專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雞特異性的CpG ODN及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種CpG DNA(CpG DNA是指含胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸基序的DNA)，特別是涉及用作雞特異性的CpG ODN(ODN是指寡核苷酸單鏈DNA)，以及這種CpG ODN作為H5亞型禽流感DNA疫苗佐劑的用途。
背景技術(shù)：
對(duì)高致病性禽流感(HPAI)的控制主要采用隔離封鎖疫點(diǎn)，撲殺銷(xiāo)毀感染和受威脅動(dòng)物，以及其他生物安全措施。鑒于經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償壓力等方面的制約，疫苗免疫接種亦已成為控制疫情的關(guān)鍵措施之一。目前應(yīng)用的油乳劑全病毒滅活疫苗具有效果確實(shí)、保護(hù)率高、免疫期長(zhǎng)和研制周期短等優(yōu)點(diǎn)。但是使用這種滅活苗也存在許多缺陷，主要有①影響疫情監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，無(wú)法區(qū)分免疫群和自然感染群；②不能激發(fā)局部粘膜免疫；③生產(chǎn)過(guò)程中存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)；④免疫應(yīng)激大，影響肉品品質(zhì)等。所以，開(kāi)展禽流感基因工程疫苗的研究，為禽流感的防制提供新型的免疫預(yù)防途徑是一種必然。重組病毒疫苗(如禽痘病毒疫苗等)接種商品雞時(shí)受母源抗體的影響較大。DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和粘膜免疫，兼有減毒活疫苗的有效性和亞單位疫苗的安全性，且不受母源抗體的干擾，可以非常容易操作質(zhì)粒DNA以改變免疫反應(yīng)的質(zhì)和量，并具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。許多研究表明，目前已構(gòu)建的許多H5亞型AIV HA基因的DNA疫苗質(zhì)粒雖可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)反應(yīng)，但仍存在DNA疫苗免疫原性弱，不如油乳劑滅活疫苗引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)等不足，所以需進(jìn)一步優(yōu)化，以增強(qiáng)其免疫效力。
CpG是由胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)磷酸連接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鳥(niǎo)嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。CpG DNA作為免疫增強(qiáng)劑已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的肯定，近年來(lái)的研究表明，人工合成的含一個(gè)或多個(gè)CpG的寡核苷酸單鏈DNA(CpG ODN)可表現(xiàn)強(qiáng)效的免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)作用。但由于序列，尤其是CpG兩側(cè)的序列的不同，CpG ODN可有多種多樣的形式，表現(xiàn)不同性質(zhì)、不同強(qiáng)度的免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)作用，而且其作用具有種屬特異性，中國(guó)專(zhuān)利00105728.6和03140821.4公開(kāi)了人特異性CpG ODN，中國(guó)專(zhuān)利200310106226.1公開(kāi)了適用于畜禽DNA疫苗佐劑的CpG ODN序列，中國(guó)專(zhuān)利02822715.8公開(kāi)了可用于非人動(dòng)物的CpG制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適用于雞的CpG ODN，其序列具體為5’-TTGGAACGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT-3’，如SEQ IDNO1所示。該序列經(jīng)人工合成，與已公開(kāi)的CpG ODN均不相同。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明所說(shuō)的CpG ODN作為H5亞型禽流感DNA疫苗佐劑的應(yīng)用。
