專利名稱：免疫刺激復合物(ISCOMs)采用口服、浸浴方法在魚類免疫中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，特別是采用口服、浸浴方法在魚類免疫中的應用。
背景技術：
水產動物疫苗的免疫方式主要有注射、浸浴和口服三種方式，注射免疫雖然可以得到很好的免疫效果，但是由于需要逐個針對個體進行，因此這種方式并不適合在大規(guī)模的養(yǎng)殖中應用。
水產動物尤其是魚類擁有由體表、胃腸道、鰓構成的發(fā)達粘膜系統(tǒng)，粘膜系統(tǒng)除了參與非特異免疫外，還能介導特異性免疫保護，但由于魚類胃腸道消化液豐富，傳統(tǒng)的疫苗受腸、胃蛋白酶以及體表粘膜中各種酶的影響，在經口服或浸浴免疫過程中有效抗原損失嚴重，且穿透性不高，所以效果不理想。因此如何在口服或浸浴免疫過程中防止有效抗原被破壞一直是水產疫苗研究的熱點。也是研制口服型和浸浴型漁用疫苗亟待解決的關鍵技術。
為了避免抗原被降解，研究人員想到了中和消化酶的方法，例如Mclean等(1990年)將蛋白酶抑制因子等用于加強虹鱒的口服免疫研究。還有一種保護抗原的措施是制備膠囊型疫苗，目前已有多種類型的膠囊型疫苗在中應用，例如，Lillehaug等(1989年)將凍干的弧菌疫苗分別用膠囊形式和抗酸物質包被的形式經口免疫虹鱒，然而以這兩種形式制成的疫苗免疫效果都不理想，相反未加任何處理的疫苗反而有一定的保護作用。這表明，抗原的攝取效率也是影響口服免疫的重要因素，膠囊和抗酸物質雖然緩解了胃腸道的消化液對抗原的降解，但同時也阻礙了抗原的吸收。
近年來，研究人員開始研究生物型口服疫苗膠囊，來避免抗原被降解。作為膠囊的候選生物主要有沙門氏菌、志賀氏菌、鹵蟲等。作為細胞內寄生的細菌，高度致弱的沙門氏菌和志賀氏菌通過口服可以很好地將目的抗原攜帶到免疫動物體的腸道粘膜免疫組織，但是細菌本身作為一種外源性物質，對動物體也是強免疫源，影響了載體的二次應用；另外，沙門氏菌作為水質污染的重要指標，作為魚用疫苗的傳遞載體將可能干擾環(huán)境水質的有效監(jiān)測。這些因素大大降低了高度致弱的沙門氏菌和志賀氏菌作為魚用疫苗傳遞載體的實用性。余俊紅等(2001年)將鰻弧菌微膠囊疫苗以直接拌入餌料法和鹵蟲攜帶法等兩種方法口服免疫接種紗魚魚苗，一周后活茵攻毒。結果表明，以鹵蟲攜帶的生物微膠囊疫苗組的一周累積死亡率為(25％)遠低于對照組(95％)。這種免疫方式有良好的發(fā)展前景，但也存在一定的不足，由于魚類多在魚苗期食用這種餌料，因此存在免疫耐過性的風險。鹵蟲攜帶疫苗也難以按照工業(yè)化和標準化的方式進行制備。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足之處而提供免疫刺激復合物以浸浴或口服方式在魚類免疫中的應用。
本發(fā)明涉及免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其是以浸浴或口服的方式進行的。
所謂的口服免疫指的是將免疫刺激復合物添加于飼料中經魚類胃腸道給予疫苗的免疫。所謂的浸浴免疫指的是將免疫刺激復合物添加于養(yǎng)殖水體，經魚體表、鰓免疫。
所述的免疫刺激復合物主要包含有病原體抗原物質、嵌入劑QuilA、膽固醇、卵磷脂。
QuilA是從植物提取出的一種皂苷類物質，在這基礎上制備的免疫刺激復合物(ISCOMS)作為口服疫苗的一種形式與其他類型抗原相比有其自身的優(yōu)勢。首先ISCOMs的主要成份QuilA能直接作用于微絨毛，具有疏松胞間連接，促進胞飲的作用，這些作用有助于提高大分子抗原的穿透性，提高抗原的吸收；其次由嵌入劑QuilA、膽固醇、卵磷脂與抗原在溶液中相互作用而形成的免疫刺激復合物，可耐受腸、胃蛋白酶，減少吸收過程中有效抗原的損失，提高抗原的吸收量；第三，ISCOMs的特殊構型使抗原可在表面大量集中，提高抗原的吸收量。最后，ISCOMs可通過刺激MALT，誘導白介素、干擾素產生，活化T輔助細胞(Th細胞)、細胞毒性殺傷細胞(CTL細胞)、B淋巴細胞。具有產生全面免疫應答的能力。由于ISCOMs可通過粘膜途徑提呈抗原，并可通過口服給藥且無毒副作用，因此非常適合在水產疫苗的研制中應用。
所述的病原體抗原物質或為病原體蛋白質、或為多糖類抗原物質。
所述的病原體蛋白質中的病原體主要為細菌、病毒、寄生蟲病原體中含的蛋白。
所述用于免疫的魚包括淡水魚和海水魚，尤其適用于鰻魚、大黃魚、羅非魚。
所述的免疫刺激復合物對魚類的口服、浸浴免疫或為一次免疫，或為二次免疫，或為加強免疫。
所述的二次免疫為在初次免疫7-14天，再用同樣的方法和劑量再免疫一次。
所述的加強免疫為在二次免疫后，1-3個月再用同樣的方法和劑量再免疫一次。
