵育36h；再續(xù)入生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500，Sigma)，室溫2h；生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(1∶500，Sigma)，室溫2h；葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法呈色后常規(guī)封片，光鏡觀察。上述各步驟間均以0.01MPBS洗滌?？瞻讓?duì)照染色以血清稀釋液替代一抗。
每只大鼠各隨機(jī)選取4張不連續(xù)腦片光鏡下(OlympusBX60顯微鏡，400倍)觀察海馬齒狀回(包括顆粒細(xì)胞層、亞顆粒增生帶和門區(qū))，計(jì)數(shù)BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，以單個(gè)齒狀回平均BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示大鼠齒狀回BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量水平。使用Olympus FV-300激光共聚焦顯微鏡觀察PD模型組大鼠腦片。
(四)成年大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下取成年SD大鼠全腦，分離出海馬組織，以HBSS液清洗后，剪碎，收集組織糜液加入0.25％胰酶入37℃、95％CO2培養(yǎng)箱中消化30min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)800rpm×5min離心，棄上清液，轉(zhuǎn)移至DMEM/F12(1∶1)加B27的無(wú)血清培養(yǎng)基，吸管吹打制成單細(xì)胞懸液，離心后臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，每培養(yǎng)瓶中接種5×105個(gè)細(xì)胞，同時(shí)加用bFGF(20μg/L)進(jìn)行培養(yǎng)，每3-4天換液一次，換液同時(shí)加入新的bFGF。待原代培養(yǎng)細(xì)胞形成克隆后，機(jī)械分離制作單細(xì)胞懸液，繼續(xù)分瓶培養(yǎng)，仍采用相同的培養(yǎng)基加bFGF。此后每8-10d按前法連續(xù)傳代，待傳代培養(yǎng)細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)采用4～6代細(xì)胞)形成克隆后制作單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于至預(yù)先放置有涂布多聚賴氨酸蓋玻片的培養(yǎng)孔中，每孔100μl，按前述方法進(jìn)行培養(yǎng)，待用。
取第4代培養(yǎng)細(xì)胞克隆制成單細(xì)胞懸液，按前述方法進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)第4天時(shí)，棄去培養(yǎng)液，僅以DMEM/F12(1∶1)加B27的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，轉(zhuǎn)種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的96孔板，每孔100μl。將各培養(yǎng)孔分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別加入含bFGF(20ng/ml)，bFGF(20ng/ml)+測(cè)試藥物的培養(yǎng)液，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育48h后終止培養(yǎng)。每孔加入0.5％的MTT 10μl繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(DMSO)200l/孔，待顆粒溶解后置于酶標(biāo)儀上，在570nm的波長(zhǎng)值下檢測(cè)各孔的吸光度(A值)，每個(gè)濃度測(cè)定6孔。以只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。
(五)抗氧化指標(biāo)檢測(cè)——SOD活性和MDA含量測(cè)定鼠斷頭開顱，取腦組織標(biāo)本，以濾紙吸干表面殘血，去除嗅腦、腦干、小腦。腦組織標(biāo)本分別置于玻璃勻漿器，用冰生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1∶9的比例冰浴下制備成10％的腦組織勻漿，立即放入-30℃冰箱中保存，待測(cè)。試驗(yàn)前以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定腦組織蛋白定量。按試劑盒說(shuō)明書要求，自復(fù)融后腦組織勻漿中取樣品采用722型光柵分光光度計(jì)分別測(cè)定腦組織中SOD活性、MDA含量。
(六)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)將多聚-L-賴氨酸氫溴化物(終濃度1mg/ml)，經(jīng)過(guò)濾除菌后用于包被96孔板，在室溫作用6-7小時(shí)后，吸去包被溶液，并用雙蒸水洗兩三次96孔板，置超凈工作臺(tái)里晾干，再予紫外線照射5-6h滅菌。將PC12細(xì)胞(2×104或2×105/ml)接種于含10％胎牛血清、5％馬血清，100U/ml青霉素、100mg/l鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液(pH7.2)的96孔板中，每孔體積200ul。培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及濕度條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮推湟?。上述細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，換入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培養(yǎng)液，以后隔天換液(含NGF)。NGF誘導(dǎo)10-14天時(shí)，可使PC12細(xì)胞長(zhǎng)出神經(jīng)纖維，并形成致密的網(wǎng)絡(luò)。在倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞是否貼壁。然后用貼壁生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(七)實(shí)驗(yàn)結(jié)果白藜蘆醇苷對(duì)PD模型的治療作用1.大鼠腦室內(nèi)微量注射6-OHDA前，開始按(表4-6)所示劑量灌服給藥，白藜蘆醇苷(50mg/kg，100mg/kg)，L-Dopa(25mg/kg)，L-dopa(12.5mg/kg)+piceid(50mg/kg)。分別在給藥的7d，14d，21d，28d分別腹腔注射0.5mg/kg阿樸嗎啡，觀察大鼠向毀損對(duì)側(cè)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，結(jié)果顯示白藜蘆醇苷和L-dopa一樣能明顯減少PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，并隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，有一定效果增強(qiáng)的趨勢(shì)，且小劑量的白藜蘆醇苷和L-dopa聯(lián)合用藥能達(dá)到同樣的效果，表明兩者可能存在協(xié)同作用(表1、圖1)。
表1 白藜蘆醇苷對(duì)6-羥多巴(6-OHDA)制備的PD大鼠模型的保護(hù)作用

