專利名稱：血管生成抑制劑hm－3及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。
二.
背景技術(shù)：
研究表明，實(shí)體瘤生長(zhǎng)依賴于新生血管生成，新生血管不僅可以提供腫瘤所需要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，排泄代謝產(chǎn)物，而且是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的途徑。因此，阻斷新生血管形成可能成為阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的手段，從而激發(fā)了對(duì)促血管生成分子和抗血管生成分子的廣泛研究。
根據(jù)腫瘤的發(fā)展，血管生成分為兩個(gè)階段血管前期和血管期。在血管前期，腫瘤穩(wěn)步生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)速度基本與細(xì)胞凋亡速度持平；在血管期，腫瘤細(xì)胞組織快速增長(zhǎng)，組織浸潤(rùn)，血源性播散腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的增生速度并未改變，而凋亡速度減緩(O’Reilly，et al.，1996)。因此，根據(jù)腫瘤血管生成的不同階段的生理狀態(tài)和生化改變?yōu)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)各種血管生成抑制劑，控制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，就可以達(dá)到治療腫瘤的目的。在阻斷腫瘤血管生成方面，現(xiàn)在已經(jīng)研究、發(fā)現(xiàn)了多種血管生成抑制劑。最近，越來(lái)越多的研究顯示，針對(duì)腫瘤血管期，即腫瘤已經(jīng)建立的血管設(shè)計(jì)藥物，可能有著更廣闊的治療前景。很早，人們就知道腫瘤內(nèi)皮和周圍的基質(zhì)與正常組織不同，但直到現(xiàn)在才從分子水平認(rèn)識(shí)到這種差別。與正常組織相比，腫瘤血管是高度無(wú)序、扭曲的(Konerding，M.A.，et al.，2001)，很難區(qū)別動(dòng)脈和靜脈，經(jīng)常出現(xiàn)分流(血液從動(dòng)脈直接流入靜脈)。腫瘤毛細(xì)血管中的血流緩慢，有時(shí)出現(xiàn)靜止甚至倒流(Tozer，G..M.，1990)。血液和血管內(nèi)皮出現(xiàn)低氧性缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏和酸性物質(zhì)，在此環(huán)境下，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激，與正常組織內(nèi)皮細(xì)胞相比，增殖迅速，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子，如成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，并激活血管新生(Toyokuni，S.，et al，1995)。
內(nèi)皮抑素是能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一類血管生成抑制劑，由O‘Reilly等首次發(fā)現(xiàn)。內(nèi)皮抑素是膠原XVIII的C-端片段，分子量為20kDa，能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各種原發(fā)腫瘤。內(nèi)皮抑素能夠與整合素α5β1相互作用，預(yù)示著α5β1可能是endostain的功能靶點(diǎn)。Endostatin具有Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，這對(duì)其抗血管生成活性和分子的穩(wěn)定性很重要。
國(guó)內(nèi)外大量研究表明，內(nèi)皮抑素具有體內(nèi)抑制腫瘤血管生成以及抗腫瘤作用；同時(shí)研究表明，利用內(nèi)皮抑素的抗血管生成治療方法的最大潛力在于克服了腫瘤治療中最棘手的問(wèn)題耐藥性和組織毒性。這是因?yàn)椴还軄?lái)源于任何組織的實(shí)體腫瘤，治療是針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的，內(nèi)皮細(xì)胞不會(huì)發(fā)生變異，也很少發(fā)生突變，因此不會(huì)導(dǎo)致耐藥性；而且內(nèi)皮細(xì)胞是唯一顯露于藥物的細(xì)胞，克服了藥物可能到達(dá)腫瘤中心的難題。盡管內(nèi)皮抑素呈現(xiàn)出非常誘人的前景，但其缺陷也非常明顯在動(dòng)物體內(nèi)使用時(shí)，用量很高，在小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)時(shí)，內(nèi)皮抑素達(dá)到數(shù)十毫克/公斤體重，當(dāng)這些血管生成抑制劑在人體內(nèi)使用時(shí)，使用劑量會(huì)更高。這樣大的藥物使用劑量勢(shì)必增加日后該類藥物毒副作用發(fā)生的可能性，造成該類藥物質(zhì)量控制難度加大、生產(chǎn)規(guī)模和生產(chǎn)成本增大、藥物價(jià)格居高。因此，一個(gè)好的抗血管生成藥物應(yīng)該有便于生產(chǎn)、成本低、使用很低劑量的藥物，就能達(dá)到高效的抑制血管生成的效果。
盡管很早就有人提出腫瘤血管靶向性治療實(shí)體瘤的想法(Denekamp，J.，1990)，但是缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)。直到1993年，兩位學(xué)者利用內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的MHCII抗原，將其抗體與蓖麻蛋白融合，成功地運(yùn)輸?shù)叫∈竽[瘤內(nèi)皮細(xì)胞，此抗體-蓖麻蛋白融合體進(jìn)入并殺死腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、瓦解血管，使腫瘤消退(Burrows，F(xiàn).J.& Thorpe，P.E.，1993)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明腫瘤血管可以作為治療的靶點(diǎn)有效地清除腫瘤。要獲得腫瘤血管靶向性治療分子，首先需要篩選腫瘤血管特異性表達(dá)的分子標(biāo)記，才能針對(duì)此種分子設(shè)計(jì)治療方案。
其中對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)的重要腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記之一是整合素家族的部分成員。