魚類在接受初次疫苗免疫刺激時，在疫苗中特定抗原作用下，含特定抗原受體的免疫細胞發(fā)生增殖，產生針對特定抗原的特異性效應細胞和特異性抗體。從抗原的刺激，到發(fā)生免疫效應有一個過程，因此從免疫接種到產生免疫效應有一段時間。同時由于特異性的免疫細胞數量較少，因此反應強度也較弱。在初次免疫后，機體的免疫細胞發(fā)生了選擇性的增殖，產生免疫記憶細胞，在二次免疫時，大量特異的免疫細胞能在短期內被激活，因此二次免疫后，從免疫到產生免疫效應的時間大為縮短，免疫效應的強度和持續(xù)時間也顯著強于初次免疫。魚類的免疫系統(tǒng)與哺乳動物比較相對不完善，因此采用二次以上免疫，能更好地激發(fā)魚類產生免疫力，維持足夠長的免疫周期。
為了更好的理解本發(fā)明的實質，下面分別用由嗜水氣單胞菌β-hemA重組菌制備的免疫刺激復合物(ISCOMs)對鰻鱺采用浸泡方法免疫以及用嗜水氣單胞菌β-hemA重組菌制備的免疫刺激復物(ISCOMs)對鰻鱺采用口服方法免疫來說明免疫刺激復合物采用口服或免疫方法在魚類免疫中的應用。
一嗜水氣單胞菌β-hemA重組菌制備的免疫刺激復合物(ISCOMs)對鰻鱺采用浸浴方法免疫1.材料與方法1.1材料β-hemA為嗜水氣單胞菌β-溶血素，是一種蛋白成份。β-hemA重組菌由β-溶血素基因插入表達質粒pCDNA3.0后，再導入工程菌E.coliDH5α后得到。其表達產物含有β-溶血素。主要試劑QuilA購自Accurate chemical &Scientific corporation公司；Mega-10購自華美生物工程公司；cellproliferation ELISA，Brdu試劑盒購自羅氏公司；供試鰻鱺購自福建省長樂海林鰻鱺場，規(guī)格為每尾50g。
TSB培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
TSA培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
1.2方法1.2.1.細菌培養(yǎng)將β-hemA菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，接種于10ml的TSB培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)，當OD值為1.0時，取5ml接種于500ml的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，收獲。
1.2.2.胞外產物提取
10000rpm離心30min，取上清，加入硫酸銨至60％飽和度，4℃過夜，10000rpm離心30min，收集沉淀，用0.01M PBS(pH 7.2)重懸，透析，每4h換液一次，換液5～6次，即得粗提胞外產物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.2.3.蛋白含量的測定用DU Series 7000分光光度計(BECKMAN)按照Bradford法測定，在波長595nm處測得A值，參照標準曲線得出蛋白的濃度。
1.2.4.ISCOMs的制備濃縮胞外產物至4mg.mL-1，用1M檸檬酸處理2h后加入Mega-10至終濃度為2％，37℃裂解4h，加入QuilA至終濃度為0.1％，然后加入膽固醇、卵磷脂(預先用氯仿溶解)至終濃度為125μg.mL-1，冰浴超聲波處理8-10min，真空負壓去氯仿，先用0.01M檸檬酸處理透析4h，再用0.01MPBS(pH 7.2)透析72h，每4h換液一次。
1.2.5.電鏡觀察β-hemA-ISCOMs取待測樣品10μL滴銅網，用2％醋酸鈾染色，在JEM-1200EX電鏡上觀察。
1.2.6.ISCOMs免疫鰻鱺免疫方案如表1所示，采用二次免疫，分9組進行，每組15尾，15天后第二次免疫，每次浸泡60min，供試鰻鱺規(guī)格均為30g左右，室內養(yǎng)殖，溫度24℃，每日換水1/3。其中PCB代表含β-溶血素基因重組菌，PC代表不含β-溶血素但含有pCDNA3.0空質粒的工程菌，ECPs代表胞外產物。BSA為牛血清白蛋白。PBS為PH 7.2磷酸鹽緩沖液，濃度為0.01M。
表1ISCOMs免疫方案(分9組)


1.2.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測鰻鱺血清抗體實驗組1組、2組、3組、4組、6組、7組、8組、9組在攻毒前(一免后第44d)每組各取4尾鰻鱺應用ELISA檢測血清抗體。重組菌PCB表達產物(PCB ECPs)按12μg.mL-1的濃度包被96孔酶標板，空白對照用PBS包被，每孔50μL，4℃過夜。倒去孔內溶液，用含2％BSA的PBS-T室溫封閉2h，洗滌后加入鰻鱺血清(1∶100)，每孔50μL，室溫反應1h，PBS-T洗滌三次，然后加入鼠抗鰻鱺Ig的單克隆抗體(二抗，7E2與8H1混合以1∶1000稀釋，本室制備)，每孔50μL，室溫反應1h，同上洗滌3次；加入羊抗鼠HRP標記的IgG(三抗，1∶5000稀釋)，室溫反應1h，同上洗滌3次，再用蒸餾水沖洗1次。最后加入50μL的反應底物OPD，室溫10-15min后顯色，用2mol/LH2SO4終止反應。用酶聯儀Microplate Reader(BioRad Mode 1550)在495nm處讀取OD值。
