專利名稱：一種防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的經(jīng)鼻吸收藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及丁香酚及其配伍中藥活性成分形成的新組方在制備防治老年癡呆和改善學(xué)習(xí)記憶的鼻吸收藥物及其新劑型中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)正進(jìn)入老年型人口的國(guó)家，隨之而來(lái)的一系列變化中，包括神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病率將急劇上升。而老年癡呆癥(Alzheimer’s Disease，AD)的發(fā)病是首當(dāng)其沖的問(wèn)題。老年性癡呆是一種以智能減退，行為及人格改變?yōu)橹鞯呐R床綜合征，智力衰退應(yīng)是最突出的癥狀表現(xiàn)。在病理學(xué)上老年性癡呆是以老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)為特征。老年性癡呆不僅嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，也給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，已引起各國(guó)政府的高度重視，世界各國(guó)都給予巨額資金資助來(lái)研究其預(yù)防和治療的藥物。
現(xiàn)有治療AD的藥物，如膽堿酯酶抑制劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦細(xì)胞活化劑等，其治療目的主要在于改善患者的臨床癥狀，而不是針對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制，阻斷AD的病理過(guò)程，因此并不能有效的阻止這種疾病的發(fā)展。而且，這類藥物的長(zhǎng)期運(yùn)用存在著嚴(yán)重的不可避免的副作用，或者來(lái)源困難，無(wú)法在臨床應(yīng)用中推廣，因而難以發(fā)展成為治療AD的理想藥物。
研究發(fā)現(xiàn)，大腦控制嗅覺(jué)的功能區(qū)與記憶密切相關(guān)，嗅覺(jué)相關(guān)的記憶能夠引起突觸的重塑，嗅刺激產(chǎn)生的神經(jīng)沖動(dòng)，到達(dá)嗅皮質(zhì)，而很多未接收嗅覺(jué)直接傳入的腦區(qū)也與嗅覺(jué)功能特別密切，這其中有很多結(jié)構(gòu)如腦馬，杏仁核心，Meynert基底核，基底前腦等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，直接參與了學(xué)習(xí)記憶的識(shí)別，編碼和存儲(chǔ)等，甚至可能與老年性癡呆的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)聯(lián)。丁香屬于芳香開(kāi)竅類藥物，具有醒腦提神的功效，在治療腦部的疾病中已經(jīng)有上千年的歷史，現(xiàn)代丁香類的藥物仍然用于治療神經(jīng)障礙、癲癇、腦血管疾病以及AD等疾病。丁香是否有改善學(xué)習(xí)記憶的功能，其作用途徑是通過(guò)嗅覺(jué)通路起作用。丁香酚(Eugenol C10H12O24-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是從丁香油或其它含丁香酚的芳香油蒸餾分離而得。
根據(jù)Buck和Axel等的研究，不同的嗅覺(jué)感受器分子識(shí)別特別的氣味，不同的受體蛋白集中存在于每個(gè)嗅球感受器細(xì)胞中。具有同種受體蛋白的嗅球感受器投射在相同的嗅球，從而形成“表位圖譜”。當(dāng)氣味分子被嗅覺(jué)感受器識(shí)別后，引出嗅覺(jué)感受器電位，由嗅絲傳遞到嗅球，被特異性受體蛋白識(shí)別后，通過(guò)僧帽細(xì)胞和叢狀細(xì)胞的軸突以嗅束的方式將信號(hào)投射到初級(jí)嗅皮質(zhì)的嗅前核、梨狀前皮層、內(nèi)側(cè)嗅皮層、嗅結(jié)節(jié)、杏仁核的皮層核。內(nèi)嗅區(qū)嗅覺(jué)的聯(lián)合(內(nèi)嗅皮質(zhì)的嗅覺(jué)再分割)是唯一的，內(nèi)嗅皮質(zhì)直接接收感覺(jué)傳入，而它的其它部分從皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)轉(zhuǎn)遞信息至海馬結(jié)構(gòu)[7]。有研究表明[8]嗅覺(jué)相關(guān)的記憶引起突觸的重塑，經(jīng)過(guò)二個(gè)階段第一階段引起嗅覺(jué)通路與齒狀回單突觸聯(lián)系效率增強(qiáng)；第二階段引起嗅覺(jué)通路與海馬的多突觸通路突觸重塑。
嗅覺(jué)是所有感覺(jué)中最神秘的領(lǐng)域，2004年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)Buck和Axel的嗅覺(jué)系統(tǒng)工作方式的研究清楚表明氣味受體被氣味分子激活后，氣味受體細(xì)胞產(chǎn)生電信號(hào)，這些信號(hào)隨后被傳輸?shù)酱竽X的嗅球中，并進(jìn)而傳至大腦其他區(qū)域，結(jié)合成特定模式，從而產(chǎn)生嗅覺(jué)感知功能。不同的嗅覺(jué)感受器分子識(shí)別特別的氣味，不同的受體蛋白集中存在于每個(gè)嗅球感受器細(xì)胞中。具有同種受體蛋白的嗅球感受器投射在相同的嗅球，從而形成“表位圖譜”。當(dāng)氣味分子被嗅覺(jué)感受器識(shí)別后，引出嗅覺(jué)感受器電位，由嗅絲傳遞到嗅球，被特異性受體蛋白識(shí)別后，通過(guò)僧帽細(xì)胞和叢狀細(xì)胞的軸突以嗅束的方式將信號(hào)投射到初級(jí)嗅皮質(zhì)的嗅前核、梨狀前皮層、內(nèi)側(cè)嗅皮層、嗅結(jié)節(jié)、杏仁核的皮層核。嗅覺(jué)沖動(dòng)可通過(guò)嗅球傳遞到海馬，嗅覺(jué)相關(guān)的記憶能夠引起突觸的重塑，直接參與了學(xué)習(xí)記憶的識(shí)別，編碼和存儲(chǔ)過(guò)程。
心理神經(jīng)免疫學(xué)(Psychoneuroimmunology)的基本觀點(diǎn)為心理活動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)的激發(fā)、以及免疫系統(tǒng)的發(fā)揮作用，是互相關(guān)聯(lián)的，其中免疫系統(tǒng)是人體健康的主要保證，而人本身容易意識(shí)到并且可以嘗試去掌握的是心理活動(dòng)，良好的“感覺(jué)”能使人的機(jī)體處于良好狀況。
獲得良好心理(感覺(jué))的方法有很多，如(1)談話心象法；(2)運(yùn)動(dòng)心象法；(3)靜坐心象法；(4)感覺(jué)心象法。前三種不是每個(gè)患者都能做到的，只有第四種感覺(jué)心象法中的天然香氣調(diào)整法最容易得到，并且最容易使患者產(chǎn)生舒適的感覺(jué)和積極心態(tài)。然而，天然香氣如何取得。
大腦是人體內(nèi)的一個(gè)精細(xì)器官，人體通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化對(duì)其形成有效的保護(hù)。如血腦屏障可以將腦內(nèi)有害或過(guò)剩物質(zhì)排出體外，保持腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在血-腦之間有一種選擇性地阻止某些物質(zhì)由血人腦的“屏障(barrier)”存在，稱為血腦屏障(BBB)。血腦屏障的功能在于保證腦的內(nèi)環(huán)境的高度穩(wěn)定性，以利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能活動(dòng)，同時(shí)能阻止異物(微生物、毒素等)的侵入而有保護(hù)作用。血腦屏障主要由腦部微血管系統(tǒng)的毛細(xì)血管內(nèi)皮、內(nèi)皮間緊密連接、基底膜、周細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞突起所組成。外源性物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織主要是通過(guò)擴(kuò)散或載體轉(zhuǎn)運(yùn)，只有少量脂溶性的小分子量藥物可以經(jīng)擴(kuò)散透過(guò)血腦屏障。存在于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)載體，主要轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、氨基酸和各種離子物質(zhì)。高達(dá)95％的藥物靜脈給予時(shí)，將被血腦屏障阻擋住。
