專利名稱：抗白斑癥病毒黏附蛋白vp19的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體應(yīng)用技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗白斑癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)黏附蛋白VP19(virus protein 19)的單克隆抗體及其制備方法，屬于分子免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦白斑癥病毒是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，是造成自1993年以來我國大面積暴發(fā)對(duì)蝦病毒性疾病的主要病原，對(duì)我國的對(duì)蝦生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害，而目前尚未有有效的防治方法。目前病毒黏附蛋白與細(xì)胞受體的關(guān)系及其作用機(jī)理以及WSSV的感染和致病機(jī)理還未闡明，還沒有可用于病毒增殖的細(xì)胞系，但已有成熟的動(dòng)物模型。囊膜蛋白是病毒感染與致病力的重要決定因子，WSSV有兩個(gè)重要的囊膜蛋白VP19和VP28，其中VP28已被初步證明在病毒吸附與入侵中起著關(guān)鍵作用，可能是病毒的黏附蛋白。而VP19的作用尚未有報(bào)道，該VP19蛋白的單克隆抗體尚未用于中和試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明擬研制抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體，為篩選白斑癥病毒的粘附蛋白提供手段和方法，并進(jìn)一步鑒定白斑癥病毒的受體蛋白，研究白斑癥病毒的感染機(jī)理，從而切斷病毒的感染途徑，達(dá)到預(yù)防控制蝦類病毒病的目的。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體。該單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200618的雜交瘤細(xì)胞分泌的，該單克隆抗體有中和白斑癥病毒的特性。
所述的單克隆抗體的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜上的VP19蛋白。
一種制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的方法，所述的制備方法是從以分離的白斑癥病毒和分離的病毒囊膜蛋白VP19為抗原開始，采用免疫學(xué)方法，產(chǎn)生融合的瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的篩選方法，篩選出抗白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的單克隆抗體；再采用免疫學(xué)的檢測鑒定方法，檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定其對(duì)應(yīng)的抗原決定簇VP19蛋白是病毒的黏附蛋白。
所述的免疫學(xué)的篩選方法是間接免疫熒光抗體法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法。
所述的免疫學(xué)的檢測鑒定方法是酶聯(lián)免疫吸附法和螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)由于研制了一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體；該雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)為CCTCC-C200618，其分泌的特異性抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體。該單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜蛋白VP19，該單克隆抗體有中和該病毒的特性，則VP19蛋白是白斑癥病毒的黏附蛋白。所以使得該單克隆抗體應(yīng)用到白斑癥病毒病的研究中，并進(jìn)一步鑒定白斑癥病毒的受體蛋白，研究白斑癥病毒的感染機(jī)理，從而切斷病毒的感染途徑，達(dá)到預(yù)防控制蝦類病毒病的目的。長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞貼壁良好，大小均一，渾圓，透亮，有無限分裂增生能力，常規(guī)培養(yǎng)2——3天，培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該培養(yǎng)基中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量的抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體。該單克隆抗體的熒光間接免疫檢測結(jié)果顯示在患白斑癥病毒的對(duì)蝦鰓絲上該病毒繁殖區(qū)域顯示黃綠色熒光，即表征該單克隆抗體能與白斑癥病毒發(fā)生特異性結(jié)合；該單克隆抗體的轉(zhuǎn)印免疫印跡檢測結(jié)果顯示變性后的白斑癥病毒囊膜蛋白VP19結(jié)合有該單克隆抗體，即表征該單克隆抗體的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜蛋白VP19；在螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)中，該單克隆抗體有中和效果，具有使螯蝦死亡率低、存活時(shí)間長的能力，即表征該單克隆抗體的抗原決定簇VP19蛋白是白斑癥病毒的黏附蛋白。