1.2.8鰻鱺淋巴細胞轉化試驗對1組、4組、6組、8組、9組在攻毒前(一免后第44d)每組各取四尾鰻鱺，在無菌條件下取出脾臟，0.01M無菌PBS(pH 7.2)液洗滌，擠壓出細胞液，用針筒吹打分散細胞。在離心管底部鋪上與細胞液等體積的淋巴細胞分層液，上面鋪上細胞液，20,00rpm離心10min，吸出中間白色層，1640液重懸，細胞計數，使細胞含量為3×106，加入ConA終濃度為5μg.mL-1，分別滴入96孔微量細胞板，每孔100μl，每份樣品做六個平行孔。在27℃的生化培養(yǎng)箱密閉培養(yǎng)3天，每孔加入BrdU標記液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)17h，300g離心10min，棄去上清液，60℃烘箱中烘烤15min，加入FixDenat固定液200μl/well，孵育30min后棄去固定液，加入anti-BrdU-POD工作液100μl/well，繼續(xù)孵育90min，加入洗劑液300μl/well，洗劑三次，最后加入底物顯色液，反應17min后用1M H2SO4 25μl/well終止反應。設置空白，空白只有培養(yǎng)基，在800型酶標儀上讀取OD450值。
1.2.9.攻毒保護實驗一次免疫后第45天對各組攻毒，每組六尾鰻鱺，用TPS-30菌株腹腔注射攻毒，攻毒劑量為5×107CFU(5×LD50)。
2結果2.1.鰻鱺血清抗體一次免疫后第44天，1組、2組、3組、4組、6組、7組、8組、9組鰻鱺血清抗體結果如圖1所示，經方差分析，1組血清抗體效價OD值顯著高于2組與3組(p＜0.05)，2組血清抗體OD值顯著高于3組(p＜0.05)，1組血清抗體OD值顯著高于6組與8組(p＜0.05)。
2.4.鰻鱺淋巴細胞轉化試驗結果免疫后第44d，1組、4組、6組、8組、9組鰻鱺淋巴細胞轉化試驗結果如圖2所示，經方差分析，1組和4組淋轉顯著高于6組、8組和9組(p＜0.05)，其中1組與4組之間及6組、8組、9組之間無顯著差異。
2.1.免疫保護試驗結果本研究用濃度為5×107CFU(5×LD50)的嗜水氣單胞菌TPS30腹腔注射攻毒，攻毒48h內為死亡高峰期。攻毒1周后不再有死亡現象出現。攻毒結果如表2所示經χ2檢驗，7組與1組、2組、6組、9組相比差異均顯著(P＜0.05)，1組與2組、6組、9組相比差異顯著(P＜0.05)。
表2對照和免疫鰻鱺對TPS30攻擊存活率比較


3、結論通過鰻鱺免疫保護試驗證實，免疫刺激復合物ISCOMs用于浸浴免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力。誘導免疫保護。同等劑量免疫時，ISCOMs組的抗體效價明顯高于無佐劑組與ISM1312佐劑組。在30-120mg.L-1濃度范圍內，免疫保護水平與疫苗的使用濃度正相關。二嗜水氣單胞菌β-hemA重組菌制備的免疫刺激復合物(ISCOMs)對鰻鱺采用口服方法免疫1.材料與方法1.1材料同浸浴方法中的材料相同1.2方法1.2.1.細菌培養(yǎng)將β-hemA菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，接種于10ml的TSB培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)，當OD值為1.0時，取5ml接種于500ml的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，收獲。
1.2.2.胞外產物提取10000rpm離心30min，取上清，加入硫酸銨至60％飽和度，4℃過夜，10000rpm離心30min，收集沉淀，用0.01M PBS(PH 7.2)重懸，透析，每4h換液一次，換液5～6次，即得粗提胞外產物，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.2.3.蛋白含量的測定用DU Series7000分光光度計(BECKMAN)按照Bradford法測定，在波長595nm處測得A值，參照標準曲線得出蛋白的濃度。
1.2.4.ISCOMs的制備濃縮胞外產物至4mg.mL-1，用1M檸檬酸處理2h后加入Mega-10至終濃度為2％，37℃裂解4h，加入QuilA至終濃度為0.1％，然后加入膽固醇、卵磷脂(預先用氯仿溶解)至終濃度為125μg.mL-1，冰浴超聲波處理8-10min，真空負壓去氯仿，先用0.01M檸檬酸處理透析4h，再用0.01MPBS(pH 7.2)透析72h，每4h換液一次。
1.2.5.電鏡觀察β-hemA-ISCOMs取待測樣品10μL滴銅網，用2％醋酸鈾染色，在JEM-1200EX電鏡上觀察。