透血腦屏障的研究是藥劑學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在尋找或發(fā)展治療腦疾病的新方法和新藥物時(shí)，人們不得不考慮到大腦的血腦屏障這一棘手的問(wèn)題。由于血腦屏障的這些獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使得大腦在吸收外界物質(zhì)時(shí)十分地嚴(yán)謹(jǐn)和“挑剔”，不僅對(duì)所吸收分子的大小有限制，而且對(duì)它們所負(fù)的電荷和溶解性有要求，只有一些大腦必須的糖類、氨基酸類等分子才能穿越血腦屏障到達(dá)腦細(xì)胞。這就避免了大腦受到血液循環(huán)中有害物質(zhì)如毒素和病毒的侵害。但是這層屏障同時(shí)也阻礙了許多有潛在價(jià)值的藥物進(jìn)入大腦。
許多醫(yī)藥公司在發(fā)展治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS)的藥物時(shí)，一般偏愛(ài)以小分子藥物為研究對(duì)象，可是已發(fā)現(xiàn)的許多有前景的治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物多為一些分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于500D的大分子。可用小分子藥物治療的CNS疾病有癲癇癥、慢性疼痛、抑郁癥和精神分裂癥，但還有許多CNS疾病無(wú)法用小分子藥物治療，如老年癡呆癥、Huntington，舞蹈病.腦血管意外和腦腫瘤等。所以闡明物質(zhì)跨越血腦屏障的生物學(xué)基礎(chǔ)并尋找跨越血腦屏障的途徑對(duì)于治療CNS疾病是很重要的。
中醫(yī)藥很早就發(fā)現(xiàn)，具有芳香開(kāi)竅功能的中藥(如石菖蒲，牛黃，蘇合香，冰片，麝香)有，養(yǎng)神醒腦，芳香開(kāi)竅，舒眠養(yǎng)心，逐痰辟濁、寬中和胃、填血補(bǔ)腦等功能，可防治頭暈?zāi)炕ā⒂洃浟λネ?、神?jīng)衰弱、更年期綜合癥。該藥無(wú)副作用，久服還可抗疲勞，延緩衰老。
丁香酚(4-烯丙基-2-對(duì)甲氧基苯酚)是從丁香油或其它含丁香酚的芳香油蒸餾分離而得，通常用做化妝品和食品中的芳香劑。天然植物中具有丁香酚的有丁香葉(Eugenia caryophyllus(Spr.)Merril et Harr)，Dicipelium cariophyllatum，Pimenta dioica，Croton zehntneri eugenoliferum，和Oeimum gratissimum等。目前的研究顯示丁香酚具有抑制前列腺素、抑制中性粒細(xì)胞趨化性和解熱的作用，還有抗驚厥和抗低溫的作用。由于丁香酚具有和氧化鋅螯合的作用，可做為牙科材料充填劑和蓋髓劑，并且被廣泛用做牙科的止痛劑。但是大劑量的丁香酚有炎性和過(guò)敏性反應(yīng)的有害作用，比如過(guò)敏性接觸性皮炎。丁香酚還可以做為抗氧化劑，保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受毒性作用。丁香酚是石菖蒲(rhizoma acori graminei RAG)中的有效成分。在東亞國(guó)家，石菖蒲幾個(gè)世紀(jì)前就已經(jīng)被用于治療癲癇和健忘，現(xiàn)在的研究證明石菖蒲具有體外抑制PC-12細(xì)胞Aβ1-40導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。本發(fā)明提供了一種新的作用和給藥途徑來(lái)達(dá)到更有地防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的藥物。具有下列藥理作用去除異味、凈化空氣、殺滅空氣中的細(xì)菌；維持呼吸道機(jī)能；調(diào)節(jié)生理節(jié)律；增強(qiáng)免疫能力；促進(jìn)血液循環(huán)；預(yù)防病毒性、傳染性疾??；除蟻、除蚊、除蟑、除螨；提神醒腦、增強(qiáng)記憶；抑制高血壓、鼻敏感、氣喘等疾?。痪徑饩駢毫?、怡情養(yǎng)性。
現(xiàn)已證實(shí)，鼻通道給藥是向腦內(nèi)輸送藥物的新途徑。一些難以透過(guò)血腦屏障的藥物，在有滲透促進(jìn)劑存在的情況下，在該部位可直接進(jìn)入大腦，故經(jīng)鼻給藥物特適合腦靶向的藥物需要。另外，人鼻腔粘膜表面積大，毛細(xì)血管和淋巴管十分豐富，藥物在鼻粘膜的穿透性較高而酶相對(duì)較少，故經(jīng)鼻給藥吸收迅速，且可避免肝臟首過(guò)效應(yīng)，生物利用度高，某些藥物鼻內(nèi)給藥的生物利用度接近100％。一般只需要口服給藥劑量1/10-1/15，即可達(dá)到與口服相似的藥效。
鼻粘膜給藥的缺點(diǎn)是制劑對(duì)鼻粘膜的刺激，主要是纖毛毒性作用，包括藥物、附加劑、滲透促進(jìn)劑和防腐劑對(duì)纖毛活動(dòng)的作用。對(duì)容易引起纖毛不可逆毒性的藥物，不宜長(zhǎng)期鼻腔用藥。此外，鼻粘膜給藥的劑量受限；藥物在鼻粘膜上停留的時(shí)間短，這對(duì)藥物的鼻粘膜吸收有影響。
藥物鼻腔給藥的劑型有滴鼻劑、噴霧劑、干粉吸入劑。從吸收效果看滴鼻劑由于受到接觸鼻腔表面積小及易于流淌的原因，限制了吸收，因此效果最差。噴霧劑、干粉吸收劑吸收效果較為接近。噴霧劑制備方法簡(jiǎn)單、使用方便、鼻粘膜刺激性較小且患者較樂(lè)于使用；干粉吸入劑的滯留時(shí)間長(zhǎng)，吸收好，藥物含量高，給藥體積小，有利于藥物穩(wěn)定，但由于干粉給藥均由特殊裝置送入鼻腔，用藥沒(méi)有口服及噴霧方便，而且會(huì)刺激鼻粘膜，患者治療率并不理想。
在傳統(tǒng)的中、西藥成藥制劑中，只有少數(shù)幾個(gè)液體口服劑型常用矯味劑、矯嗅劑，并且其目的在于遮蓋藥物本身所具有的不良?xì)馕丁Ｉ僖?jiàn)噴霧劑主動(dòng)利用天然芳香氣息刺激嗅覺(jué)細(xì)胞達(dá)到調(diào)整心情(感覺(jué)、心理)、平衡免疫、輔佐藥物進(jìn)行總體治療的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于以天然丁香酚，或丁香酚鹽，或者丁香酚的異構(gòu)體為主要藥物活性成分，提供一種新型的、可以不合任何非天然添加劑的經(jīng)鼻腔經(jīng)藥的防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的鼻吸收藥物，使患者在治病的同時(shí)有一種安全感和回歸自然的感覺(jué)；同時(shí)本發(fā)明還增加天然香料組分，以天然香氣刺激嗅覺(jué)細(xì)胞，通過(guò)介質(zhì)影響大腦皮質(zhì)的興奮與抑制活動(dòng)，改善患者的心理狀態(tài)，平衡植物神經(jīng)功能，恢復(fù)機(jī)體的神經(jīng)介質(zhì)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的能力，從宏觀上配合藥物達(dá)到系統(tǒng)調(diào)整、標(biāo)本同治的目的。
本發(fā)明中使用的天然香料選用那些可作為藥品、食品、化妝品及高級(jí)香水的香料、矯嗅劑的無(wú)毒的、單用或者組合使用能使人產(chǎn)生一種清新、愉快、寧?kù)o、舒適、心曠神怡感覺(jué)的天然香料及天然香料的粗提物、精提物和由精提物衍生出來(lái)的合成化合物或天然有效成份。
天然香料在完成改善患者心理狀態(tài)功能的同時(shí)，它們大多數(shù)還具有天然藥物滲透促進(jìn)劑、天然抗氧化劑、天然防腐劑及殺菌功能。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的經(jīng)鼻吸收藥物，其特征在于其中含有下列藥理活性成分丁香酚，或丁香酚鹽，或者丁香酚的異構(gòu)體，或者丁香酚、丁香酚鹽、丁香酚的異構(gòu)體中任意一種、二種或三種的混合物。
藥物中還含有牛黃，蘇合香，冰片，麝香中的一種或多種成份。
藥物中還含有下列一種或多種藥理活性成分八角茴香，樟木香，薄荷原香，留蘭香，薄荷腦，薄荷素香，羅勒香，甜羅勒，白蘭，熏衣草，羅勒，檸檬香，萊姆，洋甘菊，檸檬香茅，巖蘭草，馬郁蘭，白千層，香蜂草，豆蔻，野鼠尾草，丁香花蕾香，乳香，廣霍香，天竺葵，迷迭香，香紫蘇，依蘭，檀香，安息香，月桂，乳香，香柏木，留蘭香，小茴香，香蘭素/乙基香蘭素，檸檬，桉葉香，冬青香，桉葉香，麝香草酚，桂皮香，甲/乙基麥芽酚，甲基環(huán)戊烯醇酮，桂花，紫蘇葶，麝香，留蘭香，天然苯甲醛，對(duì)羥基苯甲醛，甲/乙基香蘭素，茉莉，夜來(lái)香，白玉蘭，玫瑰，薰衣草，土金香；前述物質(zhì)的的鹽、衍生物、異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體。
丁香酚鹽是丁香酚的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、或有機(jī)酸鹽，丁香酚的異構(gòu)體是異丁香油酚，去氫雙異丁香油酚，二聚體丁香酚。
藥物中還含有下列滲透促進(jìn)劑中的一種或多種①合成的表面活性劑聚氧乙烯-9-月桂醚、硫代月桂醇鈉；②膽酸衍生物牛黃膽酸鈉、葡萄糖膽酸鈉，脫氧膽酸鈉和脫氧牛黃膽酸鈉；③烷基取代的β-環(huán)糊精類；④環(huán)形肽類桿菌肽；⑤其他乙烯二胺四醋酸二鈉，檸檬酸和聚丙烯酸。