整合素是多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體，廣泛存在于細(xì)胞表面，是一個(gè)相當(dāng)大的受體家族。這類受體由一條α鏈和一條β鏈組成，在與配體的結(jié)合中都起作用，不同α鏈和β鏈的組合決定了配體的特異性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)15種α鏈和9種β鏈。在腫瘤細(xì)胞中，整合素的組成成分發(fā)生了復(fù)雜的變化，大體上講，參與組織結(jié)構(gòu)的整合素?cái)?shù)量下降，而與細(xì)胞遷移有關(guān)的整合素?cái)?shù)量會(huì)上升。整合素α5β1、αvβ5、αvβ3等都與血管新生和細(xì)胞遷移有關(guān)，其中αvβ3可影響癌變中的幾個(gè)非常重要的過(guò)程。它能與多種細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白結(jié)合，細(xì)胞的遷移是由細(xì)胞外基質(zhì)決定的，而在具有遷移能力的腫瘤細(xì)胞中，αvβ3表達(dá)量升高，由于它能與多種細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，這使腫瘤細(xì)胞可以在幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)上遷移和侵入；αvβ3還能夠與金屬蛋白酶結(jié)合，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而更有利于侵入；另外兩個(gè)受αvβ3影響的過(guò)程是細(xì)胞凋亡和血管新生，在參與血管新生的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，αvβ3的表達(dá)量也升高。在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，血管生長(zhǎng)因子類與整合素的表達(dá)有著密切的關(guān)系，如VEGF、FGF都能夠上調(diào)αvβ3的表達(dá)?？功羦β3單克隆抗體能夠抑制它的功能，因此能夠促進(jìn)凋亡和抑制血管新生。目前正在研究開(kāi)發(fā)的αvβ3抗體有Vitaxin(LM609)，臨床上用于抗血管生成治療(Gutheil，J.C.et al.2000)，但有資料報(bào)道效果并不令人滿意(Posey，J.A.et al.2001)。
整合素家族中一部分成員(α5β1、αvβ1、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、αvβ6)有一個(gè)共同特征，即能夠識(shí)別含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列的配體-細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，這一重要發(fā)現(xiàn)是Pasqualini&Ruoslahti利用噬菌體展示技術(shù)證明的(1997)。Christopher(19999)等認(rèn)為RGD能夠誘導(dǎo)凋亡，其作用是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞后誘導(dǎo)與凋亡相關(guān)的caspase-3自我加工并產(chǎn)生活性實(shí)現(xiàn)的。環(huán)肽RGD本身半衰期很短，在體內(nèi)會(huì)被腎臟和肝臟快速清除，這一點(diǎn)在小鼠、兔和人體內(nèi)都得到了證實(shí)。但RGD序列可以作為一種載體，與其它試劑偶聯(lián)并將其靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤血管內(nèi)皮。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是將抑制血管生成的內(nèi)皮抑素的氨基酸序列的C端加上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，構(gòu)建了一種對(duì)整合素具有結(jié)合作用和親和性的血管生成抑制劑。
本發(fā)明的目的是提供一種與整合素有親和性或結(jié)合能力的高效血管生成抑制劑，本發(fā)明的高效血管生成抑制劑可以進(jìn)行不同的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明應(yīng)用PCR擴(kuò)增得到目的基因，克隆于原核表達(dá)載體，用基因工程手段獲得產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與內(nèi)皮抑素比較，具有高效、特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗腫瘤效果，并且用量小，相應(yīng)減少了藥物治療的副作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.本發(fā)明所述血管生成抑制劑為Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His其中在血管生成抑制劑HM-3的第185個(gè)氨基酸X可以無(wú)或被任意天然或非天然存在的氨基酸取代。
2.本發(fā)明所述血管生成抑制劑的制備方法(1)從人的肝臟組織提取人總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR，克隆內(nèi)皮抑素基因，以此序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上適合克隆的酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增，獲得HM-3基因。將基因克隆于載體中，篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析鑒定。
(2)HM-3基因與原核表達(dá)載體重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)HM-3，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。
(3)進(jìn)行包涵體蛋白分離、溶解，并進(jìn)行Ni+親和層析分離純化HM-3蛋白產(chǎn)物，收集穿過(guò)液，透析，凍干。
3.本發(fā)明所述血管生成抑制劑的活性測(cè)定方法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。
4.本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果為產(chǎn)物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都能夠大幅度改善和提高現(xiàn)有血管生成抑制劑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和抗腫瘤效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑科學(xué)、合理、可行有效，能作為制備治療人類新生血管生成有關(guān)疾病的藥物及實(shí)體腫瘤的治療藥物。
四.