1.2.6.ISCOMs經口免疫鰻鱺一次免疫實驗采用一次免疫，分3組進行，每組18尾，分組和免疫方法如表3所示。供試鰻鱺規(guī)格均為30g左右，室內養(yǎng)殖，溫度24℃，每日換水1/3。其中PCB ECPs代表含β-溶血素基因重組菌胞外產物，PCBECPs ISCOMs代表由PCB ECPs制成的ISCOMs。PBS為PH 7.2磷酸鹽緩沖液，濃度為0.01M。
表3β-hemA-ISCOMs一次口服免疫分組

免疫后第10d和第20d每組分別取4尾鰻鱺進行淋巴細胞轉化實驗，具體的淋巴細胞轉化實驗方法同實例1。免疫后第30d進行攻毒保護實驗，用嗜水氣單胞菌TPS-30以1.5×107CFU.ml-1的濃度腹腔注射攻毒，連續(xù)觀察一周。PCB ISCOMs組的攻毒存活率為44.4％，PCB組的攻毒存活率12.5％，對照組的攻毒存活率12.5％。
二次免疫實驗采用二次免疫，分2組進行，每組7尾，分組和免疫方法如表4所示。供試鰻鱺規(guī)格均為30g左右，室內養(yǎng)殖，溫度24℃，每日換水1/3。其中PCB ECPs代表含β-溶血素基因重組菌胞外產物，PCB ECPsISCOMs代表由PCB ECPs制成的ISCOMs。PBS為PH 7.2磷酸鹽緩沖液，濃度為0.01M。
表4D-hemA-ISCOMs二次口服免疫分組

在免疫開始后44d，每組各取2尾鰻鱺，采集血清和脾細胞，進行血清抗體效價的檢測以及脾淋巴細胞增殖轉化能力的檢測，具體方法同實例1。在免疫開始后45d進行攻毒保護實驗，用嗜水氣單胞菌TPS-30以1.3×107CFU.ml-1的濃度腹腔注射攻毒，連續(xù)觀察一周。
2結果2.1一次免疫實驗結果在一次免疫實驗中，免疫后第10d，20d ISCOMs組淋巴細胞增殖轉化能力顯著高于非ISCOMs組和對照組(P＜0.05)(表5)(圖3)，免疫后第30d的免疫保護率與淋巴細胞增殖轉化能力相符，ISCOMs組的免疫保護率為44.4％，PCB組的免疫保護率為12.5％，對照組的免疫保護率為12.5％，差異顯著(P＜0.05)。
表5一次免疫脾淋巴細胞增殖后OD450值


2.2二次免疫實驗結果二次免疫開始后第44d，ISCOMs組的血清抗體效價以及淋巴細胞轉化能力顯著高于PBS組，二次免疫開始后第45d的攻毒，ISCOMs組的免疫保護率可達100％(圖4)。
3、結論通過鰻鱺免疫保護試驗證實，ISCOMs用于口服免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力，誘導免疫保護。
綜上所述，本發(fā)明相比現有技術具有如下優(yōu)點免疫刺激復合物ISCOMs用于浸浴免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力，誘導免疫保護。同等劑量免疫時，ISCOMs組的抗體效價明顯高于無佐劑組與ISM1312佐劑組。同樣ISCOMs用于口服免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力，誘導免疫保護。


圖1是浸浴免疫鰻鱺血清抗體效價2是浸浴免疫淋轉柱狀3A是非ISCOMs組口服免疫一次免疫淋巴細胞增殖轉化情況圖3B是ISCOMs組口服免疫一次免疫淋巴細胞增殖轉化情況圖4是口服免疫二次免疫效果5A是本研究室以嗜水氣單胞菌外膜蛋白制備的大小約為40nm具典型籠格狀結構特征的ISCOMs圖5B本研究室以嗜水氣單胞菌重組溶血素制備的大小約為40nm具典型籠格狀結構特征的ISCOMs
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述。
實施例1創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)應用于鰻鱺口服免疫1.材料與方法1.1材料制造本品的毒株FJ03-X2系2003年6月中旬分離自福建患弧菌病歐洲鰻鱺的血液，經嚴格的生化鑒定和分子生物學方法鑒定為生物1型創(chuàng)傷弧菌，腹腔注射感染對20-30g/尾的歐洲鰻鱺的LD50約為7.1×103CFU/尾。該毒株為福建省農業(yè)科學院生物技術研究所分離、鑒定、保存。主要試劑QuilA購自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10購自華美生物工程公司；供試鰻鱺來自福建省長樂海林鰻鱺場，規(guī)格為每尾50g。
TSB培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
TSA培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
1.2方法1.2.1復蘇毒株的預擴增與擴大培養(yǎng)經檢測合格的復蘇毒株接種于盛有100mlTSB的三角瓶中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)24h，100rpm，以1％預擴增的培養(yǎng)物接種于新鮮高壓滅菌的TSB培養(yǎng)液中，以同樣條件培養(yǎng)30h。2L的錐形瓶內裝1L的培養(yǎng)肉湯，1.2.2細菌滅活
