專利名稱：一種姜提取物、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物及其新的制藥用途，具體涉及一種姜提取物，其制備方法及在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化是指肝臟纖維結(jié)締組織的過(guò)度沉積，是纖維增生和纖維分解不平衡的結(jié)果。纖維增生是機(jī)體對(duì)于損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，各種病因所致反復(fù)或持續(xù)的慢性肝實(shí)質(zhì)炎癥、壞死可導(dǎo)致肝臟持續(xù)不斷的纖維增生而形成肝纖維化，從許多慢性肝病，特別是慢性病毒性肝炎的臨床及病理演變來(lái)看，肝纖維化和肝硬化是連續(xù)的發(fā)展過(guò)程，二者難以截然分開(kāi)。
抗纖維化的治療旨在減輕纖維化的程度，延緩其發(fā)展，乃至逆轉(zhuǎn)其病理進(jìn)程?，F(xiàn)有技術(shù)中，主要采用下列方法一是用干擾素等抑制膠原合成；二是用秋水仙堿等藥物抑制微管蛋白聚合，從而干擾細(xì)胞的膠原分泌。而通過(guò)促進(jìn)膠原降解的方法進(jìn)行治療，以及基因治療等方法則尚在研究之中。有多種中藥被報(bào)道具有護(hù)肝作用，但目前尚未見(jiàn)到生姜用于治療肝纖維化的報(bào)道。
生姜是一種傳統(tǒng)中藥，它具有散寒解表、溫中止嘔、化痰止咳和解毒等功效，可用于風(fēng)寒感冒、咳嗽、胃寒嘔吐等疾病?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生姜中的主要有效成分為姜辣素，包括姜酚(gingerol)，姜酮(zingerone)和姜烯酮(shogaol)等，其中又以姜酚最為重要，其含量直接影響到生姜制劑的質(zhì)量和功效。
當(dāng)用于制備藥物時(shí)，需要提取姜的有效成份。常見(jiàn)的提取方法是乙醇循環(huán)法，但其提取率低，獲得的姜酚含量低。因而，近兩年，開(kāi)始出現(xiàn)了采用超臨界二氧化碳萃取生姜油的報(bào)道。采用這類(lèi)方法獲得的姜提取物——生姜油中，姜辣素的含量通常在10％～20％之間。
滴丸作為一種藥物劑型，可以使藥物以恒定速度溶出，控釋滴丸的作用可達(dá)數(shù)日，因而適于制備需要較長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用的藥物。然而，滴丸的載藥量小，多數(shù)滴丸的重量小于100毫克，由此需要進(jìn)一步富集藥物的有效成份或有效部位。上述生姜油中姜辣素的含量顯然還不能適于制作滴丸的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種姜提取物的新的用途，以及適于該用途的制備姜提取物的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種姜提取物的制備方法，包括下列步驟，(1)將干姜粉碎至粒度30-50目，作為制備原料；(2)采用超臨界二氧化碳流體萃取方法萃取，萃取壓力24-30MPa，溫度42-45℃，反應(yīng)3-6小時(shí)，CO2流速為9-10kg/h.kg原料；經(jīng)萃取的流體分別經(jīng)過(guò)兩級(jí)解析，所述第一級(jí)解析的壓力為12-14MPa，溫度為56-60℃，第二級(jí)解析的壓力為6-7MPa，溫度為38-42℃；將上述萃取獲得的淡黃色姜油用柱層析法進(jìn)行分離，使得姜辣素的含量大于50％，獲得所需的姜提取物。
本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述方法制備獲得的姜提取物。
以及所獲得的姜提取物在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
較優(yōu)選的方案是，所述的藥物劑型為滴丸。
上述技術(shù)方案中，超臨界CO2流體(SFE-CO2)萃取流程如下CO2鋼瓶→冷凍系統(tǒng)→高壓泵→萃取釜→解析釜I→解析釜II→循環(huán)。
經(jīng)過(guò)超臨界二氧化碳萃取獲得的姜油，為淡黃色油狀物，其具有濃烈的鮮姜天然香氣和辛辣味，經(jīng)GC-MS定性定量鑒定了59個(gè)成分，姜辣素的含量為13.09％，其中，姜酚(gingerol)1.78％，姜烯酚(shogaol)2.36％，姜酮(zingerone)3.52％，姜烯(Zangiberene)4.43％，其他50多種單萜、倍半萜類(lèi)物質(zhì)，相對(duì)含量為46.83％。
將上述姜油采用柱層析的方法進(jìn)一步提取，得到精制姜油，測(cè)定提取物中姜辣素的含量大于50％，為本發(fā)明所需的姜提取物。
為了更好地解決主要藥效成分姜酚的穩(wěn)定性，將部分精制姜油用β-CD包合。緩釋滴丸處方設(shè)計(jì)中同時(shí)含有提取物和包合物兩部分，調(diào)節(jié)二者的比例，獲得不同的釋藥效果。
滴丸的制備方法是稱取一定量的輔料，加熱熔融后加蓋密閉并保溫60℃，滴入甲基硅油中冷凝，待收縮成丸后，收集丸粒，吸去表面黏附的冷卻劑，放入干燥器干燥即得。
