專利名稱：高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，以及這種方法的制品在抗血管生成治療中的應(yīng)用，屬于基因工程生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鼠內(nèi)皮抑素(endostatin)基因最早是在1997年被Folkman博士領(lǐng)導(dǎo)的科研小組研究發(fā)現(xiàn)，這是一種內(nèi)源性血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑[O′Reilly MS，et al，EndostatinAn endogenous inhibitor of angiogensis andtumor growth，Cell，1997，88(2)277]，并且是一種從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的高活性不溶性重組鼠內(nèi)皮抑素，采用皮下注射這種不溶性內(nèi)皮抑素抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)作用十分明顯。內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)特征具有特殊性，偏酸性穩(wěn)定性和有二對(duì)二硫鍵，使其在中性和堿性環(huán)境下活性和溶解性不穩(wěn)定，易失活，導(dǎo)致自然折疊率很低，通常狀況下99％的重組內(nèi)皮抑素以沉淀形式存在。為了使其可溶，人們想了不少辦法。美國(guó)首先改用酵母表達(dá)系統(tǒng)以產(chǎn)生可溶性分泌性重組人內(nèi)皮抑素，現(xiàn)處于II期臨床階段。但內(nèi)皮抑素可溶并不代表活性高，采用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組內(nèi)皮抑素在臨床研究中未顯示出人們期望的高活性和高療效。我國(guó)也有從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的可溶性融合蛋白人血管內(nèi)抑素，但由于結(jié)構(gòu)上作出的微小變化會(huì)產(chǎn)生不同的活性變化，融合蛋白部分有時(shí)會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生抗體而使活性減弱和療效降低。我國(guó)還有采用分子伴侶及16℃-25℃發(fā)酵等方法解決重組人內(nèi)皮抑素可溶問(wèn)題的報(bào)道，但這些均不能滿足工業(yè)化大規(guī)模高活性可溶重組蛋白的制備問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)改進(jìn)重組人內(nèi)皮抑素的制備工藝，提供一種以重組大腸桿菌為原料，制備高活性可溶重組未改構(gòu)的天然人內(nèi)皮抑素注射劑的方法，進(jìn)而以該方法為基礎(chǔ)形成日產(chǎn)規(guī)模克級(jí)以上、年產(chǎn)千克級(jí)規(guī)模、高活性可溶重組蛋白純度大于96％的高收率大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)，以滿足該產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中毫克級(jí)大劑量、較長(zhǎng)時(shí)期重復(fù)使用的需求，從而有效地推動(dòng)重組人內(nèi)皮抑素在抗血管生成疾病治療中的臨床應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，以表達(dá)人皮抑素基因的重組大腸桿菌菌體為原料，經(jīng)過(guò)提取、復(fù)性和純化的工業(yè)化處理過(guò)程獲得重組人內(nèi)皮抑素蛋白，進(jìn)而配制成重組人內(nèi)皮抑素注射劑，其特征在于所述工業(yè)化處理過(guò)程具體包含以下兩個(gè)步驟——(1)從菌體中提取純度大于82％的包涵體蛋白首先將包涵體用洗滌液A及異丙醇分別離心沉淀，去除雜蛋白、脂質(zhì)及核酸，再用提取液B溶解包涵體，用稀釋液C稀釋使目的蛋白析出，分離后將沉淀物用緩沖液洗滌，并用溶解液溶解，獲得純度大于82％的內(nèi)皮抑素包涵體；(2)向步驟(1)獲得的純度大于82％的內(nèi)皮抑素包涵體當(dāng)中緩慢滴入復(fù)性液D進(jìn)行復(fù)性，然后超濾濃縮，再用陰離子交換樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，獲得純度為96％以上的重組人內(nèi)皮抑素蛋白。
