專利名稱：抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體講是一種抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體及其制備方法，其屬于免疫學(xué)和分子病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魚類淋巴囊腫病的病原是淋巴囊腫病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)。自1997年淋巴囊腫病在我國初次大規(guī)模爆發(fā)以來，受害魚類已達(dá)10余種，每年養(yǎng)殖的海水魚類都會(huì)因該病大量死亡，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)百億元之巨。由于LCDV是寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)的非細(xì)胞型超微微生物群體，所以至今也未研究出既能殺傷病毒又不損傷宿主細(xì)胞的有效藥物。另外，該病毒的隱性感染和魚類特殊的水生環(huán)境，使病毒的感染難以覺察，常常一旦發(fā)現(xiàn)癥狀，即到了無法挽救的地步。
特異性結(jié)合病毒多肽的單克隆抗體是建立病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及早期診斷技術(shù)的必備材料。同時(shí)，以特異性結(jié)合病毒多肽的單克隆抗體為工具研究不同地域、不同宿主的病毒，可為病毒中和抗體的研制及保護(hù)性抗原的確認(rèn)積累基礎(chǔ)材料。另外，特異性結(jié)合病毒多肽的單克隆抗體也可用于研究該病毒多肽在宿主體內(nèi)或細(xì)胞中的定位，表達(dá)等。目前，國內(nèi)外尚未有研制淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗牙鲆淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明擬研制特異性結(jié)合淋巴囊腫病毒(簡(jiǎn)稱LCDV)的衣殼蛋白的單克隆抗體；填補(bǔ)有關(guān)抗魚類LCDV衣殼蛋白的單克隆抗體研究的空白，為建立淋巴囊腫病早期診斷技術(shù)及保護(hù)性抗原的研究作出貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案完成的，研制了一種抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞LCDV-V，保藏號(hào)為CCTCC-C200619，保藏日期2006年4月26日的雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞分泌的。
所述的單克隆抗體所對(duì)應(yīng)的發(fā)生特異性結(jié)合的抗原是淋巴囊腫病毒衣殼蛋白，該衣殼蛋白分子量范圍為115kDa——125kDa。
一種制備抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體的方法，所述的制備方法是從以分離的、分子量范圍為115kDa——125kDa的淋巴囊腫病毒衣殼蛋白為抗原開始，采用免疫學(xué)方法產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的檢測(cè)篩選方法，篩選出抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。
所述的免疫學(xué)的檢測(cè)篩選方法是間接免疫熒光抗體法，膠體金標(biāo)記免疫電鏡法和免疫印跡法；其中，膠體金標(biāo)記免疫電鏡法和免疫印跡法，這兩個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合起來，能夠確定該單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱VP單抗)的抗原決定簇在魚類淋巴囊腫病毒的分子量范圍為115kDa——125kDa的衣殼蛋白上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于采用了間接免疫熒光抗體鑒定方法，間接免疫熒光抗體法反應(yīng)靈敏，結(jié)果觀察直觀，能夠避免酶聯(lián)免疫吸附法和免疫酶法等由于細(xì)胞和組織內(nèi)存在內(nèi)源酶而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，所以使得確認(rèn)VP單抗與LCDV發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)真實(shí)存在。同時(shí)，由于采用了膠體金標(biāo)記免疫電鏡方法，它能在超微結(jié)構(gòu)水平上精確、細(xì)致的定位，特異性高，標(biāo)記物清晰可辨，具有其他標(biāo)記方法無法比擬的優(yōu)越性，該技術(shù)把免疫學(xué)中抗原抗體反應(yīng)的高度特異性、敏感性與組織化學(xué)的形態(tài)可見性有機(jī)的結(jié)合起來了，可在亞細(xì)胞及分子水平上研究免疫反應(yīng)。