優(yōu)選使用水溶性載體PEG6000制成固體分散體，使藥物分子不易形成聚集體，或使微粒不易形成聚附體，保證了藥物的高度分散性，加快藥物的溶出和吸收，構(gòu)成緩釋滴丸的速釋部分。優(yōu)選使用水不溶性的硬脂醇、β-CD的包合對(duì)藥物釋放起阻滯作用，構(gòu)成緩釋滴丸的緩釋部分。用本法制成姜油緩釋滴丸，使藥物在體內(nèi)緩慢釋藥達(dá)12h，故處方篩選的依據(jù)定為2h釋藥約40％，10h釋藥80％以上，制劑服用后既可使血藥濃度快速達(dá)到治療范圍，又能持續(xù)維持一段時(shí)間的藥物濃度。
對(duì)上述制劑的藥效研究表明1.在整體動(dòng)物急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，精制姜油具有明顯的保肝作用，它可抑制四氯化碳和醋氨酚所致動(dòng)物血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高(表1、表2)；使升高的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯降低(表3)，精制姜油還可降低由四氯化碳損傷引起的肝細(xì)胞丙二醛(MDA)含量升高和超氧化歧化酶(SOD)活性升高(表4)。病理學(xué)檢查表明，精制姜油同時(shí)可明顯改善急性肝損傷動(dòng)物的肝臟顯微結(jié)構(gòu)。精制姜油對(duì)四氯化碳和H2O2誘導(dǎo)的BRL肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用(表5)，可使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯降低(表5)。
2.在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型中，用精制姜油治療后可明顯改善肝纖維化的程度，降低大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的升高(表6、表7)，并可提高血清總蛋白(TP)和白蛋白(Alb)含量(表8)，明顯減少肝組織中的膠原纖維沉積和假小葉的形成。
3.精制姜油的保肝作用可能機(jī)制主要與其抗氧化有關(guān)，包括降低丙二醛(MDA)，增加超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)的活性(表9、表10)。它的抗肝纖維化作用機(jī)制，除了抗氧化作用外，還包括通過(guò)降低體內(nèi)的轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活作用(表11)，減少膠原的合成以及降低基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的抑制作用而增加膠原的分解(表12)。
經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，精制姜油小鼠口服的LD50為20ml/kg，95％可信限為18.7-21.2ml/kg。對(duì)中毒致死小鼠尸解，未見(jiàn)心、肝、脾、肺、腎、腦等主要實(shí)質(zhì)性臟器有明顯的病理改變。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明提出了姜提取物在制備抗肝纖維化的藥物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)表明，其保肝和抗肝纖維化的作用是十分顯著的，可以用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的保肝和抗肝纖維化藥物。
2.由于姜提取物是純天然物質(zhì)，在對(duì)抗肝纖維化的過(guò)程中，不會(huì)產(chǎn)生其它副作用。
3.本發(fā)明通過(guò)控制解析的參數(shù)，以及采用柱層析法作進(jìn)一步精制，獲得了姜辣素含量大于50％的姜提取物，因而可以用于滴丸劑型的制備。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一姜提取物的制備超臨界CO2流體(SFE-CO2)萃取流程如下CO2鋼瓶→冷凍系統(tǒng)→高壓泵→萃取釜→解析釜I→解析釜II→循環(huán)。
萃取的參數(shù)為萃取釜壓力為24mpa、溫度為42℃，解析釜I的壓力為12.4mpa，溫度為60℃，解析釜II的壓力為6.5mpa，溫度為40℃，CO2流速為10kg/h.kg原料，時(shí)間為4-6小時(shí)。
中藥材干姜粉碎過(guò)篩，粒度30-50目，稱取10kg投入萃取釜中，經(jīng)過(guò)4-6小時(shí)萃取后，從解析釜I和解析釜II中出料，為淡黃色的姜油180g，其具有濃烈的鮮姜天然香氣和辛辣味，經(jīng)放置后，底部有少量黃色沉淀。
經(jīng)GC-MS定性定量鑒定了59個(gè)成分，姜辣素的含量為13.09％，其中，姜酚(gingerol)1.78％，姜烯酚(shogaol)2.36％，姜酮(zingerone)3.52％，姜烯(Zangiberene)4.43％，其他50多種單萜、倍半萜類(lèi)物質(zhì)，相對(duì)含量為46.83％。
