專利名稱：具有調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性作用的n的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到設(shè)計和合成一類具有對一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，縮寫為NOS)活性有調(diào)節(jié)作用的N2-芳甲?；?4-氨/胺基-蝶啶衍生物，用于制備預(yù)防和治療因體內(nèi)一氧化氮(Nitric Oxide，縮寫為NO)不足和減少或產(chǎn)生過多而引起的各種疾病的藥物。
背景技術(shù)：
一氧化氮自由基(nitric oxide free radical，NO·，簡寫為NO)在生物體內(nèi)作為重要的信使分子和效應(yīng)分子是在80年代后期被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的(Hibbs JB，Taintor RR，Vavrin Z.Macrophage cytotoxity-role for L-arginine deiminase and iminonitrogen oxidation to nitrite.Science，1987，235473-476.；Palmer RMJ，F(xiàn)erige AG，Moncada S.Nitric oxide release accountsfor the biological activity of endothelium-derived relaxing factor.Nature，1987，327524-526.)，NO在機(jī)體中以適宜的節(jié)律和強(qiáng)度生成，并參與機(jī)體內(nèi)各種重要的生理過程，維持機(jī)體細(xì)胞和組織正常的生命活動。在體內(nèi)，NO的作用具有雙重性體內(nèi)NO持續(xù)大量產(chǎn)生，將對機(jī)體產(chǎn)生損害作用，引起炎癥、休克、哮喘等疾病的發(fā)生；NO生成過少，即NO的合成障礙，也會引起生物體內(nèi)許多生理功能喪失，成為一些疾病的致病因素，例如研究發(fā)現(xiàn)高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病都與NO生成過少有關(guān)(鐘慈聲，孫安陽 主編一氧化氮的生物醫(yī)學(xué)，上海，上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1997)。
體內(nèi)NO的合成是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下與O2結(jié)合，生成左旋瓜氨酸(L-Cit)，而釋放出NO，因此，設(shè)計與合成具有調(diào)節(jié)NOS能力的化合物，維持機(jī)體正常的NO水平，對控制因機(jī)體內(nèi)NO水平不正常而產(chǎn)生的疾病與治療，具有重要的理論意義和臨床指導(dǎo)價值。
NOS含有4個輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)、血紅素(Heme)和四氫生物蝶呤(BH4)。NOS為一個雙區(qū)結(jié)構(gòu)，C端為還原酶區(qū)，含有NADPH、FAD、FMN同鈣調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；N端為氧化酶區(qū)，含有血紅素、BH4同左旋精氨酸的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)NOS存在的細(xì)胞類型來分共3種，即一類包括神經(jīng)元性NOS(nNOS)和內(nèi)皮細(xì)胞性NOS(eNOS)，另一類是iNOS，包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)性NOS和巨噬細(xì)胞性NOS(MacNOS)。
而其中iNOS是體內(nèi)一氧化氮水平異常增高的最大的元兇，因?yàn)閕NOS可被細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等許多體液性物質(zhì)所誘導(dǎo)，而iNOS是三種一氧化氮合酶中唯一的非鈣依賴型NOS，它與鈣調(diào)節(jié)蛋白有很強(qiáng)的親合力，即使在極低的Ca2+濃度下也能引起快通道開放，啟動一氧化氮合成，而且iNOS的mRNA的半衰期特別長，一旦被誘導(dǎo)合成即可長時間翻譯合成iNOS，所以iNOS一旦被誘導(dǎo)即可持續(xù)產(chǎn)生大量的NO，直至底物耗盡。因而，目前NOS抑制劑主要有以內(nèi)源性底物左旋精氨酸為靶點(diǎn)的L-Arg類似物，而以NOS輔助因子FAD、FMN、血紅素、BH4為靶點(diǎn)的化合物亦有文獻(xiàn)報道。其中BH4在NO的生物合成又扮演了極其重要的角色，它能增加NOS的活性和穩(wěn)定性，以BH4為靶點(diǎn)的NOS抑制劑同其他NOS抑制劑相比在選擇性上有著極大的優(yōu)越性。