收集細菌于20L的無菌塑料桶(塑料桶用70％酒精預消毒，應在48小時內使用)，添加終濃度為0.3％(V/V)的福爾馬林，室溫過夜靜置后，置4℃冰箱，48h內可徹底滅活。無菌檢驗充分搖勻細菌，滅菌槍頭吸取0.2ml，超凈工作臺上鋪平板，放置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，滅菌完全的培養(yǎng)物沒有菌落出現，試驗設空白平板對照。
1.2.3離心收集6000-8000rpm離心30min，收集、濃縮細菌。細菌的生物量(濕重)應為15-17g.L-1。離心收集的細菌用滅活培養(yǎng)上清或滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至50ml(濃縮20倍)。
1.2.4細菌的超聲波破碎超聲波破碎儀為JY98-3D，超聲波的超聲探頭(又稱為變幅桿)的直徑為20mm，超聲功率設為800W，作用程序為間隔10s，作用時間5s，作用總時間為6min/輪。超聲波破碎儀用70％酒精進行潔凈消毒，待裂解菌液預凍、預溶至留有少量冰晶時進行超聲破碎，作用體積為專用超聲杯裝250ml的濃縮菌液。共作用3輪，全程時間為18min，實際作用時間為6min。指針顯示的輸出起始功率功率在720W左右，最后階段的功率可接近設置值(800W)。
第一次超聲波裂解后的用滅菌PBS調整細菌蛋白濃度至25mg.ml-1。
1.2.5創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白ISCOMs疫苗制備。
在超聲裂解的菌體蛋白中添加0.10％(W/V)QuilA，125μg.ml-1卵磷脂和膽固醇(終濃度)。由于卵磷脂和膽固醇都是不易溶于水的有機物，配制卵磷脂和膽固醇時先將兩中物質溶解于氯仿中配成10mg.ml-1儲存液，4℃?zhèn)溆谩?br> 菌體粗蛋白按比例添加QuilA、卵磷脂和膽固醇構成的ISCOMs的基質后，預冷至4℃，置于超聲波破碎儀內。程序設置為間隔10s，超聲作用5s，全程時間為18min。溫度不高于60℃。在潔凈條件下，將超聲處理的ISCOMs收集于2L三角燒瓶內混勻后，測定ISCOMs蛋白濃度(見附件5)，用滅菌PBS調整ISCOMs的蛋白濃度至30mg.ml-1。二次超聲處理后得到制品即為創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白ISCOMs，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.2.6以創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白免疫刺激復合物(ISCOMs)免疫鰻鱺按每噸魚體重每天20ml劑量拌料，(例如飼料投率按1％計算，則每公斤飼料添加創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白ISCOMs 5ml。連續(xù)口服5d，間隔二周后再服5d。第1d按半量添加口服，第2d開始全量添加口服。
本實施例未述部分與現有技術相同實施例2海水病原菌菌體蛋白制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在海水魚口服免疫上的應用1.材料與方法1.1材料制造本品的制造本品用的菌種為大黃魚副溶血弧菌(wVp)、溶藻弧菌(Val33)與哈維氏弧菌(Vha)，均由福建省農業(yè)科學院生物技術研究所保管、鑒定和供應。主要試劑QuilA購自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10購自華美生物工程公司；供試大黃魚、真鯛來自福建省霞浦縣。
1％NaCl營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，NaCl 10g，加雙蒸水至1000ml，pH 7.3±0.2，121℃高壓滅菌20min。
1％NaCl營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，Agar 15g，NaCl 10g，加雙蒸水至1000ml，pH 7.3±0.2，121℃高壓滅菌20min。
1.2方法1.2.1菌株的擴大培養(yǎng)從超低溫冰箱中取出生產用菌種，在0℃、無菌條件下，快速打開保種管瓶蓋，接種環(huán)挑取上層冰晶，接種至100ml 1％NaCl營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，28℃，100rpm培養(yǎng)20h或接種于平板(1％NaCl營養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)20h。取500μl培養(yǎng)菌液，接種于1L新鮮制備的無菌1％NaCl營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)液中(2L無菌錐形瓶)，28℃，100rpm恒溫振蕩培養(yǎng)30h，計算菌數，置4℃保存。