嵌合了本發(fā)明CpG ODN為佐劑的H5亞型禽流感DNA疫苗，通過(guò)口服、滴鼻途徑對(duì)雞直按進(jìn)行免疫，可顯著增強(qiáng)H5亞型禽流感DNA疫苗免疫后的攻毒保護(hù)率，提高免疫家禽的腸粘膜IgA抗體水平；且本發(fā)明中構(gòu)建的DNA疫苗具有安全、免疫后不干擾禽流感疫情的監(jiān)測(cè)、可克服母源抗體的干擾(可用于雛禽免疫)及使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所說(shuō)的CpG ODN，作為一種雞特異性的免疫刺激序列，除作為H5亞型禽流感DNA疫苗佐劑外，也能有效增強(qiáng)雞其他疫苗(包括重組病毒疫苗等基因工程疫苗和滅活疫苗等)的免疫效果。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明的CpG單鏈脫氧核苷酸可通過(guò)已知的方法生產(chǎn)，例如固相亞磷酰胺三酯法合成。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實(shí)施例1CpG單鏈脫氧核苷酸的制備ODN序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，使用ABI39X系列合成儀，采用固相亞磷酰胺三酯法。
實(shí)施例2嵌合CpG的H5亞型禽流感DNA疫苗的制備一、H5亞型禽流感病毒HA cDNA編碼區(qū)和腦心肌炎病毒(ECMV)的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)片段的PCR擴(kuò)增1.引物的設(shè)計(jì)與合成用于擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒HA基因cDNA和腦心肌炎病毒(ECMV)的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)片段的引物，是參照已經(jīng)公布的序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5輔助設(shè)計(jì)而成。在引物的5’端加有酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下HA P1TACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTT (XhoI)HA P2ATGGGCCCTACAATCTGAACTCACA(ApaI)IRES P1TCGGATCCTGCATCTAGGGCGGCCAA (BamHI)IRES P2TTCTCGAGTTGTGGCAAGCTTATCATCGTG (XhoI)2.RT-PCR用Trizol提取H5亞型禽流感病毒接種的雞胚尿囊液總RNA，再以引物中的下游引物反轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的cDNA，最后用PCR方法擴(kuò)增出H5亞型禽流感病毒HA基因cDNA，擴(kuò)增片段的大小為1746bp。
3.用PCR擴(kuò)增ECMV的IRES片段以質(zhì)粒pIRES為模板，用PCR擴(kuò)增出ECMV的IRES片段，擴(kuò)增片段的大小為624bp。
二、重組質(zhì)粒pVAX1-HA-CpG的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pVAX1＝CpG的構(gòu)建合成的CpG片段的兩條互補(bǔ)序列分別用滅菌的超純水溶解，再各取等量加到0.5mlPCR管中混勻，在PCR儀上97℃變性10分鐘，取出置室溫自然冷卻。將退火后的CpG片段進(jìn)行5’端磷酸化(10μl體系)Kinase 10×buffer 1μlCpG片段(已退火) 6μl(約0.3μg)ATP(1mM) 1μlT4 Polynucleotide Kinase 2μlS.W. 1μl37℃水浴作用30min后，再65℃水浴作用8min，置室溫自然冷卻。合成的CpG片段兩端分別設(shè)計(jì)有XbaI和ApaI酶切位點(diǎn)，這樣合成后的兩條互補(bǔ)序列經(jīng)變性、退火及5’端磷酸化處理后就可用于下面的連接反應(yīng)。
真核表達(dá)載體pVAX1用XbaI和ApaI酶切，經(jīng)電泳、切膠回收后，用T4DNA連接酶與CpG片段相連(10μl體系)10×ligase buffer 1μlpVAX1(XbaI+ApaI)2μlCpG(XbaI+ApaI) 5μlT4DNA ligase1μlATP(5mM)1μl連有CpG片段的重組質(zhì)粒送到上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，以驗(yàn)證構(gòu)建的正確性。
2.重組質(zhì)粒pVAX1-HA-CpG的構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-CpG和pVAX1-HA(張小榮構(gòu)建，微生物學(xué)報(bào)，2004，44(2)157～161，HA基因兩側(cè)有HindIII和BamHI位點(diǎn))分別用HindIII和BamHI酶切，電泳后，分別切膠回收pVAX1-CpG和HA片段。用T4DNA連接酶連接這兩個(gè)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-HA-CpG。連接產(chǎn)物4℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌落接種LB肉湯(Kana+)，振蕩培養(yǎng)，小量法提取質(zhì)粒，用HindIII和BamHI雙酶切鑒定，得到構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1-HA-CpG。