至今，以BH4為靶點(diǎn)的NOS抑制劑絕大多數(shù)為蝶啶衍生物，主要的2-氨基-4-胺基取代的蝶啶類化合物，體外測試都能完全抑制NOS的活性(Frohlich LG，Kotsonis P，Traub H，et al.Inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 4-amino pteridine derivativesStructure-activityrelationship of antagonists of(6R)-5，6，7，8-tetrahydrobiopterin cofactor.J Med Chem，1999，424108-4121；Matter H，Kotsonis P，Klingler O，et al.Structural requirements for inhibition of theneuronal nitric oxide synthase(NOS-I)3D-QSAR analysis of 4-oxo-and 4-amino-pteridine-basedinhibitors.J Med Chem，2002，452923-2941；姚其正，王秋娟，呂剛等.具有一氧化氮合酶抑制劑作用的蝶啶衍生物.中國專利200310106588.0，2003-12-10)，使NO完全不能產(chǎn)生。NO是雙刃劍，完全抑制NO的產(chǎn)生，也會對機(jī)體產(chǎn)生的副作用。
在機(jī)體內(nèi)NO過少時，目前僅使用NO供體藥物，直接產(chǎn)生NO供應(yīng)全身，這必然也會產(chǎn)生對機(jī)體的另一種副作用。然而，到目前為止還沒有通過激活/促進(jìn)NOS的作用來增加NO水平的藥物。
以上所述，即成為本發(fā)明所涉及的研究內(nèi)容的重要背景與進(jìn)行發(fā)明研究的原因。

發(fā)明內(nèi)容
Crane等根據(jù)iNOSox的晶體結(jié)構(gòu)認(rèn)為L-精氨酸胍基和硫代瓜氨酸硫脲基在NOS的Heme口袋區(qū)的底部相互作用，提出了血紅素(Heme)參與NOS氧化底物L(fēng)-精氨酸的可能機(jī)制為L-精氨酸胍基氮原子的氧化提供氧(Crane BR，Arvai AS，Ghosh DK，et al.Structure of nitricoxide synthase oxygenase dimer with pterin and substrate.Science，1998，2792121-2126)；另一方面，最重要的是BH4中的N-3與Heme的丙酸側(cè)鏈之間形成的氫鍵，該氫鍵被認(rèn)為是BH4和Heme之間電子傳遞的通道(Crane BR，Arvai AS，Ghosh S，et al.Structures of theN(omega)-hydroxy-L-arginine complex of inducible nitric oxide synthase oxygenase dimer withactive and inactive pterins.Biochemistry，2000，39，4608-4621)。從空間距離上看，BH4中的2-位氨基與Heme較接近，在iNOS的結(jié)構(gòu)中BH4的2-位氨基與Heme以氫鍵相連，由于Heme的卟啉環(huán)是多雙鍵的π-共軛體系，本發(fā)明對2-氨基-4-氨基/胺基蝶啶類化合物中的2-氨基用芳甲?；M(jìn)行修飾，利用兩個π-電子體系相互影響來微擾血紅素對NOS轉(zhuǎn)移氧與電子的作用，以調(diào)節(jié)NOS的活性，達(dá)到改變NO合成水平之目的。
基于以上新思想，本發(fā)明提供了以一般通式(I)表示的N2-芳甲酰基-4-氨/胺基蝶啶類新化合物，經(jīng)用iNOS進(jìn)行生物活性測試，發(fā)現(xiàn)它們均不能完全抑制iNOS的活性，即改變了原2-氨基-4-胺基取代蝶啶類化合物有完全抑制NOS的活性的性質(zhì)；有的具有不同程度地激活iNOS的活性；部分化合物可代替BH4的作用。由此還發(fā)現(xiàn)芳甲酰基上的不同電學(xué)性質(zhì)的取代基，以及取代基在芳環(huán)上的位置等因素對iNOS活性影響的初步規(guī)律。本發(fā)明所設(shè)計和合成的N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有對一氧化氮合酶(NOS)活性有調(diào)節(jié)作用，可用作制備預(yù)防和治療因體內(nèi)NO水平過高或不足而介導(dǎo)的疾病的藥物。
下述通式(I)表示N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲酰基；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；?。R1或R2代表的芳甲?；哂邢铝谢瘜W(xué)式(II)中的取代基 其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、C1～C5烷基、硝基、C1～C3烷氧基、C1～C3烷氨基、甲硫基、苯基、苯氧基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過3個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、三氟甲基、硝基、甲氧基、乙氧基、苯基、羥基等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H，取代基、無取代基的C1～C6直鏈、支鏈烷基，或芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基；或NR3R4代表肟基、乙烯亞胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或單或雙取代的三元～五元脂肪環(huán)胺；R5代表H；取代或無取代的C1～C8直鏈、支鏈烷基，C1～C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代的或無取代的芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基。