因此采用該方法進(jìn)一步直觀地證實(shí)該VP單抗與位于LCDV衣殼蛋白上的抗原決定簇發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明尤其重要的是采用了免疫印跡法確認(rèn)了含有該抗原決定簇的病毒衣殼蛋白的分子量，免疫印跡方法是近年來發(fā)展起來的一種新方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)，該方法直接確定了與VP單抗特異性結(jié)合的LCDV蛋白多肽的分子量范圍為115kDa——125kDa。綜合本發(fā)明的膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果和免疫印跡結(jié)果可知與VP單抗發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇位于LCDV的衣殼蛋白上，且該衣殼蛋白的分子量范圍為115kDa——125kDa，這一成果為建立LCDV的單克隆抗體早期診斷方法，為從分子水平上定位該病毒的靶器官，為不同地域、不同宿主病毒的區(qū)分以及研究該病毒流行病學(xué)規(guī)律奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，特異性結(jié)合LCDV多肽的單克隆抗體不但能用于研究病毒多肽在宿主體內(nèi)或細(xì)胞中的定位，表達(dá)等，也可利用單抗與相應(yīng)抗原決定簇相結(jié)合抑制該抗原的特性，研究病毒抗原表位的定位，抗原表位的數(shù)量和相互關(guān)系。它為進(jìn)一步弄清病毒的抗原位點(diǎn)，不同位點(diǎn)之間的關(guān)系，不同位點(diǎn)與不同生物學(xué)功能之間的關(guān)系，以及選擇保護(hù)性位點(diǎn)，制備亞單位疫苗提供理論依據(jù)。


圖1為間接免疫熒光抗體法檢測(cè)結(jié)果圖。
圖2為膠體金標(biāo)記免疫電鏡鑒定結(jié)果圖。
圖3為免疫印跡方法測(cè)定的結(jié)果圖。
圖1中，可見囊腫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣出現(xiàn)散布有塊狀、楔狀的強(qiáng)陽性信號(hào)，并且數(shù)個(gè)成鏈圈狀排列。
圖2中，可見背景清潔，無散在的金粒子，在LCDV的衣殼上特異性結(jié)合有大量的金粒子。
圖3顯示本發(fā)明的VP單抗和已知LCDV單抗(雜交瘤細(xì)胞株保藏編號(hào)CCTCC-C200419，專利申請(qǐng)?zhí)?00410075528.1)的免疫印跡結(jié)果。圖3中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；V為L(zhǎng)CDV的電泳圖譜，可見在分子量范圍為115kDa——125kDa間僅有一條蛋白多肽；1為抗LCDV的VP單抗的免疫印跡結(jié)果，可見VP116單抗能特異性結(jié)合一條電泳后的分子量在115kDa——125kDa范圍間的蛋白多肽；2為已知LCDV單抗(雜交瘤細(xì)胞株保藏編號(hào)CCTCC-C200419)與電泳后的分子量在115kDa——125kDa范圍間的蛋白多肽不反應(yīng)的免疫印跡結(jié)果。
本發(fā)明所述VP單抗的制備方法，是以分離的、淋巴囊腫病毒分子量在115kDa——125kDa范圍間的蛋白多肽為抗原，經(jīng)免疫balb/c小白鼠，應(yīng)用免疫學(xué)方法，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，再應(yīng)用免疫學(xué)的檢測(cè)鑒定方法，篩選鑒定出VP單抗。
所述的免疫學(xué)的檢測(cè)鑒定方法是間接免疫熒光抗體法，免疫印跡法和膠體金標(biāo)記免疫電鏡法。
應(yīng)用間接免疫熒光抗體法，有該VP單抗的鑒定結(jié)果顯示囊腫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣出現(xiàn)散布有塊狀、楔狀的強(qiáng)陽性信號(hào)，并且數(shù)個(gè)成鏈圈狀排列。該結(jié)果確認(rèn)VP單抗與LCDV病毒粒子發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)真實(shí)存在。
應(yīng)用膠體金標(biāo)記免疫電鏡法，有該VP單抗的鑒定結(jié)果顯示在LCDV病毒粒子的周圍特異性結(jié)合有大量的膠體金粒子，即表征與該VP單抗發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇位于LCDV的衣殼蛋白上。
應(yīng)用免疫印跡法，有該VP單抗的鑒定結(jié)果顯示該VP單抗能特異性結(jié)合一條病毒的蛋白多肽，該多肽的分子量范圍在115kDa——125kDa間。即表征與該單抗特異性結(jié)合的抗原決定簇位于分子量范圍在115kDa——125kDa間的蛋白多肽上。
膠體金標(biāo)記免疫電鏡法和免疫印跡法這兩種檢測(cè)方法結(jié)合起來，能夠確定VP單抗的抗原決定簇在淋巴囊腫病毒的分子量范圍在115kDa——125kDa間的衣殼蛋白上。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明VP單抗具體制備方法結(jié)合實(shí)施例及其附圖進(jìn)一步說明如下實(shí)施例1研制抗牙鲆LCDV的VP單抗1.)LCDV病毒提純(1)取10g病魚的囊腫組織，加入適量石英砂和10倍體積的TNE緩沖液(0.05mol/L Tris-HCL；0.15mol/L NaCl；0.01mol/L EDTA；pH7.4)，冰浴勻漿；(2)勻漿液4℃，600g離心30min，取上清液；(3)4℃，1 800g再次離心30min；收集上清液；(4)4℃，8 000g離心2h；棄上清，收集沉淀；(5)向沉淀中添加適量TNE，將其輕置于由37％、40％、47％、52％、57％、62％(W/V)組成的蔗糖密度梯度離心管上層，4℃，78 000g離心2h；(6)用一次性注射器小心吸出病毒帶，TNE重懸病毒帶，4℃，78 000g離心1h以除去蔗糖。