1.2.2菌體的滅活無菌條件下將擴大培養(yǎng)菌液接種于10L的無菌塑料桶，添加終濃度為0.3％的福爾馬林，28℃靜置12h后，放置于4℃冰箱48h。48h后充分搖勻菌液，無菌吸取0.2ml菌液涂布1％NaCl營養(yǎng)瓊脂平板，涂布過程無菌操作。涂布好的1％NaCl營養(yǎng)瓊脂平板放置28℃恒溫培養(yǎng)箱24h培養(yǎng)，滅菌完全的培養(yǎng)物應當沒有可見菌落出現在1％NaCl營養(yǎng)瓊脂平板上。
1.2.3菌體的收集滅活完全的菌液6000rpm離心30min或10000rpm離心15min，收集滅活菌體。離心收集的菌體用原菌液體積3.3％的滅菌生理鹽水洗滌、重懸、濃縮，濃縮后的菌體用滅菌生理鹽水定量為9×1010CFU.ml-1。
1.2.4菌體蛋白制備超聲裂解制備菌體粗蛋白超聲波破碎儀為JY98-3D，超聲波的超聲探頭直徑為20mm。無菌條件下，將細菌濃縮液移置到超聲波破碎儀專用杯(用70％酒精清洗消毒)，每杯分裝250ml的細菌濃縮液。將有裝細菌重懸液的專用杯放置于超聲儀室內，將酒精消毒的超聲波探頭底端至細菌重懸液面下20mm處固定，關閉超聲儀室門，設定超聲波破碎參數(工作時間5s、間隔時間10s、工作次數32-48次，超聲功率設為720W。)，啟動超聲破碎程序，超聲裂解后制備好的菌體蛋白置于4℃低溫備用。
1.2.5海水病原菌菌體蛋白ISCOMs的制備將經超聲波破碎得到的菌體蛋白，于室溫條件下依次與0.1％(W/V)的QuilA、125μg.ml-1卵磷脂、125μg.ml-1膽固醇混合，重復1.2.4超聲破碎程序，得到的制品即為最終制品。
1.2.6以海水病原菌菌體蛋白制成的免疫復合刺激復合物(ISCOMs)免疫海水魚將副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33和哈維氏弧菌Vha的菌體蛋白以1∶1∶1的比例制成ISCOMs三聯苗，疫苗菌體含量為9×1010CFU.ml-1，在副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌發(fā)病高峰期前，對海區(qū)網箱養(yǎng)殖的大黃魚(幼成魚)進行田間口服免疫實驗。按每噸魚體重每天50ml ISCOMs三聯苗劑量拌料口服(如飼料投率為5％，則每公斤飼料添加本疫苗1ml)。連續(xù)口服7天，間隔一周后再服7天。第一天按半量添加口服，第二天開始全量添加口服。
本實施例未述部分與現有技術相同實施例3嗜水氣單胞菌制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在鰻鱺口服免疫上的應用1.材料與方法1.1材料制造本品的菌種TPS30由浙江淡水研究所錢東提供，ZN1系福建省農科院生物技術研究所于2004年分離自福建省周寧縣患嗜水氣單胞菌敗血癥的歐洲鰻鱺，。以上菌種均由福建省農業(yè)科學院生物技術研究所保管、鑒定和供應。主要試劑QuilA購自Accurate chemical & Scientific corporation公司；Mega-10購自華美生物工程公司；供試鰻鱺來自福建省長樂市。
TSB培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
TSA培養(yǎng)基配方大豆胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 15g，K2HPO42.5g，葡萄糖0.5g，Agar 15g。加雙蒸水至1000ml，121℃高壓滅菌20min。
1.2方法1.2.1菌株的擴大培養(yǎng)從超低溫冰箱中取出生產用菌種，在0℃、無菌條件下，快速打開保種管瓶蓋，接種環(huán)挑取上層冰晶，接種至100ml TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，100rpm培養(yǎng)20h或接種于TSA平板培養(yǎng)20h。取500μl培養(yǎng)菌液，接種于1L新鮮制備的TSB液體培養(yǎng)基中(2L無菌錐形瓶)，28℃，100rpm恒溫振蕩培養(yǎng)30h，計算菌數，置4℃保存。
1.2.3菌體的滅活無菌條件下將擴大培養(yǎng)菌液接種于10L的無菌塑料桶，添加終濃度為0.3％的福爾馬林，28℃靜置12h后，放置于4℃冰箱48h。48h后充分搖勻菌液，無菌吸取0.2ml菌液涂布1％NaCl營養(yǎng)瓊脂平板，涂布過程無菌操作。涂布好的TSA平板，放置28℃恒溫培養(yǎng)箱24h培養(yǎng)，滅菌完全的培養(yǎng)物應當沒有可見菌落出現在1％NaCl營養(yǎng)瓊脂平板上。