將上述姜油采用柱層析的方法進(jìn)一步提取，得到精制姜油，測(cè)定提取物中姜辣素的含量大于50％，即為所獲得的姜提取物。
實(shí)施例二用于防治肝纖維化的滴丸的制備以實(shí)施例一獲得的姜提取物作為滴丸內(nèi)容藥物，為了更好地解決主要藥效成分姜酚的穩(wěn)定性，將部分精制姜油用β-CD包合。緩釋滴丸處方設(shè)計(jì)中同時(shí)含有提取物和包合物兩部分，調(diào)節(jié)二者的比例，獲得不同的釋藥效果。
對(duì)滴丸劑的輔料及配比首先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。稱取一定量的輔料，加熱熔融后加蓋密閉并保溫60℃，滴入甲基硅油中冷凝，待收縮成丸后，收集丸粒，吸去表面黏附的冷卻劑，放入干燥器干燥即得。對(duì)各處方滴制成丸的難易情況從以下幾個(gè)方面評(píng)價(jià)圓整度、硬度、料液的黏度、流動(dòng)性、易滴制程度等。
預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，選定的處方隨著PEG4000或PEG6000用量的增加，適當(dāng)加大水不溶性載體的用量，系統(tǒng)地考察和篩選緩釋滴丸劑的處方，選取方中EG6000，PEG20000，硬脂醇用量以及精制姜油中姜酚與β-CD包合物的配比為考察因素，每個(gè)因素各取4個(gè)水平，采用L16(45)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，以0～12h滴丸劑內(nèi)姜酚的累積百分釋放量(F)為考察指標(biāo)，考察滴丸劑的緩釋效果。
釋放度試驗(yàn)參照《中國(guó)藥典)2000版第一部轉(zhuǎn)溶法項(xiàng)下操作。精密稱取樣品適量(相當(dāng)于姜酚60mg)，量取pH 1.2人工胃液500mL注入溶出杯中，控制溫度(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為(100±1)r·min-1，1，2h后取樣5mL，2h后轉(zhuǎn)移至pH6.8的人工腸液中繼續(xù)釋放，分別于4，6，8，10，12h定時(shí)取樣5mL，0.8μm微孔濾膜過(guò)濾，同時(shí)補(bǔ)充同體積同溫度的溶出介質(zhì)。棄去初濾液，續(xù)濾液按給定的色譜條件測(cè)定含量，由此獲得不同時(shí)間藥物的累積釋放量。
優(yōu)選使用水溶性載體PEG6000制成固體分散體，使藥物分子不易形成聚集體，或使微粒不易形成聚附體，保證了藥物的高度分散性，加快藥物的溶出和吸收，構(gòu)成緩釋滴丸的速釋部分。優(yōu)選使用水不溶性的硬脂醇、β-CD的包合對(duì)藥物釋放起阻滯作用，構(gòu)成緩釋滴丸的緩釋部分。用本法制成姜油緩釋滴丸，使藥物在體內(nèi)緩慢釋藥達(dá)12h，故處方篩選的依據(jù)定為2h釋藥約40％，10h釋藥80％以上，制劑服用后既可使血藥濃度快速達(dá)到治療范圍，又能持續(xù)維持一段時(shí)間的藥物濃度。
實(shí)施例三姜提取物滴丸治療肝纖維化的應(yīng)用試驗(yàn)以實(shí)施例二獲得的姜提取物滴丸進(jìn)行各種對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下列各表，表明1.在整體動(dòng)物急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，精制姜油具有明顯的保肝作用，它可抑制四氯化碳和醋氨酚所致動(dòng)物血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高(表1、表2)；使升高的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯降低(表3)，精制姜油還可降低由四氯化碳損傷引起的肝細(xì)胞丙二醛(MDA)含量升高和超氧化歧化酶(SOD)活性升高(表4)。病理學(xué)檢查表明，精制姜油同時(shí)可明顯改善急性肝損傷動(dòng)物的肝臟顯微結(jié)構(gòu)。精制姜油對(duì)四氯化碳和H2O2誘導(dǎo)的BRL肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用(表5)，可使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯降低(表5)。
2.在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型中，用精制姜油治療后可明顯改善肝纖維化的程度，降低大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的升高(表6、表7)，并可提高血清總蛋白(TP)和白蛋白(Alb)含量(表8)，明顯減少肝組織中的膠原纖維沉積和假小葉的形成。