三、電轉(zhuǎn)化用電穿孔法分別將pVAX1空載體質(zhì)粒、pVAX1-HA-CpG和pVAX1-HA各0.1μg(冰上預(yù)冷)轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌ST(冰上預(yù)冷)。
所獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別命名為ST(pVAX1)、ST(pVAX1-HA-CpG)和ST(pVAX1-HA)。
實(shí)施例3嵌合CpG的H5亞型禽流感DNA疫苗的免疫應(yīng)用將重組沙門(mén)氏菌ST(pVAX1-HA-CpG)和ST(pVAX1-HA)經(jīng)口服和滴鼻途徑首免3日齡商品代伊莎褐蛋雞，劑量為5×109CFU/只；并以禽流感油乳劑滅活疫苗免疫組、空載體ST(pVAX1)免疫組和空白組分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。首免后二周以相同的免疫劑量和免疫途徑加強(qiáng)免疫，二免后3周攻毒，以評(píng)估嵌合CpG DNA在減毒沙門(mén)氏菌ST運(yùn)送H5亞型禽流感核酸疫苗中的佐劑作用，見(jiàn)表1。
表1不同疫苗對(duì)商品代伊莎褐蛋雞的免疫保護(hù)效果

**p＜0.01，差異極顯著。
實(shí)驗(yàn)顯示，首免后二周和二免后三周，各重組沙門(mén)氏菌免疫組的血清HI抗體水平都很低，且與空載體組和空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(p＞0.05)；但以CpG為佐劑的免疫組，其腸道AIV特異性的IgA抗體與對(duì)照組比較有顯著性差異(p＜0.05)。攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，ST(pVAX1-HA-CpG)免疫組的攻毒保護(hù)率最高與ST(pVAX1-HA)免疫組和空白對(duì)照組相比差異極顯著(p＜0.01)。但油乳劑滅活疫苗免疫組在免疫后血清抗體水平和攻毒保護(hù)率方面都高于各重組沙門(mén)氏菌免疫組。
由以上實(shí)施例表明發(fā)明人成功地構(gòu)建了H5亞型AIV HA基因及嵌合CpG DNA的禽流感核酸疫苗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ST(pVAX1-HA-CpG)免疫組的保護(hù)率與對(duì)照組相比差異極顯著；且本研究構(gòu)建的重組沙門(mén)氏菌免疫后，能誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答。
SEQUENCE LISTING<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>一種雞特異性的CpG ODN及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CpG DNA<400>1ttggaacgtt cctttccaac gttggtttgc aacgttcctt 40
權(quán)利要求
1.一種雞特異性的CpG ODN，其序列具體為5’-TTGGAACGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT-3’，如SEQ IDNO1所示。
2.權(quán)利要求1所說(shuō)的CpG ODN，作為H5亞型禽流感DNA疫苗佐劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種CpG DNA，特別是涉及用作雞特異性的CpG ODN，以及這種CpG ODN作為H5亞型禽流感DNA疫苗佐劑的用途。該CpG ODN序列具體為5’－TTGGAA CGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT－3’，嵌合了本發(fā)明CpG ODN為佐劑的H5亞型禽流感DNA疫苗，通過(guò)口服、滴鼻途徑對(duì)雞直接進(jìn)行免疫，可顯著增強(qiáng)H5亞型禽流感DNA疫苗免疫后的攻毒保護(hù)率，提高免疫家禽的腸粘膜IgA抗體水平；且本發(fā)明中構(gòu)建的DNA疫苗具有安全、免疫后不干擾禽流感疫情的監(jiān)測(cè)、可克服母源抗體的干擾及使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/16GK1810823SQ200610038448
公開(kāi)日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日
發(fā)明者焦新安, 胡青海, 潘志明, 黃金林, 孫林, 殷月蘭, 唐麗華, 張成全 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)