2.)LCDV病毒衣殼蛋白的分離制備(1)由濃度為12％分離膠和濃度為5％濃縮膠兩部分配制電泳凝膠；(2)純化的病毒液與電泳樣品緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl pH6.8；1％SDS；1％疏基乙醇；10％甘油；0.02％溴酚藍(lán))等體積混合，加熱煮沸3min；(3)采用Tris-甘氨酸(Gly)電泳緩沖液(0.025mol/L Tris；0.25mol/LGly；0.1％SDS；pH8.3)，4℃條件電泳；(4)電泳后的凝膠在CuCl2可逆染色液(CuCl2·2H2O 5.11g溶于100ml雙蒸水中)中，染色5min。
(5)取出凝膠，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)切下范圍在115kDa——125kDa間僅有的一條目的蛋白條帶——VP蛋白條帶。放入脫色液中脫色。
(6)將目的蛋白條帶裝入洗脫儀中(洗脫儀Model 422，Bio-Rad)，加入洗脫緩沖液(50mmol/L NH4HCO3，0.1％SDS，4℃存放)。按10mA/管設(shè)置電流值，恒流洗脫5h。
(7)將回收室中的回收液吸出，雙蒸水透析過夜。
(8)透析后的樣品液冷凍干燥，置于-80℃?zhèn)溆谩?br> 3.)免疫免疫四周齡Balb/c小鼠，共免疫4次，具體免疫程序如下(1)基礎(chǔ)免疫，將樣品液與弗氏完全佐劑等比混勻，采用腹腔注射方法；(2)2周后加強(qiáng)免疫，將樣品液與弗氏不完全佐劑等比混勻，采用腹腔注射方法；(3)1周后再加強(qiáng)免疫1次，采用尾靜脈直接注射方法，注射劑量為0.1mL，無佐劑；(4)再1周后加強(qiáng)免疫第2次；本次免疫后的第3天，將小鼠脫頸椎處死，取脾臟用于細(xì)胞融合。
4.)細(xì)胞融合在無菌條件下將免疫小鼠脾細(xì)胞與P3-X63-Ag8-U1骨髓瘤細(xì)胞用50％PEG融合，融合細(xì)胞(105cells/ml)用HAT-GIT選擇性培養(yǎng)液重懸，滴入加有營養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況。大約兩周后，檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液，篩選陽性細(xì)胞。
5.)克隆采用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞用GIT培養(yǎng)液重懸，10倍梯度稀釋至102cells/ml，取1ml細(xì)胞液加入9ml培養(yǎng)液，混合均勻，滴入加有營養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1ml。選取只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底2/3以上時(shí)，取上清液(即含有本發(fā)明的VP單抗)用免疫熒光抗體法檢測(cè)。每株雜交瘤細(xì)胞克隆3次。
6.)凍存取生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的待凍存細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，200g離心5min，去上清，加凍存液(含10％DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液)，使最終細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml，將1ml細(xì)胞懸液裝于2ml凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80℃超低溫冰箱內(nèi)過夜(8-12小時(shí))后，再浸入液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存。
實(shí)施例2間接免疫熒光抗體法篩選鑒定(1)取新鮮囊腫，切成約8mm×5mm×7mm的小塊，生理鹽水清洗，吸干水分后，用組織冷凍包埋劑OCT包埋，-20℃放置30min，冰凍切片，切片厚度5μm。丙酮固定20min，室溫干燥，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為第一抗體，加在切片上；(3)37℃濕盒孵育45min，PBS-T(0.05％Tween-20)浸洗3次，每次5min；(4)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，加在切片上；(5)37℃濕盒孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(6)甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。
結(jié)果間接免疫熒光抗體法檢測(cè)結(jié)果顯示特異性熒光信號(hào)僅出現(xiàn)在囊腫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣，陽性信號(hào)呈楔狀、塊狀，或數(shù)個(gè)成鏈圈狀排列，且集中在細(xì)胞質(zhì)的邊緣部分。