通式(I)表示N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中較好的是R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲酰基；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；1或R2代表的芳甲?；哂谢瘜W(xué)式(II)中的取代基，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、甲基、乙基、丙基、異丙基、硝基、甲氧基、乙氧基、甲氨基、乙氨基、甲硫基、苯基、苯氧基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過2個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、三氟甲基、硝基、甲氧基、乙氧基、苯基、羥基等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，或苯基、芐基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基；或NR3R4代表肟基、乙烯亞胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、丙環(huán)胺基、戊環(huán)胺基；R5代表H；甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，或苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、芐基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基。
通式(I)表示N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中更為合適的是R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲?；?；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；?。R1或R2代表的芳甲酰基具有化學(xué)式(II)中的取代基，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、甲氨基、苯基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過2個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、硝基、甲氧基、等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H、甲基、乙基、丙基、異丙基，或苯基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基；或NR3R4代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、丙環(huán)胺基；R5代表H；甲基、乙基，或苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、芐基。
以上所述的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直鏈烷基，或是有側(cè)鏈的烷基，或是環(huán)狀烷基。在分子式中如果出現(xiàn)有立體異構(gòu)體和互變異構(gòu)體，則本發(fā)明中的化合物包括這些全部的立體異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。
上述通式(I)表示N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽具有調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性的功能，它們可在制備調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性的藥物中應(yīng)用。
所述通式(1)表示N2-芳甲酰基-4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，是制備預(yù)防和治療因體內(nèi)NO水平過高或不足而介導(dǎo)的疾病的藥物。
藥物組合物，其中含有治療有效量的通式(I)表示的N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，并含有常規(guī)藥用載體。