#交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值。
x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，參照模型組2.在白藜蘆醇苷給藥14d后，處死3組大鼠，取腦皮層，測(cè)定SOD活力和MDA含量，圖2、表2顯示白藜蘆醇苷能明顯降低6-OHDA毀損大鼠腦組織的氧化應(yīng)激水平，白藜蘆醇苷使PD模型大鼠腦組織MDA含量顯著降低，明顯提高SOD的活力，表現(xiàn)出抗氧化活性。
表2白藜蘆醇苷對(duì)6-OHDA損毀大鼠腦組織MDA水平和SOD活力的影響

x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，參照模型組3.如圖3所示的是6-多羥巴損毀大鼠黑質(zhì)后，大鼠腦組織海馬區(qū)域神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的增強(qiáng)，這是腦組織損傷后自發(fā)性修復(fù)，但是這種作用是十分微弱的，可通過(guò)外來(lái)藥物的干預(yù)增強(qiáng)這種作用，達(dá)到一定的恢復(fù)損傷作用。圖4所示的則是白藜蘆醇苷連續(xù)給藥28天后，PD模型大鼠腦組織神經(jīng)前體細(xì)胞增殖數(shù)目明顯多于未治療組。
實(shí)施例二白藜蘆醇苷(Piceid)對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的保護(hù)作用(一)皮下注射MPTP誘導(dǎo)C57/BL小鼠PD模型C57/BL小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組和給藥組(白藜蘆醇苷100mg/kg，白藜蘆醇苷200mg/kg，L-Dopa 50mg/kg，(L-dopa 25mg/kg+白藜蘆醇苷100mg/kg)。對(duì)照組和模型組預(yù)先給予灌胃生理鹽水，給藥組給予上述劑量的藥物，第8d模型組和各給藥組皮下注射MPTP 40mg/kg，給藥容量0.1ml/10g，一天一次，連續(xù)7天，第15d觀察小鼠的行為學(xué)指標(biāo)和進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。
(二)行為學(xué)檢測(cè)1.自主活動(dòng)計(jì)數(shù)參照Kawai H[22]測(cè)試方法，自制30cm×30cm×15cm的有機(jī)玻璃盒，底部刻出6cm×6cm的格子，在安靜、光線較暗的環(huán)境中檢測(cè)。小鼠適應(yīng)環(huán)境10min后，計(jì)數(shù)5min內(nèi)小鼠移動(dòng)的格子數(shù)，連續(xù)測(cè)5次取平均值。
2.Rotarod檢測(cè)Rotarod實(shí)驗(yàn)需要?jiǎng)游镌跐L軸上保持平衡并連續(xù)運(yùn)動(dòng)，是廣泛采用的檢測(cè)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的實(shí)驗(yàn)。C57/BL小鼠末次給藥1小時(shí)后把小鼠置于旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒儀上(滾軸直徑6cm，轉(zhuǎn)速為13r/min)，使之不斷地調(diào)整四肢，以保持身體平衡，若從轉(zhuǎn)桿跌落下來(lái)即自動(dòng)記錄在轉(zhuǎn)桿的時(shí)間(最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間180s，超過(guò)者仍記為180s)。
(三)黑質(zhì)及紋狀體免疫組織化學(xué)檢測(cè)
C57/BL PD模型小鼠行為學(xué)檢測(cè)后，每組取5只小鼠行黑質(zhì)及紋狀體免疫組織化學(xué)檢測(cè)。5g/L戊巴比妥鈉1mL腹腔麻醉后，開胸經(jīng)主動(dòng)脈先以生理鹽水15ml沖洗血液，再用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸緩沖液(PB，pH 7.2)100mL先快后慢灌注固定1h。灌畢立即取腦，在含300g/L蔗糖的PB溶液內(nèi)過(guò)夜(4℃)至組織沉底。參考小鼠腦圖譜，在恒冷箱(-22℃)行中腦黑質(zhì)和紋狀體冠狀切片，片厚30um，收集于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)內(nèi)。免疫組織化學(xué)染色步驟如下3g/L過(guò)氧化氫甲醇溶液(300g/L過(guò)氧化氫1mL+甲醇80mL+PBS 19mL)30min，3g/L TritonX-100的PBS30min，浸入小鼠抗TH單克隆抗體(1∶3000)孵育48h(4℃)，浸入生物素化兔抗小鼠二抗(1∶500)孵育2h(室溫)，浸入ABC復(fù)合物(1∶500)孵育2h(室溫)，在DAB-H2O2溶液中進(jìn)行呈色反應(yīng)20-30min，當(dāng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色而背底清晰時(shí)中止顯色。以上步驟每步后均需0.01mol/L PBS清洗3次，每次10min。其中一抗用含體積分?jǐn)?shù)為0.01牛血清和3g/L TritonX-100的PBS稀釋，二抗和ABC復(fù)合物用PBS稀釋。貼片，脫水，透明，中性樹膠封固。每只小鼠黑質(zhì)取頭端、中部、尾端切片3張，取大腦腳中點(diǎn)上方區(qū)域，在200×高倍鏡下計(jì)數(shù)TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性(tyrosinehydroxylase-immunoreactive，TH-ir)神經(jīng)元個(gè)數(shù)，取平均數(shù)。
(四)抗氧化指標(biāo)檢測(cè)——SOD活性和MDA含量測(cè)定鼠斷頭開顱，取腦組織標(biāo)本，以濾紙吸干表面殘血，去除嗅腦、腦干、小腦。腦組織標(biāo)本分別置于玻璃勻漿器，用冰生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1∶9的比例冰浴下制備成10％的腦組織勻漿，立即放入-30℃冰箱中保存，待測(cè)。試驗(yàn)前以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定腦組織蛋白定量。按試劑盒說(shuō)明書要求，自復(fù)融后腦組織勻漿中取樣品采用722型光柵分光光度計(jì)分別測(cè)定腦組織中SOD活性、MDA含量。
(五)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)將多聚-L-賴氨酸氫溴化物(終濃度1mg/ml)，經(jīng)過(guò)濾除菌后用于包被96孔板，在室溫作用6-7小時(shí)后，吸去包被溶液，并用雙蒸水洗兩三次96孔板，置超凈工作臺(tái)里晾干，再予紫外線照射5-6h滅菌。將PC12細(xì)胞(2×104或2×105/ml)接種于含10％胎牛血清、5％馬血清，100U/ml青霉素、100mg/l鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液(pH7.2)的96孔板中，每孔體積200ul。培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及濕度條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮推湟?。上述細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，換入含2.5S NGF(50ng/ml)的DMEM完全培養(yǎng)液，以后隔天換液(含NGF)。NGF誘導(dǎo)10-14天時(shí)，可使PC12細(xì)胞長(zhǎng)出神經(jīng)纖維，并形成致密的網(wǎng)絡(luò)。在倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞是否貼壁。然后用貼壁生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(六)白藜蘆醇苷(Piceid)對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的保護(hù)作用1 MPTP使小鼠的轉(zhuǎn)桿時(shí)間明顯縮短和自發(fā)活動(dòng)時(shí)間縮短，而白藜蘆醇苷(100mg/kg，200mg/kg)，L-Dopa(50mg/kg)，L-dopa(25mg/kg)+piceid(100mg/kg)在給藥14d后均能延長(zhǎng)小鼠的轉(zhuǎn)桿時(shí)間，并增加小鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)，顯示白藜蘆醇苷和L-dopa一樣能明顯改善PD模型小鼠的轉(zhuǎn)桿活動(dòng)能力，并增加小鼠的運(yùn)動(dòng)；且小劑量的白藜蘆醇苷和L-dopa聯(lián)合用藥能達(dá)到同樣的效果，也表明兩者對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型可能存在協(xié)同的治療作用(表3、4；圖5、6)。
表3白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠轉(zhuǎn)桿活動(dòng)能力的影響