實(shí)施例3膠體金標(biāo)記免疫電鏡定位本發(fā)明VP單抗特異性結(jié)合的抗原決定簇(1)取純化的病毒懸液10μl，滴在覆蓋有Formvar膜的銅網(wǎng)上，靜止5min，吸去多余的病毒懸液，PBS-T浸洗；(2)含2％牛血清白蛋白的PBS，37℃封閉1h，PBS-T浸洗3次，(3)加入本發(fā)明VP116單抗，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次；(4)加入15nm的膠體金標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，雙蒸水浸洗3次；(5)2％的磷鎢酸負(fù)染色1min，吸去殘留染液，電鏡觀察。
結(jié)果膠體金標(biāo)記免疫電鏡觀察結(jié)果顯示視野背景清潔，無散在的金顆?；蚱渌廴疚铮z體金顆粒集中結(jié)合在LCDV粒子衣殼周圍，在病毒外區(qū)域沒有的膠體金顆粒散布。
實(shí)施例4本發(fā)明VP單抗與已知LCDV單抗(雜交瘤細(xì)胞株保藏編號(hào)CCTCC-C200419，專利申請(qǐng)?zhí)?00410075528.1)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)由濃度為12％分離膠和濃度為5％濃縮膠兩部分配制電泳凝膠；(2)純化的病毒液與電泳樣品緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl pH6.8；1％SDS；1％疏基乙醇；10％甘油；0.02％溴酚藍(lán))等體積混合，加熱煮沸3min；(3)采用Tris-甘氨酸(Gly)電泳緩沖液(0.025mol/L Tris；0.25mol/L Gly；0.1％SDS；pH 8.3)，4℃條件電泳；(4)電泳完成后，取出凝膠，一份考馬斯亮蘭染色，一份移到電泳轉(zhuǎn)移槽；(5)穩(wěn)流200mA，轉(zhuǎn)移5h。
(6)將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜用2％牛血清白蛋白4℃封閉過夜，次日PBS-T浸洗3次，，每次5min；(7)加入要檢測(cè)的單克隆抗體，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min，(8)加入AP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(9)加NBT/BCIP，室溫顯色。
結(jié)果免疫印跡方法測(cè)定單抗特異性結(jié)合的病毒多肽的分子量結(jié)果顯示本發(fā)明VP單抗能識(shí)別一條電泳后分子量范圍在115kDa——125kDa間的多肽，而已知LCDV單抗(雜交瘤細(xì)胞株保藏編號(hào)CCTCC-C200419，專利申請(qǐng)?zhí)?00410075528.1)的免疫印跡結(jié)果則未顯示特異性結(jié)合電泳后的蛋白帶。見圖3中2顯示的免疫印跡結(jié)果。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)也說明本發(fā)明的VP單抗所識(shí)別的抗原決定簇為線性抗原決定簇，而已知LCDV單抗(雜交瘤細(xì)胞株保藏編號(hào)CCTCC-C200419，專利申請(qǐng)?zhí)?00410075528.1)的抗原決定簇為構(gòu)象抗原決定簇；即本發(fā)明的單克隆抗體特異性結(jié)合的抗原決定簇與已知單克隆抗體(保藏編號(hào)CCTCC-C200419，專利申請(qǐng)?zhí)?00410075528.1的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗)特異性結(jié)合的抗原決定簇是不相同的。
實(shí)施例5本發(fā)明VP單抗在牙鲆鰓細(xì)胞中定位LCDV的應(yīng)用(1)將無菌的潔凈蓋玻片放入培養(yǎng)瓶中，接種生長(zhǎng)旺盛的FG細(xì)胞；(2)倒置顯微鏡觀察，培養(yǎng)瓶底長(zhǎng)滿單層細(xì)胞后，用PBS緩沖液清洗，加入4倍稀釋的病毒液0.5ml；(3)20℃孵育1小時(shí)，吸出病毒液，加MEM維持液(含2％小牛血清)5ml，20℃培養(yǎng)；(4)48h后取出蓋玻片，PBS浸洗3次，丙酮固定20min，室溫晾干；(5)將蓋玻片固定在載玻片上，加入本發(fā)明VP116單抗；(6)37℃濕盒孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(7)加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃濕盒避光孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5min；(8)甘油封片，熒光顯微鏡觀，結(jié)果以未接種病毒的FG細(xì)胞為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示感染病毒的牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均能見到特異性熒光，表明該病毒多肽定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在未感染病毒的牙鲆鰓細(xì)胞中呈陰性反應(yīng)。