進(jìn)一步地，上述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其中步驟(1)進(jìn)行二次提取包涵體的過(guò)程當(dāng)中，所述的洗滌液A含有1-50mmol/L的Tris-HCL、0.5-10mmol/L的EDTA、0.5-10mmol/L的2-巰基乙醇、0.01-1Wt％的Triton X-100以及20-50Wt％的異丙醇，并分3-7步離心洗滌包涵體；所述的提取液B含有1-6mol/L的鹽酸胍、0.5-2％的巰基乙醇；所述的稀釋液C含有1-50mmol/L的Tris-HCL、0.1-1mol/L的NaCl，其pH值為7.0-8.0。步驟(2)進(jìn)行復(fù)性過(guò)程當(dāng)中，所述的復(fù)性液D含有2-50mmol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液、0.1-2mmol/L的還原型谷胱甘肽、0.05-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽；并且，步驟(2)中所述陰離子交換樹(shù)脂是DEAE-Sepharose，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是SP-Sepharose，它們均為每天可以對(duì)10克以上樣品進(jìn)行分離純化并能獲得純度≥96％的重組蛋白的大容量分離樹(shù)脂。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要體現(xiàn)在大大改進(jìn)了重組人內(nèi)皮抑素大規(guī)模制備過(guò)程中的提取、復(fù)性和純化工藝，應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)方案可以制備獲得蛋白純度在96％以上的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑，每立升發(fā)酵物能夠得到40-50mg純品，年制備量可達(dá)到數(shù)千克以上。通過(guò)體內(nèi)外活性測(cè)定，表明這種工業(yè)化制備工藝可從大腸桿菌中生產(chǎn)出高活性可溶的大批量重組人內(nèi)皮抑素產(chǎn)品，該產(chǎn)品在治療依賴血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的療效。


圖1重組人內(nèi)皮抑素表達(dá)電泳圖；圖2重組人內(nèi)皮抑素粗包涵體電泳圖；圖3重組人內(nèi)皮抑素精包涵體電泳圖；圖4重組人內(nèi)皮抑素DEAE-Sepharose陰離子交換純化電泳圖；圖5重組人內(nèi)皮抑素SP-Sepharose陽(yáng)離子交換純化電泳圖；圖6重組人內(nèi)皮抑素純度電泳圖；圖7重組人內(nèi)皮抑素HPLC純度分析圖；圖8重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)活性測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
重組內(nèi)皮抑素通過(guò)大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物99％以上是不溶的，這種不溶解的沉淀內(nèi)皮抑素蛋白皮下注射反而活性高，但不能靜脈注射。不同制備方法甚至不同表達(dá)系統(tǒng)制備出可溶性重組內(nèi)皮抑素有的有活性，有的活性低，有的則沒(méi)有活性。有的可溶性不穩(wěn)定需要添加溶解輔助劑助溶，有的溶解性好的重組內(nèi)皮抑素靜脈注射反而活性低，療效低。以至于國(guó)際上出現(xiàn)對(duì)內(nèi)皮抑素作用的許多學(xué)術(shù)爭(zhēng)論和一些療效疑問(wèn)。另外I期臨床試驗(yàn)采用劑量達(dá)30-240mg/m2，II期-III期臨床試驗(yàn)中采用7.5mg/m2到15mg/m2以上，與一般重組蛋白微克級(jí)用量相比，重組人內(nèi)皮抑素用量較大，使用周期又需要較長(zhǎng)時(shí)間抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，所以必須具備大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)出高活性可溶千克級(jí)規(guī)模以上重組人內(nèi)皮抑素才可滿足臨床廣泛應(yīng)用的需要。
在利用大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)重組人內(nèi)皮抑素蛋白的過(guò)程中，其可溶性部分不足1％，99％以上以不溶的包涵體形式存在，除非采用分子伴侶和在16℃左右進(jìn)行發(fā)酵，或采用助溶劑進(jìn)行助溶，也有用分泌型載體進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)。但這樣操作難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及活性難以控制穩(wěn)定。所以如何將不溶的包涵體沉淀蛋白轉(zhuǎn)換成高活性的可溶性蛋白，并能滿足臨床毫克級(jí)劑量的大量需求，這是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)所在。