本發(fā)明所用的通式(I)表示的化合物可以是它們的中性形式，也可以是和無機(jī)酸或有機(jī)酸加成形成相應(yīng)的鹽使用，對藥物中所用的酸包括有如鹽酸、溴化氫、磷酸硝酸、硫酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、草酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、乙二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、琥珀酸酸、富馬酸、苯丙酸、葡糖酸、異煙酸、抗壞血酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸以及氨基酸等。通式(I)表示的化合物可以和多摩爾的酸加成形成相應(yīng)的鹽，這些多摩爾的酸可以是單一的也可以是組合的，這主要根據(jù)需要用相應(yīng)的溶劑或稀釋劑的情況來定。這些加成的鹽可通過陰離子交換去除。對于通式(I)表示的化合物中含有酸性組分的化合物，也可和相應(yīng)的無機(jī)堿或有機(jī)堿或堿性氨基酸加成形成相應(yīng)的鹽，例如對于這些鹽有堿金屬的鹽，特別有效的是鈉、鉀和銨鹽，以及與有機(jī)胺和堿性氨基酸等組成相應(yīng)的鹽。
本發(fā)明所涉及的N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類衍生物和它們相應(yīng)的鹽可和適當(dāng)?shù)妮o料(包括相應(yīng)的醫(yī)藥上允許應(yīng)用的賦形劑、緩釋劑、粘和劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、香料、色素等)作成片劑或膠囊，也可作成相應(yīng)的針劑用于臨床。
本發(fā)明通式(I)表示的N2-芳甲酰基-4-氨/胺基蝶啶類化合物是本次發(fā)明新合成的化合物，新合成的化合物均經(jīng)過各種物理方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，包括1H-NMR、MS、UV和元素分析。
通式(I)化合物的合成有以下步驟1、2，5，6-三氨基-4-氨/取代胺中間體(III)的合成合成中先將對氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶結(jié)合生成2，6-二氨基-4-氯-5-對氯苯偶氮嘧啶，接著用各種胺(HNR3R4)取代氯，最后用鋅粉還原偶氮基得化合物III(Frohlich LG，Kotsonis P，Traub H，et al.Inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 4-aminopteridine derivativesStructure-activity relationship of antagonists of(6R)-5，6，7，8-tetrahydrobiopterin cofactor.J Med Chem，1999，424108-4121)，見下列反應(yīng)式 式中NR3R4＝H2，N(CH2CH3)2，HNCH(CH3)2，N(CH2)5，N(C2H4)2NCH3，HNCH2CH2CH3等。
2、2-氨基-4-氨/取代胺-6-芳基蝶啶(V)的合成 式中R5＝CH3OC6H4，CH3C6H4，C6H5等。
2，5，6-三氨基-4-取代胺中間體(III)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下與肟基酮(IV)反應(yīng)，得到中間體(V)。
3、N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物(I)的合成 式中Ar為芳基，R1和R2為芳甲?；?br> 將2-氨基-4-氨/取代胺-6-芳基蝶啶(V)置于吡啶(Py)中與芳甲酰氯進(jìn)行加熱反應(yīng)，得到化合物I。
本發(fā)明所設(shè)計和合成的N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有對一氧化氮合酶(NOS)活性有調(diào)節(jié)作用，可用作制備預(yù)防和治療因體內(nèi)NO水平過高或不足而介導(dǎo)的疾病的藥物。
具體實(shí)施例方式
1化合物制備1.1中間體2，6-二氨基-4-二乙胺基嘧啶(III-1)將2，6-二氨基-4-氯-5-對氯苯偶氮嘧啶(5.00g，17.7mmol)加入到20mlDMF中，再加入二乙胺(10g，0.137mol)，加熱到70℃攪拌反應(yīng)5h，然后倒入冰水，有黃色固體析出，過濾，水洗，干燥，得黃色粉末2，6-二氨基-4-二乙胺基-5-對氯苯偶氮嘧啶4.01g，產(chǎn)率71％，m.p148～150℃，與文獻(xiàn)(Frohlich LG，Kotsonis P，Traub H，et al.Inhibition of neuronal nitric oxidesynthase by 4-amino pteridine derivativesStructure-activity relationship of antagonists of(6R)-5，6，7，8-tetrahydrobiopterin cofactor.J Med Chem，1999，424108-4121)結(jié)果一致。
將2，6-二氨基-4-二乙胺基-5-對氯苯偶氮嘧啶(1.28g，4mmol)加入到20ml乙醇、15ml 5％HCl液和組成的混合溶液中，升溫到70℃，攪拌條件下，小量分批加入鋅粉(2.62g，40mmol)，約需15min，加入完畢后，繼續(xù)在此溫度下攪拌1h，冷卻，過濾，濾液真空下濃縮至干，得一黃色油狀物，加入15ml乙醚的HCl液，攪拌，傾去乙醚液，得一黃色油狀物2，6-二氨基-4-二乙胺基嘧啶(III-1)，其純度可滿足供下一步反應(yīng)。
其它化合物III的制備按上述方法進(jìn)行。