由于本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞所分泌的白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體及其制備方法，其中制備技術(shù)路線是從以分離的白斑癥病毒和分離的囊膜蛋白VP19為抗原開始，產(chǎn)生融合的瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的篩選方法，篩選出抗白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的單克隆抗體；再采用免疫學(xué)的檢測鑒定方法，檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定其對(duì)應(yīng)的抗原決定簇VP19蛋白是病毒的黏附蛋白。使得本發(fā)明的該技術(shù)路線設(shè)計(jì)新穎，嚴(yán)密而合理。本發(fā)明的該技術(shù)路線的創(chuàng)新點(diǎn)在于將免疫熒光抗體檢測方法和轉(zhuǎn)印免疫印跡檢測方法結(jié)合起來，能夠更加進(jìn)一步直觀地顯示本發(fā)明單克隆抗體與非變性的和變性后的該病毒發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)在被該病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞核，即該病毒繁殖區(qū)域顯示黃綠色熒光，即證實(shí)該病毒與本發(fā)明單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合；在變性后的該病毒的囊膜蛋白VP19處顯示藍(lán)色條帶，即進(jìn)一步證實(shí)與該單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗原決定簇是該病毒囊膜蛋白VP19。完善了白斑癥病毒的單克隆抗體診斷方法，為檢測不同地域、不同宿主的白斑癥病毒提供手段和方法。首次將該病毒囊膜蛋白的單克隆抗體應(yīng)用于中和研究中，并用酶聯(lián)免疫吸附檢測方法和宿主體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)兩種方法檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定VP19是該病毒的黏附蛋白。本發(fā)明的白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單抗的制備為篩選白斑癥病毒的粘附蛋白提供了手段和方法，以及為白斑癥病毒的受體、配體的鑒定奠定了基礎(chǔ)；也可作為開發(fā)被動(dòng)免疫口服疫苗的重要原料。中和單克隆抗體與病毒的保護(hù)性抗原特異性結(jié)合，為制備抗獨(dú)特型抗體、亞單位疫苗及基因工程疫苗等提供了理論依據(jù)。


本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合實(shí)驗(yàn)及其附圖進(jìn)一步說明如下圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線方框圖。
圖2為本發(fā)明單克隆抗體的間接免疫熒光檢測結(jié)果A圖。
圖3為本發(fā)明單克隆抗體的間接免疫熒光檢測結(jié)果B圖。
圖4為本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)印免疫印跡檢測結(jié)果圖。
圖5為本發(fā)明單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢測中和性結(jié)果圖。
圖6為本發(fā)明單克隆抗體的螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)檢測中和性的結(jié)果圖。
參見圖1中的制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的技術(shù)路線是從以分離的白斑癥病毒和分離的囊膜蛋白VP19為抗原開始，采用免疫學(xué)方法，產(chǎn)生融合的瘤細(xì)胞；采用免疫學(xué)篩選方法，篩選出抗白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的單克隆抗體；再采用免疫學(xué)的檢測鑒定方法，檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定VP19為該病毒的黏附蛋白。
圖2是患白斑癥病毒病的蝦的鰓與本發(fā)明單克隆抗體反應(yīng)，在該病毒繁殖區(qū)域顯示黃綠色熒光。
圖3是陰性對(duì)照，是健康蝦的鰓與本發(fā)明單克隆抗體不反應(yīng)，無黃綠色熒光。
圖4中的M是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白電泳后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；1是提純的白斑癥病毒電泳后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；2是陰性對(duì)照，是普通瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與轉(zhuǎn)印后的病毒反應(yīng)，用免疫檢測方法檢測的結(jié)果；3是將本發(fā)明單克隆抗體與轉(zhuǎn)印后的病毒反應(yīng)，在白斑癥病毒上識(shí)別的囊膜蛋白的分子量為19kDa；4是CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的白斑癥病毒中和單抗F與轉(zhuǎn)印后的該病毒抗原不反應(yīng)，即說明本發(fā)明的抗原——分離的病毒囊膜蛋白VP19具有與已知抗原(保藏編號(hào)CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的白斑癥病毒中和單抗F所對(duì)應(yīng)的抗原)不相同的表位。