圖1 15％ SDS-PAGE分析純化的重組HM-3。1分子量標(biāo)記；215μg純化的HM-3。
圖2內(nèi)皮細(xì)胞分析HM-3抑制增殖情況。
五.
具體實(shí)施例方式1. HM-3基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建取內(nèi)皮抑素基因?yàn)槟０?本試驗(yàn)室提供)；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位點(diǎn)；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位點(diǎn)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，進(jìn)行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表達(dá)載體pET29a(Novagen)，PCR篩選陽(yáng)性克隆，核苷酸序列分析證實(shí)序列發(fā)生了設(shè)計(jì)的突變。
合成的引物15′GCCATATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGG 3′合成的引物25′GGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCATGCACCACCACCACC 3′其中，引物1編碼了NdeI位點(diǎn)和內(nèi)皮抑素的部分序列，引物2編碼XhoI位點(diǎn)和含有Arg-Gly-Asp序列的基因。
2.為了比較本發(fā)明所設(shè)計(jì)的血管生成抑制劑HM-3的實(shí)際效果，本實(shí)例中我們同時(shí)克隆表達(dá)了內(nèi)皮抑素基因。
3.重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。在細(xì)胞OD600＝0.5時(shí)，用1mM IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，收集細(xì)胞，加入1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積的GuNTA-0 Buffer(20mM Tris-HClpH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl)和1mM PMSF。將細(xì)胞懸浮起來(lái)，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。15000轉(zhuǎn)/分，4度離心15分鐘。取上清，置于冰上備用或-20度保存。
4.重組蛋白HM-3分離純化將NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl)洗。將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/小時(shí)左右，用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小時(shí)左右。用5倍NTA體積GuNTA-200(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％ Glycerol，6M Guanidium HCl，200mM Imidazole)洗脫，流速控制在15ml/小時(shí)左右，收集洗脫液，4℃透析，透析液為buffer A(10mM Tris-HCl，1mM氧化型谷胱甘肽和1mM還原型谷胱甘肽，pH7.4)，6-8h換液一次，最后透析一次，透析液為buffer B(10mM Tris-HCl，pH7.4)，SDS/PAGE分析。
層析結(jié)果如圖1所示。
5.內(nèi)皮細(xì)胞增殖分析培養(yǎng)BCE細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞，方法培養(yǎng)液DMEM含10％滅活小牛血清(BCS)，1％抗生素及3ng/ml bFGF。細(xì)胞增殖分析方法如下PBS洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至25,000cells/ml。將細(xì)胞移入6孔板(0.5ml/well)，培養(yǎng)24h.，更換培養(yǎng)基為1mlDMEM，5％BCS，1％抗生素，1ng/ml bFGF，每孔加入不同劑量的樣品，進(jìn)一步培養(yǎng)48h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
結(jié)果顯示重組HM-3能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞-BCE細(xì)胞的增殖，而對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞-NIH 3T3則沒(méi)有抑制作用。抑制BCE增殖的ED50大約為0.3μg/ml，而內(nèi)皮抑素的ED50大約為0.5μg/ml。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑確實(shí)顯著提高了現(xiàn)有的血管生成的生物活性。
結(jié)果如圖2所示。
6.動(dòng)物體內(nèi)抗肺癌實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的鼠Lewis肺癌細(xì)胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm離心5min，重懸于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠體側(cè)皮下接種5×105細(xì)胞0.1ml。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到200mm3-300mm3，隨機(jī)將小鼠分組，每組12只，其中一組接受HM-3治療，一組用內(nèi)皮抑素治療，以上兩組劑量均為5mg/kg/d，對(duì)照注射PBS。治療采用在接種腫瘤對(duì)側(cè)皮下注射方法。每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，采用公式腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬2×0.52，治療效果用給定時(shí)間內(nèi)的腫瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治療組腫瘤體積，C＝對(duì)照組腫瘤體積。
如表1所示，結(jié)果表明，在第10天時(shí)，HM-3的腫瘤抑制率為85％，而內(nèi)皮抑素的腫瘤抑制率為37％(兩兩比較P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的高效血管生成抑制劑能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。
表1.HM-3體內(nèi)抑制鼠Lewis肺癌的效果

7.小鼠HAC肝癌模型抑瘤效應(yīng)將培養(yǎng)的鼠HAC肝癌細(xì)胞株用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm離心5min，重懸于PBS，在F1(6-8周)小鼠體側(cè)皮下接種5×105細(xì)胞0.1ml。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到200mm3-300mm3，隨機(jī)將小鼠分組，每組12只，治療采用在接種腫瘤對(duì)側(cè)皮下注射方法。每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，采用公式腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬2×0.52，治療效果用給定時(shí)間內(nèi)的腫瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治療組腫瘤體積，C＝對(duì)照組腫瘤體積。
分陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(內(nèi)皮抑素)與HM-3治療組進(jìn)行研究，皮下注射給藥，如表2所示，結(jié)果表明，在第10天時(shí)，治療組抑瘤率為78％，陽(yáng)性對(duì)照內(nèi)皮抑素組30％(兩兩比較P＜0.05)。
表2.HM-3體內(nèi)抑制鼠HAC肝癌的效果

