專利名稱：一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用復(fù)合酶定向酶解茄參膠原蛋白制取能夠抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的方法背景技術(shù)原發(fā)性高血壓是由多種因素引起的，其中包括遺傳、飲食習(xí)慣、精神狀態(tài)等。研究表明血壓正常與否，與腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)密切相關(guān)，而血管緊張素酶(ACE)在上述兩個系統(tǒng)中都起著重要作用。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中，ACE水解無升壓活性的血管緊張素I，生成具有升壓活性的血管緊張素II；而在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，ACE能夠降解具有降壓活性的緩激肽，使之失去降血壓活性。ACE通過以上兩種途徑參與了體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)，能造成血壓的升高，引發(fā)高血壓。ACE抑制劑通過抑制血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE的活性達(dá)到降低血壓的目的。ACE抑制劑的研究始于20世紀(jì)60年代，F(xiàn)erreira等人在南美洲蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中發(fā)現(xiàn)ACE抑制劑，之后人們對于ACE抑制劑的機(jī)理、提取及合成進(jìn)行了廣泛研究，1981年第一個合成ACE抑制劑Captopril(商品名為卡普托利)經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市。目前合成ACE抑制劑是臨床上廣泛應(yīng)用的一種降血壓藥物，但由于它具有干咳、血管性水腫等副作用，人們試圖尋找更為安全的ACE抑制劑。1979年Oshima等人用細(xì)菌膠原酶降解明膠獲得具有較強(qiáng)ACE抑制活性肽，這是人類第一次利用食品蛋白質(zhì)得到的食源性ACE抑制活性肽，之后人們先后從日本清酒、沙丁魚、蛋黃、酸奶、鰹魚等食品原料中獲得食源性ACE抑制活性肽。食源性ACE抑制活性肽安全性高，降壓效果溫和、專一、持久，且無副作用，但它的缺點(diǎn)是成本高，對ACE的抑制作用差。
目前，尚未見到用茄參膠原蛋白制備ACE抑制活性肽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用復(fù)合酶定向酶解茄參膠原蛋白制取能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷。
一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的制備方法，其特征是將茄參體壁用蒸餾水打漿，離心，殘?jiān)脡A溶液攪拌過夜，離心，重復(fù)用堿洗，除去上清液，沉淀用蒸餾水沖洗至中性，加入蒸餾水恒溫加熱并攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍干燥，得到茄參膠原蛋白，將該茄參膠原蛋白溶解于磷酸-檸檬酸緩沖液中配成溶液，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢?，水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；用堿液調(diào)pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；加I型膠原酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾，得水解液，經(jīng)過陽離子交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半制備柱分離純化后凍干。
本發(fā)明以低值的茄參為原料，利用菠蘿蛋白酶、Alcalase蛋白酶、I型膠原酶復(fù)合酶解制備具有ACE抑制活性的寡聚肽，所得產(chǎn)物活性高，對ACE酶有較好的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
將1kg茄參體壁加入2.5kg的蒸餾水打漿，離心，所得殘?jiān)?kg的NaOH水溶液攪拌過夜，離心，重復(fù)用NaOH的水溶液洗三次，除去上清液，沉淀用蒸餾水沖洗至中性，加入蒸餾水45℃下恒溫加熱并攪拌抽提8h，離心分離得膠原水溶液，冷凍干燥。將所得茄參膠原蛋白溶解于磷酸-檸檬酸緩沖液(該緩沖溶液的摩爾濃度為0.02M，pH4.5)中配成0.5～1.5％(重量百分比濃度，下同)，最好是1％的溶液，按照4000～5000U/g，最好4500U/g膠原蛋白加菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢瑁?0～50℃下，最好45℃下水解3～5小時，最好4小時，95～100℃下滅酶，冷卻，用10KDa超濾膜超濾；用堿液調(diào)pH7～8，最好7.5，按照2500～3500U/g，最好3000U/g膠原蛋白加入Alcalase蛋白酶，50～60℃下，最好55℃恒溫水解1.5～2.5小時，最好2小時，95℃下滅酶，冷卻，用5KDa超濾膜超濾；使pH值不變，按照3500～4500U/g，最好4000U/g膠原蛋白加入I型膠原酶，36～38℃下，最好37℃下恒溫水解3～4小時，最好4小時，95℃滅酶，冷卻，用1KDa超濾膜超濾，所得水解液經(jīng)過SP Sephadex C-25陽離子交換柱、Sephadex G-15凝膠柱，兩次反相高壓液相色譜C18半制備柱分離純化，凍干即得到具有ACE抑制活性的寡聚肽。
采用分光光度計(jì)法測定，分子量在1K以下的本發(fā)明的寡聚肽對ACE有較好的抑制效果，其IC50值為23.8ug/ml。
權(quán)利要求
1.一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的制備方法，其特征是將茄參體壁用蒸餾水打漿，離心，殘?jiān)脡A溶液攪拌過夜，離心，重復(fù)用堿洗，除去上清液，沉淀用蒸餾水沖洗至中性，加入蒸餾水恒溫加熱并攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍干燥，得到茄參膠原蛋白，將該茄參膠原蛋白溶解于磷酸-檸檬酸緩沖液中配成溶液，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢瑁?，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；用堿液調(diào)pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；加I型膠原酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾，得水解液，經(jīng)過陽離子交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半制備柱分離純化后凍干。
全文摘要
一種能抑制血管緊張素酶活性的寡聚肽的制備方法，其特征是將茄參體壁用水打漿，離心，殘?jiān)脡A攪拌，離心，用堿液洗，除去上清液，沉淀用水沖洗至中性，加水恒溫，加熱并攪拌抽提，離心分離得熱水提膠原溶液，冷凍干燥，得到茄參膠原蛋白，將后者溶于磷酸－檸檬酸緩沖液中，加入菠蘿蛋白酶，恒溫?cái)嚢?，水解，滅酶，冷卻，超濾膜超濾；調(diào)pH7－8，再加入Alcalase蛋白酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾；加I型膠原酶，恒溫水解，滅酶，冷卻，超濾，得水解液，經(jīng)交換柱、凝膠柱、兩次反相高壓液相色譜半制備柱分離純化后凍干。本發(fā)明以低值的茄參為原料制得的寡聚肽活性高，對ACE酶有較好的抑制作用。
文檔編號A61K36/185GK1858230SQ20061004448
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者曾名湧, 趙元暉, 劉尊英, 董士遠(yuǎn), 李八方 申請人:中國海洋大學(xué)