1.2.3菌體的收集滅活完全的菌液6000rpm離心30min或10000rpm離心15min，收集滅活菌體。離心收集的菌體用原菌液體積3.3％的滅菌生理鹽水洗滌、重懸、濃縮，濃縮后的菌體用滅菌生理鹽水定量為9×1010CFU.ml-1。
1.2.4菌體蛋白制備超聲裂解制備菌體粗蛋白超聲波破碎儀為JY98-3D，超聲波的超聲探頭直徑為20mm。無菌條件下，將細菌濃縮液移置到超聲波破碎儀專用杯(用70％酒精清洗消毒)，每杯分裝250ml的細菌濃縮液。將有裝細菌重懸液的專用杯放置于超聲儀室內，將酒精消毒的超聲波探頭底端至細菌重懸液面下20mm處固定，關閉超聲儀室門，設定超聲波破碎參數(工作時間5s、間隔時間10s、工作次數32-48次，超聲功率設為720W。)，啟動超聲破碎程序，超聲裂解后制備好的菌體蛋白置于4℃低溫備用。
1.2.5嗜水氣單胞菌菌體蛋白ISCOMs的制備將經超聲波破碎得到的TPS-30菌體蛋白以及ZN1菌體蛋白等量混合，于室溫條件下依次與0.1％(W/V)的QuilA、125μg.ml-1卵磷脂、125μg.ml-1膽固醇混合，重復1.2.4超聲破碎程序，得到的制品即為最終制品，疫苗蛋白含量為31mg.ml-1。
1.2.6以嗜水氣單胞菌菌體蛋白ISCOMs免疫鰻鱺本課題組將嗜水氣單胞菌TPS-30、ZN1制成的ISCOMs雙價苗在嗜水氣單胞菌發(fā)病高峰期前一個月(2005.4)，對當年投苗養(yǎng)殖的鰻鱺進行田間口服免疫實驗。按每噸魚體重每天50ml ISCOMs雙價苗劑量拌料口服(如飼料投率為1％，則每公斤飼料添加本疫苗5ml，如飼料投率為2％，則每公斤飼料添加本疫苗2.5ml，以此類推)。連續(xù)口服7天，間隔一周后再服7天。第一天按半量添加口服，第二天開始全量添加口服。
本實施例未述部分與現有技術相同。
實施例4將按照實施例1方法制備的創(chuàng)傷弧菌菌體蛋白制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)以浸浴方式應用于鰻鱺。
將創(chuàng)傷弧菌制成的ISCOMs疫苗在創(chuàng)傷弧菌發(fā)病高峰期前一個月，對當年投苗養(yǎng)殖的鰻鱺進行田間浸浴免疫實驗。按每噸水100毫升的量添加，持續(xù)1小時后換水，完成一次免疫。
本實施例未述部分與現有技術相同實施例5將按照實施例2制備的海水病原菌菌體蛋白制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在海水魚浸浴免疫上的應用將副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33和哈維氏弧菌Vha的菌體蛋白以1∶1∶1的比例制成ISCOMs三聯苗，疫苗菌體含量為9×1010CFU.ml-1，在副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌發(fā)病高峰期前，對海區(qū)網箱養(yǎng)殖的大黃魚(幼成魚)進行田間浸浴免疫實驗。按每噸水100毫升量添加，持續(xù)1小時后換水，完成一次免疫。間隔二周后再按每噸水100毫升的量添加，持續(xù)1小時后換水，完成二次免疫。
本實施例未述部分與現有技術相同實施例6將按照實施例3制備的嗜水氣單胞菌制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在鰻鱺浸浴免疫上的應用將嗜水氣單胞菌TPS-30、ZN1制成的ISCOMs雙價苗在嗜水氣單胞菌發(fā)病高峰期前一個月，對當年投苗養(yǎng)殖的鰻鱺進行田間浸浴免疫實驗。按每噸水100毫升量添加，持續(xù)1小時后換水，完成一次免疫。間隔二周后再按每噸水100毫升的量添加，持續(xù)1小時后換水，完成二次免疫。
本實施例未述部分與現有技術相同。
實施例7嗜水氣單胞菌脂多糖成份制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在鰻鱺口服免疫、浸浴免疫上的應用將嗜水氣單胞菌TPS-30和ZN1接種至100ml TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，100rpm培養(yǎng)20h或接種于TSA平板培養(yǎng)20h。取500μl培養(yǎng)菌液，接種于1L新鮮制備的TSB液體培養(yǎng)基中(2L無菌錐形瓶)，28℃，100rpm恒溫振蕩培養(yǎng)30h，，6000rpm離心30min或10000rpm離心15min，收集細菌菌體，0.02M/LTris-HCl(PH7.6-7.8)，洗滌兩次定容，1g細菌(濕重)約重懸于3ml的純水中，添加等體積95％的預熱68℃飽和酚，不斷地攪拌混勻。約15min，冷卻到10-15℃，10000r/min4℃離心收集，上層為酚飽和水相，中間為變性蛋白，地層為水飽和酚相，輕取上層，地層需最少反復抽提兩次，4℃充分透析，得到明膠狀LPS，按實施例3的方法制成ISCOMs，用于鰻鱺口服免疫和浸浴免疫。