圖5中的陽性對(duì)照是中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜和白斑癥病毒反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測，酶標(biāo)儀測得的OD值結(jié)果；陰性對(duì)照是中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜和磷酸鹽緩沖液孵育，陰性對(duì)照，用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測，酶標(biāo)儀測得的OD值結(jié)果；單抗A是白斑癥病毒與本發(fā)明單克隆抗體孵育后，再與中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測，酶標(biāo)儀測得的OD值結(jié)果。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的OD值的比值不小于2。
圖6中的陽性對(duì)照是將白斑癥病毒注射入螯蝦體內(nèi)，15天中螯蝦的死亡率變化；陰性對(duì)照是將磷酸鹽緩沖液注射入螯蝦體內(nèi)，15天中螯蝦的死亡率變化；本發(fā)明單克隆抗體(圖中的單抗A)是將本發(fā)明單克隆抗體與白斑癥病毒孵育后，注射入螯蝦體內(nèi)，15天中螯蝦的死亡率變化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200618的雜交瘤細(xì)胞分泌的，該單克隆抗體的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜上的VP19蛋白，該單克隆抗體有中和白斑癥病毒的特性。
本發(fā)明的制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的方法如下一、抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的研制1、抗原的制備(1)白斑癥病毒的制備①取明顯患白斑病的中國對(duì)蝦頭胸部(去除肝胰腺)，加25％蔗糖溶液(蒸餾水配，W/V)，冰浴勻漿。
②勻漿液4℃條件下以600×g離心20分鐘，沉淀組織碎塊。
③?、诓剿蒙锨逶?℃條件下800×g離心20分鐘，取上清。
④?、鄄剿蒙锨逡?℃條件下25000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時(shí)，棄去上清液；⑤?、懿剿贸恋碛?5％蔗糖溶液重懸，4℃條件下攪拌1小時(shí)；⑥攪拌后液體輕鋪于蔗糖梯度(蔗糖梯度分別為33％、40％、46％、52％、57％、62％)上，4℃條件下25000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時(shí)；⑦離心后取病毒區(qū)帶，25％蔗糖稀釋，4條件下25000轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時(shí)。
⑧?、卟剿贸恋淼牟《居昧姿猁}緩沖液重懸，負(fù)染電鏡觀察病毒完整性，病毒80％完整，具囊膜，分裝，凍存于-80℃。
(2)白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的制備①將(1)提取的病毒加入等比例含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3-5min。。
②將①處理過的病毒加入電泳儀(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad)上樣孔中，在穩(wěn)流條件下，起始時(shí)用低電流(30-40mA)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70mA)，電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，取出凝膠③取出②中電泳后的凝膠放在CuCl2可逆染色液(CuCl22H2O 5.11克溶于100ml雙蒸水中)中，注意將膠體完全浸沒，振蕩5min。
④將③處理過的膠體放在黑背景光照條件下觀察蛋白帶，找到并切下目的蛋白條帶——VP19蛋白條帶。
⑤將④切下的各蛋白條帶放入脫色液中(5％鹽酸)，振蕩脫色，約15分鐘條帶顏色消失，膠條用ddH2O反復(fù)沖洗幾次。
⑥將⑤處理過的膠條裝入洗脫玻璃管中(電洗脫儀Model 422，Bio-Rad)，加入洗脫緩沖液(50mmol/L NH4HCO3，0.1％SDS，加dH2O至1L，4℃存放)。恒流，按10mA/管設(shè)置電流值洗脫5h，或按10mA/管設(shè)置電流值洗脫過夜。
⑦洗脫后，將玻璃管取出，注意要戴手套以防手上污物污染樣品。從回收室中將含有欲回收樣品的溶液吸出，再加入適當(dāng)體積的洗脫緩沖液將回收室清洗一遍，洗滌液同回收液合并，雙蒸水透析過夜。
⑧將⑦所得透析樣品液，即VP19蛋白，在冷凍干燥機(jī)中凍干濃縮至適當(dāng)體積，分裝50 μL/管，凍存于-74℃。
2免疫免疫用小白鼠為4周齡雌性Balb/c小白鼠，用1中提純的病毒和囊膜蛋白VP19作為抗原，每次的免疫劑量為0.1ml。免疫共分4次進(jìn)行，前2次是腹腔免疫，抗原為病毒；后2次為尾靜脈免疫，抗原為囊膜蛋白VP19。前2次免疫間隔為2周，后3次免疫間隔為1周。4次免疫的進(jìn)行是第1次，基礎(chǔ)免疫，腹腔注射；第2次，加強(qiáng)免疫，腹腔注射；第3次，二次加強(qiáng)免疫，尾靜脈注射；第4次，融合前的擴(kuò)增免疫，尾靜脈注射。