所述的藥物劑型為滴鼻劑、粉末劑、微球制劑、脂質(zhì)體劑、孔劑、膜劑、凝膠劑、噴霧劑、軟膏劑，由藥理活性成分與相應(yīng)的常規(guī)制藥輔料組成。
所述的藥理活性成分采用超微粉碎后的細(xì)粉或納米細(xì)粉。
所述的老年癡呆是指各種原因引起的使學(xué)習(xí)記憶能力、空間定向能力、生活自理能力，思維障礙和認(rèn)知功能障礙等癥狀與體征組成的綜合癥或征候群，癡呆癥包括老年性癡、血管性癡呆、額顳性癡、Hnutington舞蹈癥，帕金森氏病等引起的癡呆，還包括青少年學(xué)習(xí)記憶減退癥，老年學(xué)習(xí)記憶減退癥，注意力減退，腦血管疾病如腦缺血性中風(fēng)、腦出血及其引起的后遺癥，情緒異常，抑郁癥，神經(jīng)癥，行為異常、人格異常，功能性性功能減退癥，精神分裂癥等與腦部治療有關(guān)神經(jīng)精神疾病。
所述調(diào)節(jié)血腦屏障是指調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性，以及通過(guò)嗅覺(jué)通路的靶向作用使整個(gè)腦的血腦屏障能得到更好地調(diào)控。這種調(diào)控機(jī)制使得嗅覺(jué)提供了血腦屏障的閥門(mén)效應(yīng)，為腦部疾病的時(shí)間治療學(xué)提供了科學(xué)依據(jù)，使得腦部疾病的用藥，特別是腦部腫瘤、腦部感染性疾病、腦部器質(zhì)性疾病等的用藥提供了更大的通透性，達(dá)到更好的治療效果。縮短了住院與治療的時(shí)間，節(jié)省了費(fèi)用。更加有利于腦部疾病病人的康復(fù)。
丁香酚(Eugenol C10H12O24-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是從丁香油或其它含丁香酚的芳香油蒸餾分離而得。丁香酚的分子結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)對(duì)甲氧酚，ROO·和超氧自由基在pH7.0條件下的還原電位分別為1.05V和0.94V，而對(duì)甲氧酚的還原電位為0.73V。這樣一來(lái)，由于自由基和苯酚結(jié)構(gòu)還原電位的不同，分子結(jié)構(gòu)中包含對(duì)甲氧酚的丁香酚就能夠清除ROO·和超氧自由基，具有抗氧化的作用。所以丁香酚可能通過(guò)其抗氧化的作用具有作用于神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而影響到學(xué)習(xí)記憶的功能。丁香酚的研究結(jié)果表明其對(duì)具有防治AD作用和改善學(xué)習(xí)記憶功能。
1.丁香酚的理化性質(zhì)1.1.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)丁香酚的分子結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)對(duì)甲氧酚，對(duì)甲氧酚具有促氧化劑和抗氧化劑的雙重作用。而在對(duì)甲氧酚丁香酚以及相關(guān)化合物中的作用主要為抗氧化劑。
對(duì)甲氧酚通過(guò)給出酚基上的氫原子，與ROO·發(fā)生連鎖反應(yīng)(Eq.(1))，這種反應(yīng)要比RH與ROO·(Eq.(2))的速率要快的多。
(1)(2)(3)Kinh，kp，kt分別代表抑制速率常數(shù)、轉(zhuǎn)換速率常數(shù)、和終止常數(shù)。ArOH和ArO·代表酚和酚基。ROO·被根(基)偶合和其它反應(yīng)所終止。
酚類化合物與自由基結(jié)合的速率要比磷脂與自由基結(jié)合的速率要快的多。而磷脂在通常情況下，是活細(xì)胞內(nèi)最大的抗氧化劑。
1.2丁香酚的異構(gòu)體丁香酚的異構(gòu)體包括異丁香油酚(isoeugenol)，去氫雙異丁香油酚(dehydrodiisoeugenol)，二聚體丁香酚(bis-eugenol)等。
圖.丁香酚及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)1.3純化方法丁香酚的傳統(tǒng)制備方法是直接用水蒸汽蒸餾法從丁香花蕾(Clove buds)中提取丁香油，然后用堿液萃取分離制得。有研究提出新的丁香酚提取方法乙醇回流法，使丁香酚的收率較水蒸汽蒸餾法提高了5％.同時(shí)考察回流溶劑、回流時(shí)間、蒸除乙醇、固定堿液堿度、萃取溶劑、酸化酸度等工藝條件對(duì)丁香酚收率的影響。確定最佳工藝參數(shù)。測(cè)得堿化突變點(diǎn)為pH＝8，酸化突變點(diǎn)為pH＝6。
以往的觀點(diǎn)認(rèn)為香草為什么能預(yù)防、治療疾病和的保健功能呢？......香氣揮發(fā)物能夠強(qiáng)而有力地刺激人的呼吸中樞，促進(jìn)人體吸進(jìn)氧氣，排出二氧化碳。大腦因之得到充分的氧氣供應(yīng)，產(chǎn)生旺盛的精力，從而使人的思維清晰敏捷。同時(shí)，隨著香氣的擴(kuò)散，空氣中的陽(yáng)離子增多，又可進(jìn)上步調(diào)節(jié)人的神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)血液循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)人體相應(yīng)器官分泌出有益健康的激素及體液，釋放出酶、乙酰膽堿等具有生理活性的物質(zhì)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)全身器官功能的作用，增強(qiáng)人的免疫力和機(jī)體活力，進(jìn)而有效地抑制或醫(yī)治各種疾病的發(fā)生。
本發(fā)明提供研究結(jié)論表明上述傳統(tǒng)理論與觀點(diǎn)的片面性與錯(cuò)誤。本發(fā)明結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，特別是含芳香類物質(zhì)的藥物其藥理作用于主要是通過(guò)嗅覺(jué)通路包括嗅覺(jué)感受器、嗅神經(jīng)、嗅球、嗅束及與嗅覺(jué)相關(guān)的大腦如邊緣系統(tǒng)、海馬、杏仁復(fù)合體、間腦、基底前腦、基底神經(jīng)核和腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等廣泛區(qū)域發(fā)揮作用的。這為許多腦部疾病的發(fā)病機(jī)制闡明和治療提供了科學(xué)依據(jù)。
本發(fā)明從另一個(gè)全新的方面解釋了芳香植物的作用機(jī)制，同時(shí)也為嗅覺(jué)系統(tǒng)通路的研究及其機(jī)制的進(jìn)一步揭示提供了全新的思路和方法。
解剖學(xué)研究表明，鼻腔是頭蓋骨的一個(gè)部分，上有許多小孔，鼻腔的內(nèi)皮就像一塊篩狀的板，神經(jīng)束通過(guò)小孔，周圍充滿著腦脊液，部分藥物由此能進(jìn)入腦脊液。由于此給藥途徑比其它給藥途徑方便，且無(wú)痛苦。因此，當(dāng)需要向腦輸送藥物時(shí)，應(yīng)首先鼻腔噴霧給藥。如，治療癲癇、頭痛、驚厥、震顫麻痹、精神失常、亢奮、失眠、顱內(nèi)壓增高、腦腫瘤、老年性癡呆等。
人腦共有12對(duì)腦神經(jīng)，其中只有一對(duì)神經(jīng)是裸露在皮膚粘膜的淺表層，這對(duì)神經(jīng)就是嗅神經(jīng)。這對(duì)神經(jīng)分別直通入人的左腦與右腦。當(dāng)人的腦組織或腦細(xì)胞受到損傷后，無(wú)論損傷在左腦還是在右腦，刺激這對(duì)嗅神經(jīng)，都能激活腦神經(jīng)和腦細(xì)胞，能夠?qū)Ω黝惸X損傷，如腦血栓、腦出血及其后遺癥(如偏癱失語(yǔ)、精神障礙)、腦萎縮、癡呆、帕金森綜合癥和植物人等起到顯著的治療作用，達(dá)到康復(fù)功能，起到修復(fù)神經(jīng)的目的。
經(jīng)鼻給藥，滲透性好，且有腦靶向的特點(diǎn)。使用方便、安全、有效、順應(yīng)性好。能提高病人服藥的依從性。
嗅覺(jué)給藥可有效地使藥物繞過(guò)血腦屏障，靶向傳遞信息到大腦，具有生物利用度高、吸收迅速、起效快、無(wú)損傷性、使用方便等特點(diǎn)，已成為藥物制劑領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。通過(guò)對(duì)嗅覺(jué)系統(tǒng)工作方式的深入理解，可認(rèn)為丁香酚可能是通過(guò)嗅球把嗅覺(jué)沖動(dòng)傳遞到海馬，使海馬內(nèi)某種或幾種神經(jīng)遞質(zhì)得表達(dá)發(fā)生改變或者丁香酚本身干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)興奮性，從而影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)的信號(hào)使大腦的學(xué)習(xí)記憶發(fā)生改變，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD病等的治療提供了新的思路。