本發(fā)明采用50-500立升發(fā)酵罐常規(guī)溫度發(fā)酵表達(dá)，對(duì)溫控誘導(dǎo)的DH5α工程菌采用30℃-42℃誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)工程菌在37℃常規(guī)溫度中誘導(dǎo)表達(dá)，有利于GMP工廠原有設(shè)備條件的充分利用，不需要進(jìn)行工藝路線技術(shù)改造，并且每升發(fā)酵液可獲濕菌體達(dá)20克以上(說(shuō)明50升發(fā)酵罐中僅放35升發(fā)酵液，70％---700克濕菌體)，比低溫發(fā)酵所獲菌量大，大規(guī)模發(fā)酵中目的蛋白仍可占總菌體蛋白的30％以上，基因表達(dá)效率較高，保證了發(fā)酵環(huán)節(jié)可獲足夠量的菌體和目的蛋白，產(chǎn)品收率1升發(fā)酵液獲純品40mg以上，滿足千克級(jí)重組蛋白大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
濕菌通過(guò)洗滌和加入溶菌酶后通過(guò)超聲破碎或高壓勻漿機(jī)破碎，使菌體內(nèi)部的內(nèi)皮抑素包涵體全部釋放出來(lái)。將包涵體分別通過(guò)含Tris-HCl、EDTA、2-巰基乙醇、TritonX-100、尿素、異丙醇等不同成分的洗滌液多步洗滌，分別除去雜質(zhì)、脂質(zhì)、雜蛋白和脂多糖，將經(jīng)多步洗滌后的包涵體粗品用含鹽酸胍和巰基乙醇的復(fù)性液提取溶解包涵體，溶解后的包涵體稱包涵體初提取液。再向包涵體初提取液中加入含Tris-HCl和NaCl的稀釋液稀釋到重組蛋白再次析出，通過(guò)該步的析出獲得沉淀再溶解，這稱為二步包涵體提取法，通過(guò)這特殊工藝處理最終制備的重組內(nèi)皮抑素耐受NaCl處理，并使后續(xù)工藝中制品穩(wěn)定性和溶解性提高，使包涵體純度大大提高，可達(dá)純度82％以上，為后續(xù)的蛋白質(zhì)復(fù)性和離子交換純化工藝提供了方便，也有利于大規(guī)模工業(yè)化純化。
包涵體精純化后雖然純度大大提高，由于重組人內(nèi)皮抑素含二對(duì)二硫鍵，需要在適宜條件下重新折疊，還原成具有正確空間構(gòu)像及分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的生物活性分子，形成正確的二硫鍵配對(duì)和分子折疊還原成天然正常的空間構(gòu)像，從而獲得天然的高比活性。這一過(guò)程是重組蛋白質(zhì)下游處理的關(guān)鍵技術(shù)，直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量和得率。正確的復(fù)性技術(shù)與復(fù)性劑濃度、重組蛋白的濃度和純度、所用復(fù)性劑的氧化還原體系、pH、離子強(qiáng)度等多種因素都密切相關(guān)，復(fù)性條件不適宜，會(huì)出現(xiàn)分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配，分子間共價(jià)或疏水結(jié)合成聚合體，一方面降低重組蛋白的活性，同時(shí)又會(huì)產(chǎn)生析出影響得率。重組蛋白質(zhì)復(fù)性其中最重要的影響因素之一是重組蛋白質(zhì)的純度、濃度及溶解度，重組蛋白質(zhì)如達(dá)不到一定的純度，其中的雜蛋白在復(fù)性中易于降低重組蛋白質(zhì)的活性，同時(shí)極易聚合析出，帶走大量重組蛋白質(zhì)，降低得率。一般認(rèn)為復(fù)性時(shí)重組蛋白質(zhì)的純度需達(dá)到80％以上，本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)兩步提取包涵體工藝使重組蛋白質(zhì)的純度達(dá)82％以上，并增加了重組蛋白質(zhì)溶解性和穩(wěn)定性。因此在復(fù)性過(guò)程中可提高復(fù)性效率和提高活性。復(fù)性過(guò)程中將蛋白濃度調(diào)整至7-10mg/ml，并用較大體積復(fù)性罐加入含有氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽的復(fù)性液中復(fù)性，這種復(fù)性方式簡(jiǎn)便有效，有利于工業(yè)化大規(guī)模復(fù)性操作，然后將復(fù)性液超濾濃縮，通過(guò)緩沖液平衡去除復(fù)性劑后即可進(jìn)行色譜分離。