3、骨髓瘤細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)融合前10天，將冷凍的P3U1骨髓瘤細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，立即放入37℃水浴融化，200×g離心3分鐘，加入1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液，置4.5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。處于對(duì)數(shù)生長期的瘤細(xì)胞渾圓，透亮，大小均一，排列整齊，呈半致密分布，取處于對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞供融合用。
4、融合小白鼠經(jīng)過4次免疫后，最后一次擴(kuò)增免疫后的第3天，殺死小鼠，無菌取脾用于細(xì)胞融合。
①乙醚麻醉免疫白斑癥病毒的Balb/c小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用RPMI1640(-)吹下形成單細(xì)胞懸液。
②將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液離心3分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，，棄去上清液，脾細(xì)胞沉淀用預(yù)熱到37℃的RPMI1640(-)重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用少量預(yù)熱到37℃的含1％HAT的1640(含10％胎牛血清)選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。
③取3×107個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重懸。
④將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細(xì)胞沉淀充分混勻。
⑤將離心管置于37℃水浴中預(yù)熱的盛水燒杯中，用吸管吸已經(jīng)預(yù)熱到37℃的聚乙二醇溶液1ml，將管尖插入管底，輕輕攪動(dòng)細(xì)胞沉淀，并緩緩滴加聚乙二醇，在1分鐘內(nèi)加完。然后在37℃水浴中靜置5分鐘。
⑥滴加已經(jīng)預(yù)熱到37℃的RPMI1640(-)液40ml，前緩后快，然后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液。
⑦將細(xì)胞沉淀用3ml預(yù)熱到37℃的1640(含10％胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，取2ml凍存于-80℃(9份1640(含10％胎牛血清)+1份二甲亞砜)，余細(xì)胞懸液里補(bǔ)加含有1％HAT的1640(含10％胎牛血清)選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液和小鼠胸腺細(xì)胞40ml，混合均勻后每孔100μl滴加到4個(gè)96孔板內(nèi)。培養(yǎng)于CO2濃度為4.5％和37℃恒溫恒濕條件下的CO2培養(yǎng)箱中。
5、間接免疫熒光法篩選融合以后的2周左右，雜交瘤細(xì)胞群落長到占96孔培養(yǎng)板的孔底1/3時(shí)開始檢測，用間接免疫熒光抗體法檢測融合細(xì)胞的陽性孔。
①用包埋液包埋患白斑病的對(duì)蝦鰓絲，冷凍。
②冰凍切片機(jī)切包埋塊并貼片，載玻片放入丙酮中固定20分鐘，然后取出風(fēng)干。
③取(2)步處理后載玻片加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，置37℃濕盒中孵育45分鐘；用含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3次，每次5分鐘。
④?、鄄教幚砗筝d玻片加第二抗體異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶200稀釋)，37℃濕盒中孵育45分鐘；用含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3次，每次5分鐘。
⑤甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，白斑癥病毒和陽性細(xì)胞上清結(jié)合，再結(jié)合熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，發(fā)黃綠色熒光；白斑癥病毒和陰性細(xì)胞上清孵育，再加熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，無熒光(見圖2)。
6、轉(zhuǎn)印免疫印跡法篩選(1)將1提純的白斑癥病毒用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。
①將提取的病毒加入等比例含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3-5min。