x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，參照模型組注所用的多重比較方法(LSD，SNK)表4白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

注所用多重比較法(LSD，SNK)x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，參照模型組2在白藜蘆醇苷給藥14d后，處死3組小鼠，取腦皮層，測(cè)定SOD活力和MDA含量，圖7、表5顯示白藜蘆醇苷能明顯降低MPTP誘導(dǎo)小鼠腦組織的氧化應(yīng)激水平，白藜蘆醇苷使PD模型小鼠腦組織MDA含量顯著降低，明顯提高SOD的活力，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。
表5白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠腦組織MDA水平和SOD活力的影響


x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，參照模型組3PC12是常用的模型細(xì)胞，利用其增殖分化的特性，可模擬研究藥物對(duì)神經(jīng)元的作用，MPTP對(duì)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞具有明顯的毒性，抑制其生長(zhǎng)，并使細(xì)胞裂解死亡，此作用具顯著的濃度依賴性(表6、圖8)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，選用0.5mM MPTP作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用濃度。
表6MPTP對(duì)PC12細(xì)胞增值的影響

注所用多重比較法(LSD，SNK)；x±s，**P＜0.01，參照模型組。
預(yù)先用白藜蘆醇苷保護(hù)PC12細(xì)胞，可以濃度依賴性的拮抗MPTP的毒性作用，PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯多于MPTP組，因此，在離體細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有一定的保護(hù)作用(表7、圖9)。
表7白藜蘆醇苷對(duì)MPTP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增值降低的拮抗作用

注所用的多重比較方法(LSD，SNK)；x±s，**P＜0.01，參照模型組。
權(quán)利要求
1.白藜蘆醇苷在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了白藜蘆醇苷在制藥領(lǐng)域中的新用途，即在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。該物質(zhì)具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及自由基清除作用，使氧自由基產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，從而延緩PD的病情進(jìn)展。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1927212SQ200610037290
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者徐江平 申請(qǐng)人:徐江平