在解決重組人內(nèi)皮抑素包涵體純化和復(fù)性問(wèn)題后，首選的色譜分離技術(shù)為吸附色譜方法，采用二步離子交換法，進(jìn)一步純化出純度達(dá)96％以上的重組人內(nèi)皮抑素。由于考慮到該產(chǎn)品臨床用量為毫克級(jí)，年產(chǎn)需千克級(jí)以上水平才可滿足臨床用量，所以本發(fā)明解決大容量快速和簡(jiǎn)便的純化工藝技術(shù)問(wèn)題，首先選擇DEAE陰離子樹(shù)脂以吸附雜蛋白和去除熱原質(zhì)，再采用SP陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離，如采用SP-sepharose吸附交換重組人內(nèi)皮抑素的容量較大，采用100ml柱就可達(dá)到克級(jí)水平的分離效果。通過(guò)二步離子交換純化，采用醋酸鈉緩沖液進(jìn)行超濾透析，平衡后進(jìn)行電泳鑒定和體內(nèi)外活性測(cè)定，就可獲得純度達(dá)96％以上高活性可溶的重組人內(nèi)皮抑素，并且每100立升發(fā)酵物可得到4克以上重組人內(nèi)皮抑素純品。采用500立升發(fā)酵罐70％容量發(fā)酵，一罐發(fā)酵可獲15克以上純品。通過(guò)以上工業(yè)化制備工藝就可達(dá)到日產(chǎn)克級(jí)以上重組蛋白以供臨床應(yīng)用所需。這么大規(guī)模的重組蛋白工業(yè)化制備工藝制備出的產(chǎn)品，純度超過(guò)一般重組蛋白95％純度標(biāo)準(zhǔn)要求，可溶性好，并每批次通過(guò)體外、體內(nèi)活性測(cè)定保證了產(chǎn)品的高活性。
本發(fā)明達(dá)成工業(yè)化大規(guī)模純化重組人內(nèi)皮抑素的制備工藝，使99％不溶的內(nèi)皮抑素蛋白成為高活性可溶重組蛋白，并在依賴血管生成疾病的抗血管生成治療中得到應(yīng)用。血管生成通常有兩種方式，正常的血管生成一般見(jiàn)于創(chuàng)傷愈合、胎兒和胚胎的發(fā)育、黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤的形成。而這里所指的依賴血管生成疾病的血管生成是一種持續(xù)的、不受調(diào)節(jié)的血管生成，大量見(jiàn)于病態(tài)、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管內(nèi)皮細(xì)胞異常生長(zhǎng)的疾病依賴性血管生成或稱為血管生成相關(guān)性疾病。這里所述屬于依賴血管生成疾病類型有以下兩類(1)用于治療血管生成介導(dǎo)性、依賴性或相關(guān)性疾病包括但不限于良性腫瘤，如血管瘤；實(shí)體腫瘤；血生腫瘤如白血??；腫瘤轉(zhuǎn)移；聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)瘤；毛細(xì)血管擴(kuò)張；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼血管生成疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病，早熟性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，新血管性青光眼，晶狀體后的纖維組織形成；蝕斑新血管化；冠狀側(cè)突；大腦側(cè)突；動(dòng)靜脈畸形；局部缺血性肢血管生成；血友病患者關(guān)節(jié)??；血管纖維瘤；生膿性肉芽腫；瘢痕瘤。
(2)也用于治療內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)量或異常刺激引起的疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化；硬皮??；腸粘連；肥大性疤痕；貓抓??；幽門螺桿菌引起的胃潰瘍。
下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1純度大于82％的內(nèi)皮抑素包涵體的提取基因工程菌DH5α或Bl21(DE3)由本單位保藏，內(nèi)皮抑素重組質(zhì)粒pBV220-Endostatin或pET9c-Endostatin由本發(fā)明人構(gòu)建并保藏。利用工程菌重組內(nèi)皮抑素大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)，這是公眾知曉通用技術(shù)，故描述從略。將發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體作為本發(fā)明的原料。
采用50立升發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，獲濕菌約700克左右，采用500立升發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，可獲濕菌約5公斤以上。按每克濕菌加入10ml、20mol/L Tris-HCl pH8.0洗滌菌體，4℃離心7000rpm 10分后棄上清，然后每克濕菌加入溶菌酶1mg/ml，50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)緩沖液10ml，4℃攪拌1小時(shí)，然后超聲破碎菌體或用高壓勻漿機(jī)予以破碎，使菌體內(nèi)部的內(nèi)皮抑素包涵體全部釋放出來(lái)。通過(guò)鏡檢，細(xì)菌破壁率達(dá)98％，并電泳鑒定，內(nèi)皮抑素在全菌中表達(dá)量超過(guò)30％，超聲破碎后上清中內(nèi)皮抑素可溶性部分占1％以下，99％不溶性內(nèi)皮抑素存在于包涵體沉淀之中，見(jiàn)圖1。