實(shí)施例6應(yīng)用本發(fā)明VP單抗，調(diào)查引起許氏平鲉(Sebastes schlegeli)淋巴囊腫病的LCDV粒子是否與來自牙鲆的LCDV具有相同的抗原決定簇。
1.)冰凍切片的制作取發(fā)病囊腫組織，切成約3mm見方的小塊，生理鹽水清洗，吸干水分后，用冷凍包埋劑包埋，-20℃放置30min，冰凍切片機(jī)-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室溫干燥，-20℃凍存?zhèn)溆茫?.)熒光抗體染色(1)吸取本發(fā)明VP116單抗15μl，加在切片上。
(2)37℃濕盒中孵育45min；(3)取出載玻片，用0.01M磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5min。
(4)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，加在切片上。
(5)37℃濕盒中避光孵育45min。
(6)取出載玻片，用0.01M磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)Olympus熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果在間接免疫熒光抗體檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在許氏平鲉囊腫細(xì)胞中散布有點(diǎn)狀或帶狀的陽性信號(hào)。表明許氏平鲉囊腫細(xì)胞中的LCDV粒子存在與牙鲆LCDV相同的抗原決定簇。
實(shí)施例7應(yīng)用本發(fā)明VP單抗，調(diào)查引起云紋石斑魚(Epinephelus moara)淋巴囊腫病的LCDV是否與來自牙鲆的LCDV具有相同的抗原決定簇。
1.)冰凍切片的制做取發(fā)病云紋石斑魚囊腫組織，切成約3mm見方的小塊，生理鹽水清洗，吸干水分后，用冷凍包埋劑包埋，-20℃放置30min，冰凍切片機(jī)-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室溫干燥，-20℃凍存?zhèn)溆茫?.)其次，熒光抗體染色步驟同實(shí)施例7結(jié)果在間接免疫熒光抗體檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在云紋石斑魚囊腫細(xì)胞中散布有陽性信號(hào)。表明云紋石斑魚囊腫細(xì)胞中的LCDV粒子存在與牙鲆LCDV相同的抗原決定簇。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞LCDV-V，保藏號(hào)為CCTCC-C200619，保藏日期2006年4月26日的雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞分泌的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體所對(duì)應(yīng)的發(fā)生特異性結(jié)合的抗原是淋巴囊腫病毒衣殼蛋白，該衣殼蛋白分子量范圍為115kDa——125kDa。
3.一種制備抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體的方法，其特征在于所述的制備方法是從以分離的、分子量范圍為115kDa——125kDa的淋巴囊腫病毒衣殼蛋白為抗原開始，采用免疫學(xué)方法產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的檢測(cè)篩選方法，篩選出抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體的方法，其特征在于所述的免疫學(xué)的檢測(cè)篩選方法是間接免疫熒光抗體法，膠體金標(biāo)記免疫電鏡法和免疫印跡法；其中，膠體金標(biāo)記免疫電鏡法和免疫印跡法，這兩個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合起來，能夠確定該單克隆抗體的抗原決定簇在魚類淋巴囊腫病毒的分子量范圍為115kDa——125kDa的衣殼蛋白上。
全文摘要
本發(fā)明是抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。其是由名稱為雜交瘤細(xì)胞LCDV－V，保藏號(hào)為CCTCC－C200619的雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞分泌的。該單抗具有與淋巴囊腫病毒的分子量范圍為115kDa－125kDa的衣殼蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的特性。制備該單抗的方法是從以分離的、淋巴囊腫病毒分子量范圍為115kDa－125kDa的衣殼蛋白為抗原開始，采用免疫學(xué)方法產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的檢測(cè)篩選方法，篩選出抗魚類淋巴囊腫病毒衣殼蛋白的單克隆抗體。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1850860SQ20061004458
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 程順峰 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)