本發(fā)明對(duì)丁香酚、丁香酚鹽、丁香酚的異構(gòu)體制備成鼻吸收劑的劑型進(jìn)行了研究，本發(fā)明藥物除了可以制成常規(guī)的滴鼻劑、噴霧劑外，還可以制成下列劑型微球制劑微球是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新劑型，藥物被包埋在微球中或吸附、偶聯(lián)在微球表面，從而延緩藥物釋放，微球材料選擇具有生物粘附性的物質(zhì)如白蛋白，淀粉和二乙氨乙基葡聚糖等，也有利于延長(zhǎng)微球與鼻粘膜接觸時(shí)間，從而達(dá)到緩慢釋藥，緩慢吸收的目的。微球制劑的粒子大小與吸收有密切關(guān)系，鼻腔給藥的微球粒徑一般應(yīng)控制在40～60μm范圍內(nèi)。
凝膠制劑用聚丙烯酸、聚乙烯醇、卡波姆等制成親水凝膠，加入藥物，可延長(zhǎng)接觸時(shí)間提高生物利用度。如Chu制成的鹽酸普萘洛爾聚丙烯酸緩釋凝膠；森本研制的胰島素聚丙烯酸凝膠劑和降鈣素的聚丙烯酸凝膠劑。
脂質(zhì)體屬于靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，它具有生物膜的特性和功能，進(jìn)入體藥物主要在肝、脾、肺等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數(shù)，減少治療劑量，降低毒性。Vyas等用薄膜蒸發(fā)法制成的硝苯地平多室脂質(zhì)體鼻腔給藥，可延長(zhǎng)釋藥時(shí)間，提高生物利用度。將阿司匹林的前體藥物賴氨匹林制成重建型脂質(zhì)體，供鼻腔給藥，使藥物不受肝首過(guò)效應(yīng)的影響，提高生物利用度。
制劑可含有滲透促進(jìn)劑。其作用機(jī)制為在鼻粘膜上與糖蛋白結(jié)合，引起磷酯膜紊亂，改變鼻粘膜結(jié)構(gòu)，增加鼻粘膜的流動(dòng)性和通透性；降低鼻粘膜粘度；減少蛋白水解酶對(duì)多肽類和蛋白質(zhì)類藥物的降解。
制成噴霧劑吸入可調(diào)節(jié)血腦屏障的開(kāi)放，增加藥物透過(guò)血腦屏障能力，配合使用能提高其他藥物治療腦疾病的效果。
丁香酚通過(guò)嗅覺(jué)防治老年性癡呆的藥理作用及其機(jī)制Harman于1956年提出衰老的自由基學(xué)說(shuō)，由于自由基產(chǎn)生和清除的失衡，過(guò)量的氧自由基破壞了細(xì)胞及其重要成分，引起膜功能減退，蛋白質(zhì)和酶變性，DNA分子鏈斷裂或鉸鏈等損傷是加速衰老的重要因素。所以，如果丁香酚能夠抑制體內(nèi)過(guò)氧化物的生成，改善自由基代謝，就可以起到抗衰老的作用。
ROO·和超氧自由基在pH7.0條件下的還原電位分別為為1.05V和0.94V，而對(duì)甲氧酚的還原電位為0.73V。這樣一來(lái)，由于自由基和苯酚結(jié)構(gòu)還原電位的不同，分子結(jié)構(gòu)中包含對(duì)甲氧酚的丁香酚就能夠清除ROO·和超氧自由基。用ESR自旋捕集技術(shù)研究丁香抗氧性和對(duì)氧自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)丁香對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH自由基，黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生O2-自由基有很好的清除作用，對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化也有很強(qiáng)抑制作用。在麻蠅壽命試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)丁香濃度為0.05％時(shí)對(duì)麻蠅有延壽作用，2.5％和5.0％丁香縮短了麻蠅壽命。其清除氧自由基活性丁香酚、丁香油均高于OH特異性清除劑甘露醇(其EC50為2.1mmol/L)，以丁香酚清除效果最好(其K-50為0.7mmol/L)，丁香酚對(duì)核黃素一甲硫氨酸光照還原生成的O2亦有明顯的清除作用。據(jù)報(bào)道，丁香酚并不清除由吩嗪氨甲喋呤和NAD產(chǎn)生的O2-，但是卻抑制由Fe(II)EDTA和脂質(zhì)過(guò)氧化物催化的過(guò)氧化反應(yīng)。
丁香酚依濃度地抑制H2O2/Ca2+催化的人紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，在200μM濃度時(shí)，抑制率達(dá)62％。也依濃度地抑制苯甲酰過(guò)氧化物(BPO)/Ca2+催化地人紅細(xì)胞膜脂反應(yīng)，當(dāng)濃度大于100μM時(shí)，完全抑制反應(yīng)發(fā)生。丁香酚通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性地對(duì)抗Ca2+催化反應(yīng)，抑制羥自由基形成，保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)免受氧化。
Wie等研究顯示丁香酚能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)導(dǎo)致的興奮性中毒。丁香酚可能是做為NMDA受體的拮抗劑，而NMDA受體能夠調(diào)節(jié)Aβ的神經(jīng)毒性作用，因此，丁香酚可能是通過(guò)介導(dǎo)NMDA受體來(lái)拮抗Aβ的神經(jīng)毒性作用。并且，丁香酚還能夠抑制Aβ介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。這些研究提示丁香酚可能具有預(yù)防和治療阿爾茨海默病的可能。但是目前，對(duì)其機(jī)制的研究還不是很清楚。
丁香酚通過(guò)嗅覺(jué)改善學(xué)習(xí)記憶作用及其機(jī)制多種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物都可影響動(dòng)物的自主活動(dòng)，因而自主活動(dòng)的記錄是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的主要方法，而且在新藥研究中，觀察藥物對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)的影響也是評(píng)價(jià)藥物是否影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要方法。
丁香酚對(duì)于嗅球摘除過(guò)后的小鼠，并沒(méi)有增強(qiáng)其空間學(xué)習(xí)記憶的功能，而正常小鼠給予丁香酚后，空間學(xué)習(xí)記憶的能力有明顯增強(qiáng)，這說(shuō)明藥物丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不是通過(guò)呼吸系統(tǒng)作用的，而可能是通過(guò)嗅球的途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。所以嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究可能對(duì)于AD的預(yù)防、檢測(cè)、有效控制和治療提供新的思路和給藥通路。
多種途徑給予丁香酚后發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的自主活動(dòng)有短暫的中樞系統(tǒng)神經(jīng)興奮性的變化，而且灌胃組小鼠的神經(jīng)興奮性有持續(xù)性增加，可能原因?yàn)槎∠惴铀幬锏捏w內(nèi)積累。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示嗅覺(jué)吸入組的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力明顯增強(qiáng)，而灌胃組和滴鼻組的小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明藥物丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可能不是通過(guò)血腦屏障和嗅黏膜上皮通路起作用的，而是通過(guò)嗅覺(jué)神經(jīng)通路途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。目前的研究也顯示，確有許多的藥物和潛在的有毒性的外源性化學(xué)物質(zhì)可以通過(guò)嗅覺(jué)途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明一些物質(zhì)如氨基酸、病毒和重金屬等可通過(guò)吞噬或胞飲的方式進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，在神經(jīng)元細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)軸索轉(zhuǎn)運(yùn)至嗅球部位，再直接通過(guò)嗅神經(jīng)通路進(jìn)入大腦。