1.2中間體2-氨基-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(V-1)將4mmol化合物III-1加入到無水甲醇20ml中使之完全溶解，加入對甲氧基苯甲酰甲醛肟(0.90g，5mmol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)4h，停止加熱，有黃色固體析出，以三乙胺調(diào)節(jié)pH至9，在冰箱中放置過夜，過濾得黃色固體2-氨基-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(V-1)0.73g，產(chǎn)率56％，m.p220～222℃，與Frohlich LG等人結(jié)果一致。
其它化合物V的制備按上述方法進(jìn)行。
1.3 2-(N-對硝基苯甲酰氨基)-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(1)0.25g 2-氨基-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(V-1)(0.77mmol)溶于10ml無水吡啶中，加入對硝基苯甲酰氯0.80g(4.32mmol)，回流反應(yīng)4小時，冷卻后倒入200ml冰水中，析出大量黃色固體，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至9-10，固體過濾干燥，溶于CHCl3，濃縮，經(jīng)柱層析(氯仿∶丙酮＝6∶1)分離和乙酸乙酯重結(jié)晶，得270mg黃色固體2-(N-對硝基苯甲酰氨基)-4-二乙胺基-6-對甲氧基苯基蝶啶(1)，產(chǎn)率74％，m.p260℃。
IR(cm-1)3161(δN-H)，1600(vC＝O)，1565(vC＝C，Ph)，1528(vN-H；vC＝C，Ph)，1449(vC＝N)UV/VISλMAXin nm(logε)376(4.15)；306(4.46)；ESI-MS474.2[M+H]+；496.1[M+Na]+；1H-NMR(CDCl3，δ)1.36(bs，3H，CH3)；1.51(bs，3H，CH3)；3.90(s，3H，OCH3)；3.90(bs，2H，CH2)；4.43(bs，2H，CH2)；7.04(d，2H，J＝8.2Hz，6-Ph-H-2’)；7.96(d，2H，J＝8.6Hz，6-Ph-H-1’)；8.15(d，2H，J＝8.2Hz，CO-Ph-H-2’)；8.32(d，2H，J＝8.4Hz，CO-Ph-H-2’)；9.24(s，1H，7-H)；元素分析C24H23N7O4Found(％)C，60.78；H，4.89；N，20.37Calcd(％)C，60.88；H，4.90；N，20.711.4按照制備化合物1的方法，合成了其它65個N2-芳甲酰基-4-氨/胺基蝶啶類化合物(I)，它們的結(jié)構(gòu)見表1，所有這些新化合物均經(jīng)紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV/VIS)、質(zhì)譜(ESI-MS)、氫譜(1H-NMR)和元素分析結(jié)構(gòu)確證。

表1 N2-芳甲酰基-4-氨/胺基蝶啶類化合物(I)的結(jié)構(gòu)



注o-，m-，p-分別表示鄰-、間-、對-位；tri-表示三-；N(CH2)5為哌啶基；N(C2H4)2NCH3為N-甲基哌嗪基。
2生物活性的測試方法2.1樣品與試劑
2.1.1蝶啶衍生物66個化合物按本專利方法合成，臨用前用DMSO溶解。
2.1.2誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)由Cayman Chemical公司提供。
2.1.3四氫生物蝶呤(BH4)二鹽酸鹽純度＞99％，由Cayman Chemical公司提供。
2.1.4一氧化氮試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，批號200504072.2主要儀器2.2.1HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司2.2.2BS110S分析天平 北京賽多利天平有限公司2.2.3752紫外光柵分光光度計 上海分析儀器總廠2.3藥物體外抑制與激活iNOS活性的篩選2.3.1測試方法按照一氧化氮試劑盒的方法，在試管中加入試劑1、試劑2、試劑3、iNOS樣品、BH4和受試藥物，混勻，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)20分鐘，加入試劑4終止反應(yīng)，再加入終止液和透明劑后混勻，于紫外可見分光光度計530nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定其吸光度。
2.3.2測定BH4的飽和濃度按2.3.1測試方法在試管中加入3種試劑和BH4，不加入iNOS樣品和受試藥物，反應(yīng)后測得空白管吸光度；另取數(shù)個試管，各試管中分別加入3種試劑、iNOS樣品和不同濃度的BH4，不加入受試藥物，反應(yīng)后測定各管吸光度，計算出iNOS活性達(dá)到最大時所需BH4的飽和濃度為2.34μmol/L了，此濃度下所測得的吸光度為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度。
2.3.3測定化合物的活性百分率配制藥物濃度為BH4飽和濃度的48倍，按2.3.1測試方法測定各化合物吸光度，并計算出活性百分率。