本實施例未述部分與現有技術相同。
實施例8副溶血弧菌和溶藻弧菌多糖抗原制成的免疫刺激復合物(ISCOMs)在大黃魚免疫上的應用將副溶血弧菌wVp2、溶藻弧菌Val33分別接種于100ml 1％NaCl營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，28℃，100rpm培養(yǎng)20h或接種于平板(1％NaCl營養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)20h。取500μl培養(yǎng)菌液，接種于1L新鮮制備的無菌1％NaCl營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)液中(2L無菌錐形瓶)，28℃，100rpm恒溫振蕩培養(yǎng)30h。沸水煮10min，臺式離心機10000r/min離心收集菌體成份，生理鹽水同法洗滌3次，最后重懸于0.2ml的滅菌生理鹽水。加蛋白酶K(25mg/ml)5μl，混勻，置60℃恒溫水浴箱約1h，l0000/min離心l0min，加樣槍輕吸取上清，按實施例2的方法制成ISCOMs。用于大黃魚的口服免疫和浸浴免疫。
以上實施例中采用的是嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌哈維氏菌蛋白制備的免疫刺激復合物利用口服、浸浴的方法進行的，當然也可以將其中的嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌哈維氏菌蛋白成份或多糖成份用病毒、寄生蟲的蛋白成份或多糖成份作為原料來制備病毒免疫刺激復合物或寄生蟲免疫刺激復合物，用于魚類的口服、浸浴免疫。
權利要求
1.免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于其是以浸浴或口服的方式進行。
2.根據權利要求1所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的免疫刺激復合物主要包含有病原體抗原物質、嵌入劑Quil A、膽固醇、卵磷脂。
3.根據權利要求2所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的病原體抗原物質或為病原體蛋白質、或為多糖類抗原物質。
4.根據權利要求3所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的病原體蛋白質中的病原體主要為細菌、病毒、寄生蟲病原體中含的蛋白。
5.根據權利要求1至4任何一項所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的免疫刺激復合物對魚類的口服、浸浴免疫或為一次免疫，或為二次免疫，或為加強免疫。
6.根據權利要求5所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的二次免疫為二次免疫，在初次免疫7-14天，再用同樣的方法和劑量再免疫一次。
7.根據權利要求5所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的加強免疫為在二次免疫后，1-3個月再用同樣的方法和劑量再免疫一次。
8.根據權利要求1所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的適用于免疫刺激復合物的口服、浸浴免疫的魚包括淡水魚和海水魚。
9.根據權利要求8所述的免疫刺激復合物在魚類免疫中的應用，其特征在于所述的免疫刺激復合物的口服、浸浴免疫尤其適用于鰻魚、大黃魚、羅非魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫刺激復合物以浸浴或口服的方式在魚類免疫中的應用。本發(fā)明的優(yōu)點在于免疫刺激復合物ISCOMs用于浸浴免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力，誘導免疫保護。同等劑量免疫時，ISCOMs組的抗體效價明顯高于無佐劑組與ISM1312佐劑組。同樣ISCOMs用于口服免疫不僅可提高抗體水平，而且可提高T淋巴細胞的增殖轉化能力，誘導免疫保護。
文檔編號A61P37/04GK1879880SQ20061004062
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權日2006年5月16日
發(fā)明者龔暉, 林天龍, 許斌福 申請人:福建省農業(yè)科學院生物技術研究所, 龔暉, 林天龍, 許斌福