丁香酚調(diào)控血腦屏障作用及可能機(jī)制中醫(yī)藥很早就發(fā)現(xiàn)，具有芳香開(kāi)竅功能的中藥(如石菖蒲，牛黃，蘇合香，冰片，麝香)有，養(yǎng)神醒腦，芳香開(kāi)竅，舒眠養(yǎng)心，逐痰辟濁、寬中和胃、填血補(bǔ)腦等功能，可防治頭暈?zāi)炕?、記憶力衰退、神?jīng)衰弱、更年期綜合癥。該藥無(wú)副作用，久服還可抗疲勞，延緩衰老。
丁香酚是石菖蒲的有效成分之一，亦是香水的重要材料，具有芳香開(kāi)竅，醒腦提神的功效。在中醫(yī)的歷史上，許多以丁香酚為有效成分的中草藥，在治療腦部的疾病中已經(jīng)有上千年的歷史，而現(xiàn)在，這樣的藥物仍然在治療神經(jīng)障礙、癲癇、腦血管疾病以及老年性癡呆的病人中發(fā)揮作用。石菖蒲揮發(fā)油中的順式甲基異丁香酚能透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，因此，丁香酚在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病上的優(yōu)勢(shì)就更加明顯。
本發(fā)明運(yùn)用嗅球摘除的模型，通過(guò)吸入丁香酚刺激嗅覺(jué)的途徑，采用LashleyIII水迷宮，探討丁香酚通過(guò)嗅覺(jué)途徑對(duì)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的影響的機(jī)制。
本發(fā)明通過(guò)吸入丁香酚刺激嗅覺(jué)的途徑，發(fā)現(xiàn)丁香酚給藥組的Lashley III H-W水迷宮潛伏期明顯小于空白組的水迷宮潛伏期，表明丁香酚對(duì)于正常小鼠具有增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)的能力，對(duì)于空間學(xué)習(xí)相關(guān)疾病可能有一定的功效。通過(guò)嗅球摘除的手段，對(duì)照正常動(dòng)物給藥組，觀察嗅球摘除后對(duì)丁香酚作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物丁香酚對(duì)于嗅球摘除過(guò)后的小鼠，并沒(méi)有增強(qiáng)其空間學(xué)習(xí)記憶的功能，而正常小鼠給予丁香酚后，空間學(xué)習(xí)記憶的能力有明顯增強(qiáng)，這說(shuō)明藥物丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不是通過(guò)呼吸系統(tǒng)作用的，而可能是通過(guò)嗅球的途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。藥物丁香酚通過(guò)嗅球傳遞到海馬的信息，可能會(huì)導(dǎo)致海馬內(nèi)某種或幾種神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的改變，或者丁香酚本身可能會(huì)干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)的信號(hào)改變，從而可能增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能。
本發(fā)明藥物經(jīng)鼻給藥，避免了消化道反應(yīng)及肝臟的首過(guò)效應(yīng)，并具有起效作用快、生物利用度高、腦靶向的特點(diǎn)，可用于治療老年性癡呆和中老年記憶障礙或提高青少年記憶、學(xué)習(xí)能力等。
因?yàn)樯鲜鏊幬锝M合物經(jīng)鼻給藥安全性高，吸收速度快，同時(shí)還能長(zhǎng)時(shí)間維持藥物作用效果，達(dá)到防治老年性癡呆，學(xué)習(xí)記憶減退，神經(jīng)智能發(fā)育不良，改善學(xué)習(xí)記憶效果。甚至同類的藥物經(jīng)鼻給藥可以達(dá)到治療如抑郁癥等。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)行為學(xué)研究程控自主活動(dòng)箱程控自主活動(dòng)箱由四個(gè)黑色圓柱型暗室(直徑25cm，高10cm)組成。暗室周圍有三對(duì)光電管，自發(fā)活動(dòng)的測(cè)定依據(jù)動(dòng)物活動(dòng)使水平光束變化，轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)數(shù)據(jù)傳輸線與電腦相連，反應(yīng)為數(shù)字的變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保持安靜。記錄180s內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)記錄單位(次數(shù)，n)。動(dòng)物的自主活動(dòng)標(biāo)志著動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮狀態(tài)。觀察動(dòng)物自主活動(dòng)是評(píng)價(jià)中樞神興奮狀態(tài)的一項(xiàng)主要指標(biāo)。
LashleyIII水迷宮LashleyIII是經(jīng)典的觀測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)行為學(xué)裝置，由80×50×20(cm3)雙層不透明有機(jī)玻璃箱，內(nèi)設(shè)起始點(diǎn)、終點(diǎn)平臺(tái)和四個(gè)盲端，平臺(tái)附近為安全區(qū)，并放臺(tái)燈標(biāo)示，動(dòng)物只有通過(guò)臺(tái)階才可上岸躲避溺水的危險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)迷宮水深12cm，實(shí)驗(yàn)室溫度20℃-22℃，迷宮周圍一切空間標(biāo)志在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中固定不變。正式實(shí)驗(yàn)前，訓(xùn)練4d，將每只小鼠在迷宮中熟悉水環(huán)境15m，如小鼠在180s內(nèi)未到達(dá)終點(diǎn)平臺(tái)，可幫助式地將小鼠趕至平臺(tái)，并將小鼠在平臺(tái)上待20s。第5d37℃單層貼壁傳代培養(yǎng)。
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四種腫瘤細(xì)胞，分別接種于96孔板中，2×104個(gè)/孔，貼壁培養(yǎng)24小時(shí)分別換成含有實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3獲得的元寶楓提取物的培養(yǎng)液，按不同元寶楓提取物濃度分成7組(設(shè)0、5、10、20、40、60、80μg/mL共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值)。
繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換成不含提取物的培養(yǎng)液，同時(shí)加入20μL MTT(四甲基偶氮唑藍(lán)，5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)(對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液和二甲基亞砜)，水平震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值(A)，波長(zhǎng)570nm，并按下述公式計(jì)算提取物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果如表1所示，表明本發(fā)明的脂肪酸和酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。
細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570)×100％表1 不同濃度提取物(作用24小時(shí))對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(％)

注上述抑癌實(shí)驗(yàn)所用元寶楓葉提取物已經(jīng)乙酸乙酯步驟進(jìn)一步濃縮，不同季節(jié)葉和秋季落葉的提取物對(duì)癌細(xì)胞的抑制能力無(wú)顯著差異。

*P＝0.023ΔP＝0.010□P＝0.005^P＝0.01○P＝0.01實(shí)施例3鼻腔滴入每個(gè)小鼠鼻腔滴入丁香酚油50μl，每天1次，持續(xù)2w。
程控自主活動(dòng)箱同上。
LashleyIII水迷宮同上。
1.6數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0軟件。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)。