用同種緩沖液洗滌后，用含2mmol/L的2-巰基乙醇和0.1％的TritonX-100洗滌包涵體去除脂質(zhì)，用含2mol/L尿素的緩沖液去除雜蛋白，用含50％異丙醇的緩沖液去除脂多糖，再用同種緩沖液洗滌包涵體去除異丙醇成為粗包涵體，見(jiàn)圖2。
將上述初純的包涵體用含6mol/L鹽酸胍和1％巰基乙醇的提取液A溶解包涵體，在溶解液中加入20mol/LTris-HCl和0.9％NaCl液稀釋至內(nèi)皮抑素重組蛋白再次析出，離心棄上清，去除雜蛋白，沉淀用緩沖液洗2次后再次溶解，經(jīng)這種二次提取包涵體步驟后，精包涵體純度可達(dá)82％以上，見(jiàn)圖3，包涵體回收率也大大提高，可獲90％以上回收率，并使后續(xù)純化工藝中內(nèi)皮抑素溶解度大大提高，為后續(xù)的純化步驟創(chuàng)造了良好的條件。
實(shí)施例2連續(xù)稀釋內(nèi)皮抑素包涵體低濃度復(fù)性復(fù)性溶解的包涵體要在適宜條件下折疊，還原成為具有正確空間構(gòu)像及分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的生物活性分子，其中包括重組蛋白質(zhì)內(nèi)形成正確的二硫鍵，以及分子折疊還原為天然正常的空間構(gòu)像，從而獲得天然的比活性。包涵體純化達(dá)82％以上純度、調(diào)整蛋白濃度在12mg/ml左右，以連續(xù)稀釋法進(jìn)行稀釋復(fù)性，所用復(fù)性液含有20mmol/L醋酸鈉緩沖液，1mmol/L還原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，在50立升帶攪拌的反應(yīng)釜中進(jìn)行復(fù)性，連續(xù)稀釋至最終濃度0.1mg/ml，4℃下緩慢攪拌1小時(shí)以上，4℃復(fù)性至檢測(cè)完全復(fù)性后超濾濃縮。
實(shí)施例3純度大于96％的高活性可溶內(nèi)皮抑素的色譜分離取超濾濃縮后內(nèi)皮抑素復(fù)性液采用大容量陰離子DEAE-Sepharose進(jìn)行吸附雜蛋白和去除熱原質(zhì)，由于采用吸附法分離，上樣后流速以線速度60cm/hr將樣品穿過(guò)柱子，收集穿透液后(圖4)上陽(yáng)離子SP-Sepharose進(jìn)行分離，用含0.8mol/LNaCl的無(wú)熱原水進(jìn)行洗脫，收集主蛋白峰，進(jìn)行電泳鑒定(圖5)。重組人內(nèi)皮抑素的純度通過(guò)電泳和HPLC純度鑒定。通過(guò)陰陽(yáng)離子樹(shù)脂大容量分離純化，避免了上分子篩，從而滿足日產(chǎn)克級(jí)以上年產(chǎn)千克級(jí)以上重組內(nèi)皮抑素純化工藝的需要，使純化工藝上可達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。通過(guò)以上實(shí)施例操作，使最后獲得純度達(dá)96％以上的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素蛋白(圖6和圖7)，收率達(dá)到每立升發(fā)酵物可得純品40-50mg，日產(chǎn)達(dá)到10克以上，活性測(cè)定通過(guò)體外測(cè)定和體內(nèi)測(cè)定雙重測(cè)定方法保證了體內(nèi)外均具有高活性(圖8)，通過(guò)選用血管特別豐富的鼠肝癌H22作為體內(nèi)測(cè)定活性的動(dòng)物模型，以將生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測(cè)定法作為定量換算方法，建立了重組人內(nèi)皮抑素體內(nèi)定量活性測(cè)定方法，可換算到具體的活性單位。并且這種千克級(jí)純化工藝得到的重組人內(nèi)皮抑素溶解度高，穩(wěn)定性好，解決了文獻(xiàn)報(bào)道中該產(chǎn)品99％不溶，不同制備方法體外有活性體內(nèi)無(wú)活性或者低活性的問(wèn)題，也解決了臨床上毫克級(jí)劑量用量大，使用周期較長(zhǎng)的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)問(wèn)題，推動(dòng)了重組人內(nèi)皮抑素注射劑在血管依賴性疾病中抗血管生成治療的臨床應(yīng)用。
總之，本發(fā)明通過(guò)50至500立升發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)，改進(jìn)大腸桿菌包涵體二次提取工藝技術(shù)使包涵體蛋白復(fù)性后純度達(dá)82％以上，而且在小于0.01mol/L的尿素中保持高度的可溶解性。改進(jìn)工業(yè)化變復(fù)性工藝和純化工藝，使該方法能夠制備獲得蛋白純度在96％以上的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑，并使每立升發(fā)酵物可得到純品40-50mg，年制備量可達(dá)到數(shù)千克以上。通過(guò)體內(nèi)外活性測(cè)定，表明這種工業(yè)化制備工藝可從大腸桿菌中生產(chǎn)出高活性可溶的大批量重組人內(nèi)皮抑素產(chǎn)品，該產(chǎn)品在治療依賴血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的療效。