8. HM-3對(duì)人胃腺癌裸小鼠移植瘤SGC-7901的實(shí)驗(yàn)治療作用取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1.5mm3左右，在無(wú)菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后將動(dòng)物隨機(jī)分組。使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察被試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)為每2天1次，每次測(cè)量同時(shí)還需稱鼠重。實(shí)驗(yàn)組皮下注射蛋白，每周5次，共2周，陰性對(duì)照組同時(shí)給等量生理鹽水。腫瘤體積(tumor volume，TV)的計(jì)算公式為TV＝0.52×a×b2其中a、b分別表示長(zhǎng)寬。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積。抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/C(％)，計(jì)算公式如下T/C(%)=TRTVCRTV×100]]>TRTV治療組瘤體積；CRTV陰性對(duì)照組瘤體積。
如表3所示，結(jié)果表明，在第10天時(shí)，治療組抑瘤率為50％，陽(yáng)性對(duì)照內(nèi)皮抑素組39％(兩兩比較P＜0.05)。
表3.HM-3對(duì)人胃腺癌裸小鼠移植瘤SGC-7901的實(shí)驗(yàn)治療作用

d0分籠給藥時(shí)間血管生成抑制劑HM-3序列表<110>申請(qǐng)人姓名徐寒梅<120>發(fā)明名稱 血管生成抑制劑HM-3及其制備方法和應(yīng)用<160>序列表中序列的個(gè)數(shù)2<210>序列相對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)符1<211>序列長(zhǎng)度207個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識(shí)符1Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Aal-Leu-Asn-Ser-Pro-3 6 9 12 15 18Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-21 24 27 30 33 36Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-39 42 45 48 51 54 57Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-60 63 66 69 72 75Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-78 81 84 87 90 93Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-96 99 102 105 108 111 114Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-117 120 123 126 129 132Ser-Tyr-Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-135 138 141 144 147 150Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-153 156 159 162 165 168 171Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-Ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-
174 177 180 183 186 189Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His192 195 198 201 204 207<210>序列相對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)識(shí)符2<211>序列長(zhǎng)度206個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識(shí)符2Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-3 6 9 12 15 18Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-21 24 27 30 33 36Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-39 42 45 48 51 54 57Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-60 63 66 69 72 75Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-78 81 84 87 90 93Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-96 99 102 105 108 111 114Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-117 120 123 126 129 132Ser-Tyr-Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-135 138 141 144 147 150Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-153 156 159 162 165 168 171Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-174 177 180 183 186 189Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His192 195 198 201 20權(quán)利要求
1.一種血管生成抑制劑，其特征在于該血管生成抑制劑是具有整合素、肝素親和性和結(jié)合能力的蛋白，其序列為Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管生成抑制劑，其特征在于在多肽Met-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Lys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala的羧基端連接有對(duì)整合素家族具有親和性和結(jié)合能力的多肽-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His。
3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述，血管生成抑制劑的生產(chǎn)方法，其特征在于構(gòu)建羧基端含有-ser-Lys-X-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His序列的內(nèi)皮抑素基因，進(jìn)行基因工程表達(dá)，分離純化重組蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述，其特征在于羧基端X無(wú)或?yàn)槿我庖环N天然或非天然氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述血管生成抑制劑，在制備治療人類新生血管生成有關(guān)疾病實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高效血管生成抑制劑及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)了具有整合素親和性的高效血管生成抑制劑HM－3，該抑制劑含有血管生成抑制蛋白內(nèi)皮抑素全部氨基酸序列，在其羧基端連接含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的多肽。本發(fā)明HM－3是通過(guò)基因工程方法在大腸桿菌中表達(dá)，進(jìn)行包涵體蛋白分離、溶解和復(fù)性、離子交換層析分離純化得到HM－3，產(chǎn)物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都能夠顯著提高現(xiàn)有血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和抗腫瘤效果，能夠作為實(shí)體瘤包括胃癌、肺癌、肝癌在內(nèi)的治療藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1830487SQ20061003948
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者徐寒梅, 康志安 申請(qǐng)人:徐寒梅