2.結(jié)果自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)記錄單位(次數(shù)，n)，水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄單位(秒，s)。
表1自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(x±s)

□P＝0.023^P＝0.04 *P＝0.02○P＝0.00表2水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(x±s)


*P＝0.019^P＝0.019自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，灌胃組、嗅覺(jué)吸入組、鼻腔滴入組等第7d以及灌胃組第14d的自主活動(dòng)明顯高于空白組小鼠自主活動(dòng)，作各組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，P均＜0.05；而嗅覺(jué)吸入組和鼻腔滴入組第14天的自主活動(dòng)相對(duì)空白組沒(méi)有明顯改變。結(jié)果見(jiàn)表1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，嗅覺(jué)吸入組在實(shí)驗(yàn)第7d和14d的水迷宮潛伏期明顯小于空白組的水迷宮潛伏期，作各組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，P均＜0.05；而鼻腔滴入組和灌胃組則沒(méi)有明顯的變化。
實(shí)施例4灌胃組每個(gè)小鼠灌胃給予丁香酚油50μl，每天1次，持續(xù)2w。
1.5神經(jīng)行為學(xué)觀察給藥前開(kāi)始運(yùn)用程控自主活動(dòng)箱和LashleyIII水迷宮檢測(cè)其神經(jīng)行為的變化，檢測(cè)時(shí)間、位置等參照條件同行為學(xué)篩選，分別再予給藥的第7d和14d后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共記錄3次。
一、丁香酚對(duì)昆明鼠學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)行為學(xué)研究1材料和方法1.2.材料丁香酚，Lashley III程控小鼠水迷宮，腦立體定位儀。
1.2.動(dòng)物與分組昆明種小鼠，雌雄兼?zhèn)洌?5～25g，2月齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，通過(guò)Lashley III水迷宮訓(xùn)練4d，水迷宮參照系不變，水溫保持在20±1℃，每天訓(xùn)練2次(上下午各1次)，每次訓(xùn)練約4次。試驗(yàn)第5d，剔初5min內(nèi)不能到達(dá)平臺(tái)的小鼠后，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、模型+藥物組，每組各10只，藥物組和模型+藥物組每天嗅覺(jué)吸入丁香酚30min，持續(xù)14d。
1.3.方法1.3.1.嗅球摘除模型的制作方法以以38g/L水合氯醛0.38g/kg腹腔注射麻醉小鼠，將頭部固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，參考The Mouse Brain小鼠圖譜(第二版，George Paxinos，KeithB J Franklin)用電鉆在前囟前3.2mm為后界開(kāi)窗，暴露雙側(cè)嗅球，用厚度為0.5mm的刀片由后界垂直插入取出嗅球組織，并將殘余組織吸凈，創(chuàng)口用明膠海綿填塞止血骨蠟封閉。術(shù)后休息一周。
1.3.2.給藥方法在相對(duì)較密閉的試驗(yàn)盒內(nèi)(60cm×60cm×20cm)，丁香酚溶劑均勻的灑在盒底部，再在上面鋪上一層薄鐵欄柵。給藥時(shí)，先讓試驗(yàn)盒內(nèi)的藥物充分揮發(fā)彌漫在整個(gè)試驗(yàn)盒內(nèi)，之后，將試驗(yàn)動(dòng)物放置鐵欄柵上，將試驗(yàn)盒蓋蓋上，藥物作用30min后，將試驗(yàn)動(dòng)物取出。
1.3.3.Lashley III水迷宮Lashley III H-W同上。
1.3.4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)輸入spss11.5版軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，所有治療均以x±s表示，組間采用配對(duì)t檢驗(yàn)。
2.結(jié)果實(shí)驗(yàn)記錄單位(秒，s)，水迷宮結(jié)果見(jiàn)表1表1水迷宮成績(jī)分析(x±s)

*P＝0.019^P＝0.019□P＝0.035○P＝0.041經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，空白組與藥物組在實(shí)驗(yàn)第7d和第14d的數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性分布，做各組樣本的t檢驗(yàn)，P均＜0.05。表明丁香酚對(duì)于正常小鼠具有增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)的能力。模型+藥物組與模型組、假手術(shù)組的7d和14d的P均＞0.05。而模型組+藥物組和藥物組的7d和14d后比較，P均＜0.05。
二、丁香酚不同給藥途徑對(duì)昆明鼠的空間學(xué)習(xí)記憶的研究1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠，雌雄各半，2月齡，體重20±2g，分組前大籠飼養(yǎng)，分組后小籠飼養(yǎng)，水和食物自取，晝夜自然交替。
1.2神經(jīng)行為學(xué)研究篩選實(shí)驗(yàn)前先用行為學(xué)方法進(jìn)行篩選，包括自主活動(dòng)及水迷宮。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，通過(guò)程控自主活動(dòng)箱，訓(xùn)練5d，記錄180s小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，每天訓(xùn)練1次，自主活動(dòng)訓(xùn)練結(jié)果應(yīng)該呈現(xiàn)開(kāi)始階段輕度下降，第四次后基本無(wú)變化的規(guī)律，所以按第5次結(jié)果90％區(qū)間去除兩端極值，記錄結(jié)果。再采用LashleyIII水迷宮篩選學(xué)習(xí)記憶功能障礙小鼠。實(shí)驗(yàn)環(huán)境不變，水迷宮參照系數(shù)不變，水溫保持在20℃-22℃，篩選共進(jìn)行5d，每天進(jìn)行2次測(cè)試(上、下午各1次)，每天的2次測(cè)試被平均先訓(xùn)練4d，實(shí)驗(yàn)第5d，剔除3min內(nèi)不能到達(dá)平臺(tái)的小鼠，隨機(jī)分組。每次訓(xùn)練時(shí)間安排在10:00am～4:00pm之間，先進(jìn)行自主活動(dòng)訓(xùn)練，再進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。
1.3動(dòng)物分組將篩選后的48只小鼠隨機(jī)分成4組，包括空白組、嗅覺(jué)吸入組、鼻腔滴入組、灌胃組，每組12只，雌雄兼?zhèn)洹?br> 1.4給藥方法嗅覺(jué)吸入在相對(duì)較密閉的實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)(60cm×60cm×20cm)，丁香酚溶劑(江西省樟樹(shù)市本草天然藥用油長(zhǎng)，批號(hào)050921)均勻的灑在盒底部，再在上面鋪上一層薄鐵欄柵。給藥時(shí)，先讓實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)的藥物充分揮發(fā)彌漫在整個(gè)實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)，之后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置鐵欄柵上，將實(shí)驗(yàn)盒蓋蓋上，藥物作用30min后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取出。每天1次，持續(xù)2w。
鼻腔滴入每個(gè)小鼠鼻腔滴入丁香酚油50μl，每天1次，持續(xù)2w。
灌胃組每個(gè)小鼠灌胃給予丁香酚油50μl，每天1次，持續(xù)2w。
1.5神經(jīng)行為學(xué)觀察給藥前開(kāi)始運(yùn)用程控自主活動(dòng)箱和LashleyIII水迷宮檢測(cè)其神經(jīng)行為的變化，檢測(cè)時(shí)間、位置等參照條件同行為學(xué)篩選，分別再予給藥的第7d和14d后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共記錄3次。