權(quán)利要求
1.高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，以表達(dá)人皮抑素基因的重組大腸桿菌菌體為原料，經(jīng)過(guò)提取、復(fù)性和純化的工業(yè)化處理過(guò)程獲得重組人內(nèi)皮抑素蛋白，進(jìn)而配制成重組人內(nèi)皮抑素注射劑，其特征在于所述工業(yè)化處理過(guò)程具體包含以下兩個(gè)步驟——(1)從菌體中提取純度大于82％的包涵體蛋白首先將包涵體用洗滌液A及異丙醇分別離心沉淀，去除雜蛋白、脂質(zhì)及核酸，再用提取液B溶解包涵體，用稀釋液C稀釋使目的蛋白析出，分離后將沉淀物用緩沖液洗滌，并用溶解液溶解，獲得純度大于82％的內(nèi)皮抑素包涵體；(2)向步驟(1)獲得的純度大于82％的內(nèi)皮抑素包涵體當(dāng)中緩慢滴入復(fù)性液D進(jìn)行復(fù)性，然后超濾濃縮，再用陰離子交換樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，獲得純度為96％以上的重組人內(nèi)皮抑素蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其特征在于步驟(1)進(jìn)行二次提取包涵體的過(guò)程當(dāng)中，所述的洗滌液A含有1-50mmol/L的Tris-HCL、0.5-10mmol/L的EDTA、0.5-10mmol/L的2-巰基乙醇、0.01-1Wt％的TritonX-100以及20-50Wt％的異丙醇，并分3-7步離心洗滌包涵體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其特征在于步驟(1)進(jìn)行二次提取包涵體的過(guò)程當(dāng)中，所述的提取液B含有1-6mol/L的鹽酸胍、0.5-2％的巰基乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其特征在于步驟(1)進(jìn)行二次提取包涵體的過(guò)程當(dāng)中，所述的稀釋液C含有1-50mmol/L的Tris-HCL、0.1-1mol/L的NaCl，其pH值為7.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其特征在于步驟(2)進(jìn)行復(fù)性過(guò)程當(dāng)中，所述的復(fù)性液D含有2-50mmol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液、0.1-2mmol/L的還原型谷胱甘肽、0.05-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述陰離子交換樹(shù)脂是DEAE，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是SP，它們均為每天可以對(duì)10克以上樣品進(jìn)行分離純化并獲得純度≥96％的重組蛋白的大容量分離樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素注射劑的制備方法。其主要特征是，通過(guò)50至500立升發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)，改進(jìn)大腸桿菌包涵體二次提取工藝技術(shù)，使包涵體蛋白復(fù)性后純度達(dá)82％以上，并且在小于0.01mol/L的尿素中保持高度的可溶性，再將該內(nèi)皮抑素包涵體進(jìn)行復(fù)性、超濾濃縮，并用陰離子交換樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，從而獲得純度為96％以上的重組人內(nèi)皮抑素蛋白。本發(fā)明每立升發(fā)酵物能夠得到40－50mg純品，年制備量達(dá)到數(shù)千克以上；體內(nèi)外活性測(cè)定表明，應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)方案制得的高活性可溶重組人內(nèi)皮抑素產(chǎn)品，在治療依賴血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的療效。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101045157SQ200610039240
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者徐根興, 榮志剛, 朱浩文, 趙延發(fā), 鐘慎政 申請(qǐng)人:江蘇省基因藥物工程技術(shù)研究中心