3.精制姜油的保肝作用可能機(jī)制主要與其抗氧化有關(guān)，包括降低丙二醛(MDA)，增加超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)的活性(表9、表10)。它的抗肝纖維化作用機(jī)制，除了抗氧化作用外，還包括通過(guò)降低體內(nèi)的轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活作用(表11)，減少膠原的合成以及降低基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的抑制作用而增加膠原的分解(表12)。
經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，精制姜油小鼠口服的LD50為20ml/kg，95％可信限為18.7-21.2ml/kg。對(duì)中毒致死小鼠尸解，未見(jiàn)心、肝、脾、肺、腎、腦等主要實(shí)質(zhì)性臟器有明顯的病理改變。
表1精制姜油對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用(n＝10，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2精制姜油對(duì)醋氨酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用(n＝10，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3對(duì)大鼠CCl4肝細(xì)胞損傷后ALT、AST的影響(n＝4，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4對(duì)大鼠CCl4致肝細(xì)胞損傷后SOD、MDA的影響(n＝4，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表5對(duì)大鼠H2O2致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(n＝4，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01表6對(duì)大鼠CCl4肝纖維化血清ALT和AST的影響(n＝10，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01表7對(duì)大鼠CCl4肝纖維化血清HA和LN的影響(n＝8，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01
表7

表11對(duì)大鼠CCl4肝纖維化血清TGF-β1的影響(n＝8，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01表12對(duì)大鼠CCl4肝纖維化血清TIMP-1mRNA的影響(n＝10，x±s)

與正常對(duì)照組比較，ΔΔP＜0.01；與肝損傷模型組相比較，*P＜0.05，**P＜0.0權(quán)利要求
1.一種姜提取物的制備方法，包括下列步驟，(1)將干姜粉碎至粒度30-50目，作為制備原料；(2)采用超臨界二氧化碳流體萃取方法萃取，萃取壓力24-30MPa，溫度42-45℃，反應(yīng)3-6小時(shí)，CO2流速為9-10kg/h.kg原料；其特征在于經(jīng)萃取的流體分別經(jīng)過(guò)兩級(jí)解析，所述第一級(jí)解析的壓力為12-14MPa，溫度為56-60℃，第二級(jí)解析的壓力為6-7MPa，溫度為38-42℃；將上述萃取獲得的淡黃色姜油用柱層析法進(jìn)行分離，使得姜辣素的含量大于50％，獲得所需的姜提取物。
2.權(quán)利要求1所述方法制備獲得的姜提取物。
3.權(quán)利要求1獲得的姜提取物在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物劑型為滴丸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種姜提取物及其制備方法，結(jié)合超臨界二氧化碳流體萃取和柱層析方法，獲得了姜辣素含量大于50％的姜提取物。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了這種姜提取物在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明獲得的姜提取物，在保肝和抗肝纖維化方面的作用十分顯著，可以用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的保肝和抗肝纖維化藥物；并且，由于獲得了姜辣素含量大于50％的姜提取物，因而可以用于滴丸劑型的制備。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1857701SQ20061003876
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者孫曉飛, 謝梅林, 耿濤 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)