程控自主活動(dòng)箱同上。
LashleyIII水迷宮同上。
1.6數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0軟件。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)。
2.結(jié)果自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)記錄單位(次數(shù)，n)，水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄單位(秒，s)。
表1自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(x±s)

□P＝0.023^P＝0.04*P＝0.02○P＝0.00表2水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(x±s)

*P＝0.019^P＝0.019
實(shí)驗(yàn)結(jié)果自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，灌胃組、嗅覺(jué)吸入組、鼻腔滴入組等第7d以及灌胃組第14d的自主活動(dòng)明顯高于空白組小鼠自主活動(dòng)，作各組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，P均＜0.05；而嗅覺(jué)吸入組和鼻腔滴入組第14d的自主活動(dòng)相對(duì)空白組沒(méi)有明顯改變。
水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，嗅覺(jué)吸入組在實(shí)驗(yàn)第7d和14d的水迷宮潛伏期明顯小于空白組的水迷宮潛伏期，作各組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，P均＜0.05；而鼻腔滴入組和灌胃組則沒(méi)有明顯的變化。
藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)起作用的途徑主要有(1)血液循環(huán)通路藥物先吸收進(jìn)入血液循環(huán)再透過(guò)血腦屏障入腦；(2)嗅黏膜上皮通路借助胞飲或擴(kuò)散作用，藥物分子經(jīng)嗅黏膜上皮通過(guò)基膜或固有層的運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)至腦脊液；(3)嗅覺(jué)神經(jīng)通路路徑的選擇有藥物依賴性，可能與嗅神經(jīng)細(xì)胞受體的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。丁香酚有改善學(xué)習(xí)記憶的功能。但是，其途徑是藥物經(jīng)過(guò)血液循環(huán)通過(guò)血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)起作用，還是通過(guò)嗅黏膜上皮通路起作用，或者是通過(guò)嗅覺(jué)神經(jīng)通路起作用，目前仍不清楚。藥物或者其它的外源性化學(xué)物質(zhì)通過(guò)血液循環(huán)通路進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，依賴于血腦屏障和血腦脊液屏障，以及這些物質(zhì)的理化性質(zhì)。僅有脂溶性的物質(zhì)才能通過(guò)血腦屏障跨細(xì)胞入腦，并且，只有極性的物質(zhì)才能通過(guò)。而對(duì)于一些親水性或者大分子藥物來(lái)說(shuō)，它們即使進(jìn)入體循環(huán)也不能透過(guò)血腦屏障。最終，由于血腦屏障的特殊結(jié)構(gòu)，藥物和外源性化學(xué)物質(zhì)被主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)出神經(jīng)系統(tǒng)，從而很難進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮藥效。由于人的嗅覺(jué)系統(tǒng)中提供了大腦與外部環(huán)境的直接聯(lián)系，因此采用嗅覺(jué)吸入的方式，可有效的解決藥物透過(guò)血腦屏障的輸送問(wèn)題。
三、嗅球摘除后丁香酚對(duì)昆明鼠H-W迷宮和自主活動(dòng)行為的影響1材料和方法1.1.動(dòng)物與分組昆明種小鼠，雌雄兼?zhèn)?，體重15～25g，2月齡，普通級(jí)，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，通過(guò)程控自主活動(dòng)箱及Lashley III程控小鼠水迷宮訓(xùn)練4d。水迷宮參照系不變，水溫保持在20±1℃，每天訓(xùn)練2次(am10:00～pm4:00)，每次訓(xùn)練約4次。自主活動(dòng)箱訓(xùn)練180s小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，每天訓(xùn)練1次。試驗(yàn)第5d，剔除水迷宮試驗(yàn)3min內(nèi)不能到達(dá)平臺(tái)的小鼠，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、模型+藥物組，每組各10只。藥物組和模型+藥物組每天嗅覺(jué)吸入丁香酚(純度99％)30min，持續(xù)14d。
1.2.方法嗅球摘除模型的制作方法同上。
給藥方法同上。
神經(jīng)行為學(xué)觀察Lashley III H-W水迷宮同上。
ZIL-2自主活動(dòng)箱同上。
嗅球電生理學(xué)記錄結(jié)果表明丁香酚能明顯增強(qiáng)嗅球的神經(jīng)電活動(dòng)。
同時(shí)進(jìn)行的HRP束路示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，嗅球與基底前腦、間腦、下丘腦、海馬、杏仁核及扣帶回等具有廣泛的纖維聯(lián)系。
2.結(jié)果2.1.水迷宮成績(jī)分析 丁香酚給藥組實(shí)驗(yàn)7d和14d的水迷宮潛伏期明顯小于空白組的水迷宮潛伏期，表明嗅覺(jué)吸入丁香酚能夠增強(qiáng)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力。
2.2.自主活動(dòng)成績(jī)分析 丁香酚給藥組實(shí)驗(yàn)7d時(shí)小鼠自主活動(dòng)明顯高于空白組小鼠自主活動(dòng)，而14d小鼠自主活動(dòng)與空白組無(wú)顯著性差異，表面嗅覺(jué)吸入丁香酚能夠短暫性的增加著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。假手術(shù)組、模型組7d和14d的自主活動(dòng)高于空白組小鼠自主活動(dòng)，可能表明開(kāi)顱手術(shù)能夠增強(qiáng)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。
表1水迷宮成績(jī)分析(x±s，n＝10)


*P＝0.019ΔP＝0.019表2自主活動(dòng)成績(jī)分析(x±s，n＝10)

*P＝0.023ΔP＝0.010□P＝0.005 ^P＝0.01○P＝0.01丁香酚對(duì)于嗅球摘除過(guò)后的小鼠，并沒(méi)有增強(qiáng)其空間學(xué)習(xí)記憶的功能，而正常小鼠給予丁香酚后，空間學(xué)習(xí)記憶的能力有明顯增強(qiáng)，這說(shuō)明藥物丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不是通過(guò)呼吸系統(tǒng)作用的，而可能是通過(guò)嗅球的途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。所以嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究可能對(duì)于AD的預(yù)防、檢測(cè)、有效控制和治療提供新的思路和給藥通路。
四、丁香酚調(diào)控血腦屏障作用及可能機(jī)制1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠，雌雄各半，2月齡，體重20±2g，分組前大籠飼養(yǎng)，分組后小籠飼養(yǎng)，水和食物自取，晝夜自然交替。
1.2動(dòng)物分組將篩選后的48只小鼠隨機(jī)分成4組，包括空白組、嗅覺(jué)吸入組30min，60min，2hr，每組12只，雌雄兼?zhèn)洹?br> 2.結(jié)果通過(guò)嗅覺(jué)吸入后伊文氏藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)30min，60min，2hr透過(guò)血腦屏障的量明顯增加(P＜0.01)。表明丁香酚具有調(diào)切血腦屏障開(kāi)放的能力。