活性百分率＝(測定管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×100％2.3.4化合物IC50(半數(shù)抑制濃度)的測定根據(jù)前一次試驗(yàn)BH4飽和濃度測定結(jié)果，以及藥物的抑制百分率達(dá)100％的藥物濃度，配置以下幾個劑量，分別為BH4飽和濃度的32倍、24倍、18倍、13.5倍(劑量比為1∶0.75)。實(shí)驗(yàn)中每個試管中加入的iNOS和BH4的濃度是固定的。測得各管在530nm處的吸光度，用直線回歸的方法計算出各自的半數(shù)抑制濃度。
2.3.5化合物激活iNOS活性的測定根據(jù)2.3.3所測結(jié)果，活性百分率超過50％的化合物，在不加入BH4的情況下，按2.3.1測試方法，測得各樣品(濃度為BH4飽和濃度的48倍)在530nm處的吸光度，并根據(jù)公式計算出活性百分率。
2.3.6化合物最小激活濃度的測定根據(jù)2.3.5所測結(jié)果，選擇激活iNOS活性較強(qiáng)的化合物，配置以下幾個劑量，分別為BH4飽和濃度的40倍、32倍、24倍、16倍。在不加入BH4的情況下，按2.3.1測試方法，測得各樣品在530nm處的吸光度，用直線回歸的方法計算出各自的iNOS最小激活濃度。
2.4生物活性的測試結(jié)果2.4.1化合物影響iNOS的活性百分率本文共測試了66個化合物對iNOS活性的影響，結(jié)果見表2。
表2 N2-芳甲?；?4-氨/胺基蝶啶類化合物影響iNOS的活性百分率


注(1)樣品測試濃度為BH4飽和濃度的48倍，即112.3μmol/L。
(2)“+”代表樣品對iNOS具有激活作用(或促進(jìn)作用)，“-”代表樣品對iNOS具有抑制作用，“0”代表樣品對iNOS既無激活作用也無抑制作用。
由表2可知在所測試的66個化合物中，35個化合物對iNOS具有部分抑制作用，沒有一個化合物能完全抑制iNOS的活性，即沒有達(dá)到-100％；30個化合物具有iNOS激活作用，促進(jìn)了NO的生成，有不少化合物對iNOS激活率超過+100％；1個化合物對iNOS既無促進(jìn)也無抑制作用。
2.4.2化合物對iNOS的抑制效果根據(jù)表2結(jié)果，選擇對iNOS活性率在-50％以下的化合物測定IC50，測試結(jié)果見表3。
表3 化合物對iNOS的抑制效果

2.4.3化合物對iNOS的激活作用根據(jù)表2結(jié)果，選擇活性率大于50％的化合物在不加入BH4的情況下測定其對iNOS的活化作用，結(jié)果見表4。
表4 化合物對iNOS的激活作用


注(1)樣品測試濃度為BH4飽和濃度的48倍，即112.3μmol/L。
(2)激活率為無BH4情況下樣品的活性百分率，按2.3.3所列公式計算。
以上結(jié)果表明受試化合物即使在沒有BH4存在的條件也可以使iNOS具有活性催化作用，而且有些化合物在測試濃度下，對iNOS的激活作用甚至強(qiáng)于BH4。
2.4.4化合物對iNOS的最小有效激活濃度根據(jù)表4的測試結(jié)果，選擇激活率在70％以上的化合物按照2.3.6的測試方法進(jìn)行最小激活濃度的測試，結(jié)果見表5。
表5 化合物的最小有效激活濃度

測試結(jié)果顯示，上述7個受試樣品在一定濃度下可以完全替代BH4的作用，激活iNOS的活性，從而促使NO的產(chǎn)生。
在這些化合物中，都是芳甲?；膶ξ挥腥〈⑶椅娮踊鶊F(tuán)占多數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種具有下述化學(xué)式(I)表示的N2-芳甲?；?4-氨/胺基-蝶啶化合物 R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲?；换騌1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；?。R1或R2代表的芳甲酰基具有下列化學(xué)式(II)中的取代基 其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、C1～C5烷基、硝基、C1～C3烷氧基、C1～C3烷氨基、甲硫基、苯基、苯氧基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過3個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、三氟甲基、硝基、甲氧基、乙氧基、苯基、羥基等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H，取代基、無取代基的C1～C6直鏈、支鏈烷基，或芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基；或NR3R4代表肟基、乙烯亞胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或單或雙取代的三元～五元脂肪環(huán)胺；R5代表H；取代或無取代的C1～C8直鏈、支鏈烷基，C1～C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代的或無取代的芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物(I)和其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲酰基；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲酰基。R1或R2代表的芳甲?