多種途徑給予丁香酚后發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的自主活動(dòng)有短暫的中樞系統(tǒng)神經(jīng)興奮性的變化，而且灌胃組小鼠的神經(jīng)興奮性有持續(xù)性增加，可能原因?yàn)槎∠惴铀幬锏捏w內(nèi)積累。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示嗅覺(jué)吸入組的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力明顯增強(qiáng)，而灌胃組和滴鼻組的小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明藥物丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可能不是通過(guò)血腦屏障和嗅黏膜上皮通路起作用的，而是通過(guò)嗅覺(jué)神經(jīng)通路途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。目前的研究也顯示，確有許多的藥物和潛在的有毒性的外源性化學(xué)物質(zhì)可以通過(guò)嗅覺(jué)途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明一些物質(zhì)如氨基酸、病毒和重金屬等可通過(guò)吞噬或胞飲的方式進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，在神經(jīng)元細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)軸索轉(zhuǎn)運(yùn)至嗅球部位，再直接通過(guò)嗅神經(jīng)通路進(jìn)入大腦。
以上丁香酚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明丁香酚對(duì)于正常小鼠具有增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)的能力，對(duì)于空間學(xué)習(xí)相關(guān)疾病可能有一定的功效。丁香酚能夠增強(qiáng)昆明鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不是通過(guò)呼吸系統(tǒng)作用的，而可能是通過(guò)嗅球的途徑進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮藥效作用的。藥物丁香酚通過(guò)嗅球傳遞到海馬的信息，可能會(huì)導(dǎo)致海馬內(nèi)某種或幾種神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的改變，或者丁香酚本身可能會(huì)干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)的信號(hào)改變，從而可能增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能。
嗅球電生理學(xué)記錄結(jié)果表明丁香酚能明顯增強(qiáng)嗅球的神經(jīng)電活動(dòng)。
同時(shí)進(jìn)行的HRP束路示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，嗅球與基底前腦、間腦、下丘腦、海馬、杏仁核及扣帶回等具有廣泛的纖維聯(lián)系。這些聯(lián)系正是丁香酚有效治療腦部疾病的基礎(chǔ)，這些通路的聯(lián)系表明，嗅球廣泛參與了腦的功能活動(dòng)，通過(guò)嗅球的不中編碼模式的激發(fā)可能達(dá)到治療老年性癡呆，神經(jīng)精神疾病(如抑郁癥等)，調(diào)節(jié)情緒活動(dòng)，改善學(xué)習(xí)記憶能力的基礎(chǔ)。
嗅覺(jué)給藥可有效地使藥物繞過(guò)血腦屏障，靶向傳遞信息到大腦，具有生物利用度高、吸收迅速、起效快、無(wú)損傷性、使用方便等特點(diǎn)，已成為藥物制劑領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。通過(guò)對(duì)嗅覺(jué)系統(tǒng)工作方式的深入理解，可認(rèn)為丁香酚可能是通過(guò)嗅球把嗅覺(jué)沖動(dòng)傳遞到海馬，使海馬內(nèi)某種或幾種神經(jīng)遞質(zhì)得表達(dá)發(fā)生改變或者丁香酚本身干預(yù)嗅覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)興奮性，從而影響嗅覺(jué)傳導(dǎo)的信號(hào)使大腦的學(xué)習(xí)記憶發(fā)生改變，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD病等的治療提供了新的思路。
權(quán)利要求
1.一種防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的經(jīng)鼻吸收藥物，其特征在于其中含有下列藥理活性成分丁香酚，或丁香酚鹽，或者丁香酚的異構(gòu)體，或者丁香酚、丁香酚鹽、丁香酚的異構(gòu)體中任意一種、二種或三種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于其中還含有牛黃，蘇合香，冰片，麝香中的一種或多種成份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于其中還含有下列一種或多種藥理活性成分八角茴香，樟木香，薄荷原香，留蘭香，薄荷腦，薄荷素香，羅勒香，甜羅勒，白蘭，熏衣草，羅勒，檸檬香，萊姆，洋甘菊，檸檬香茅，巖蘭草，馬郁蘭，白千層，香蜂草，豆蔻，野鼠尾草，丁香花蕾香，乳香，廣霍香，天竺葵，迷迭香，香紫蘇，依蘭，檀香，安息香，月桂，乳香，香柏木，留蘭香，小茴香，香蘭素/乙基香蘭素，檸檬，桉葉香，冬青香，桉葉香，麝香草酚，桂皮香，甲/乙基麥芽酚，甲基環(huán)戊烯醇酮，桂花，紫蘇葶，麝香，留蘭香，天然苯甲醛，對(duì)羥基苯甲醛，甲/乙基香蘭素，茉莉，夜來(lái)香，白玉蘭，玫瑰，薰衣草，土金香；前述物質(zhì)的的鹽、衍生物、異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于丁香酚鹽是丁香酚的鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、或有機(jī)酸鹽，丁香酚的異構(gòu)體是異丁香油酚，去氫雙異丁香油酚，二聚體丁香酚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的藥物，其特征在于其中還含有下列滲透促進(jìn)劑中的一種或多種①合成的表面活性劑聚氧乙烯-9-月桂醚、硫代月桂醇鈉；②膽酸衍生物牛黃膽酸鈉、葡萄糖膽酸鈉，脫氧膽酸鈉和脫氧牛黃膽酸鈉；③烷基取代的β-環(huán)糊精類；④環(huán)形肽類桿菌肽；⑤其他乙烯二胺四醋酸二鈉，檸檬酸和聚丙烯酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的藥物，其特征在于所述的藥物劑型為滴鼻劑、粉末劑、微球制劑、脂質(zhì)體劑、孔劑、膜劑、凝膠劑、噴霧劑、軟膏劑，由藥理活性成分與相應(yīng)的常規(guī)制藥輔料組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的藥物，其特征在于所述的藥理活性成分采用超微粉碎后的細(xì)粉或納米細(xì)粉。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種防治老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶及調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性的經(jīng)鼻吸收藥物，其特征在于其中含有下列藥理活性成分丁香酚，或丁香酚鹽，或者丁香酚的異構(gòu)體，或者丁香酚、丁香酚鹽、丁香酚的異構(gòu)體中任意一種、二種或三種的混合物。其中還可以添加其它的天然香料成分，本發(fā)明藥物經(jīng)鼻給藥，避免了消化道反應(yīng)及肝臟的首過(guò)效應(yīng)，并具有起效作用快、生物利用度高、腦靶向的特點(diǎn)，可用于治療老年性癡呆和中老年記憶障礙或提高青少年記憶、學(xué)習(xí)能力、調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性等。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1861060SQ20061003944
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2006年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者李光武, 曹金海, 任振華, 唐敏, 王海萍 申請(qǐng)人:李光武