；哂谢瘜W(xué)式(II)中的取代基其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、C1～C5烷基、硝基、C1～C3烷氧基、C1～C3烷氨基、甲硫基、苯基、苯氧基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過3個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、三氟甲基、硝基、甲氧基、乙氧基、苯基、羥基等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H，取代基、無取代基的C1～C6直鏈、支鏈烷基，或芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基；或NR3R4代表肟基、乙烯亞胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或單或雙取代的三元～五元脂肪環(huán)胺；R5代表H；取代或無取代的C1～C8直鏈、支鏈烷基，C1～C5直鏈或支鏈烷基或烷氧基取代的或無取代的芳基、芐基，或C3～C6脂肪環(huán)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的化合物，其中R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲?；?；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；?。R1或R2代表的芳甲?；哂谢瘜W(xué)式(II)中的取代基，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、甲基、乙基、丙基、異丙基、硝基、甲氧基、乙氧基、甲氨基、乙氨基、甲硫基、苯基、苯氧基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過2個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、三氟甲基、硝基、甲氧基、乙氧基、苯基、羥基等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，或苯基、芐基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基；或NR3R4代表肟基、乙烯亞胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、丙環(huán)胺基、戊環(huán)胺基；R5代表H；甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，或苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、芐基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3所述的化合物，其中R1和R2不同時代表H，同時各自代表相同或不同的芳甲酰基；或R1和R2中，一個代表H，另一個為芳甲?；?。R1或R2代表的芳甲?；哂谢瘜W(xué)式(II)中的取代基，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5可以相同或不同，并代表H、鹵素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、甲氨基、苯基、羥基、乙酰氨基、三氟甲基等，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中不超過2個為相同的Cl、Br、I、甲基、乙基、硝基、甲氧基、等；R3和R4相同或不同，各自獨(dú)立地表示H、甲基、乙基、丙基、異丙基，或苯基，或環(huán)丙基、環(huán)丁基；或NR3R4代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、丙環(huán)胺基；R5代表H；甲基、乙基，或苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、芐基。
5.權(quán)利要求1～4所述的化合物具有調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性的功能，它們可在制備調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性的藥物中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)力要求5所述的應(yīng)用，是制備預(yù)防和治療因體內(nèi)NO水平過高或不足而介導(dǎo)的疾病的藥物。
7.一種藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1～4中任意一項所述的化合物，并含有常規(guī)藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計和合成了一類具有對一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，縮寫為NOS)有調(diào)節(jié)作用的N
文檔編號A61P11/00GK1800182SQ20061003767
公開日2006年7月12日 申請日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者姚其正, 唐鋒, 李小亮, 華維一 申請人:中國藥科大學(xué)