②將①處理過的病毒加入電泳儀(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad)上樣孔中，每孔內(nèi)加樣品10微升，在穩(wěn)流條件下，起始時(shí)用低電流(30-40mA)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70mA)，電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，取出凝膠。切下一條跑道的凝膠，考馬斯亮藍(lán)R250染色。用以鑒定十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳是否成功；③剪取一塊與電泳凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(孔徑0.22微米)以電轉(zhuǎn)移緩沖液(電轉(zhuǎn)移緩沖液25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)潤濕，放在電泳后的凝膠上。在硝酸纖維素膜上剪掉一個(gè)角，以標(biāo)志樣品順序的起始端。用潤濕的濾紙支持，將第二塊潤濕的濾紙貼在凝膠片的另一面；按上述放置順序，使膠塊與硝酸纖維素膜及濾紙形成一套夾心的″三明治″；④將″凝膠三明治″置入盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽內(nèi)，將硝酸纖維素膜面向陽極；電泳穩(wěn)流200mA，通電5小時(shí)；⑤轉(zhuǎn)移完畢，取出硝酸纖維素膜，將一半硝酸纖維素膜用考馬斯亮蘭-R250染色，7％乙酸脫去背景顏色，以顯示蛋白質(zhì)區(qū)帶；(2)免疫印跡①將另一半帶有重復(fù)樣品的硝酸纖維素膜用0.01M磷酸鹽緩沖液洗10分鐘，然后置0.01M磷酸鹽緩沖液配成的2-3％的牛血清白蛋白溶液中封閉45分鐘，37℃。
②用0.01M磷酸鹽緩沖液(含0.05％吐溫-20)洗3次，每次5分鐘。
③將硝酸纖維素膜分別置雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中和CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的白斑癥病毒中和單抗F中，普通瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，37℃緩慢搖動(dòng)1小時(shí)或4℃過夜。
④用0.01M磷酸鹽緩沖液(含0.05％吐溫-20)洗3次，每次5分鐘。
⑤將硝酸纖維素膜加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶30000稀釋于0.01M磷酸鹽緩沖液中)，37℃緩慢搖動(dòng)1小時(shí)。
⑥用0.01M磷酸鹽緩沖液(含0.05％吐溫-20)洗3次，每次5分鐘。
⑦把硝酸纖維素膜放入堿性磷酸酶發(fā)色液(NBT-BCIP發(fā)色液)中發(fā)色，直到顏色(藍(lán)色)清晰為止。
⑧用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將硝酸纖維素膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。
結(jié)果本發(fā)明的抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體識(shí)別的白斑癥病毒蛋白的分子量為19kDa(見圖4中的3)。圖4中的4是CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的白斑癥病毒中和單抗F與轉(zhuǎn)印后的該病毒不反應(yīng)，即說明本發(fā)明的抗原——分離的病毒囊膜蛋白VP19具有與已知抗原(保藏編號(hào)CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的白斑癥病毒中和單抗F所對(duì)應(yīng)的抗原)不相同的表位。
7、克隆采用有限稀釋法對(duì)檢測出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克?、僖颐崖樽硇∈螅瑹o菌取出胸腺細(xì)胞(作為飼養(yǎng)細(xì)胞)后，在100目網(wǎng)篩上研磨，用RPMI1640(-)吹下形成單細(xì)胞懸液。
②1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄去上清液，胸腺細(xì)胞沉淀用30ml1640(含10％胎牛血清)細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸。
③陽性細(xì)胞孔中的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后用1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液以10的整次倍稀釋，取450個(gè)雜交瘤細(xì)胞，放入22.5ml的胸腺細(xì)胞1640(含10％胎牛血清)懸液中，用滴管吹打均勻后，滴一個(gè)96孔板，150μl/孔，即每孔含有三個(gè)雜交瘤細(xì)胞。
④剩余的細(xì)胞懸液7.5ml與預(yù)留出的7.5ml胸腺細(xì)胞混合均勻，滴一個(gè)96孔板，平均每個(gè)孔滴加150μl，即含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。
⑤間接免疫熒光抗體法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法檢測含有一個(gè)細(xì)胞克隆的細(xì)胞孔內(nèi)上清(如圖2，3所示)，白斑癥病毒和陽性細(xì)胞上清結(jié)合，再結(jié)合熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，發(fā)黃綠色熒光；白斑癥病毒和陰性細(xì)胞上清孵育，再加熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，無熒光。電泳后的白斑癥病毒和陽性細(xì)胞上清孵育，再加羊抗小鼠IgG抗體，顯示蘭色條帶；電泳后的白斑癥病毒和陰性細(xì)胞上清孵育，再加羊抗小鼠IgG抗體，無條帶顯示。
⑥取陽性雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)孔并擴(kuò)增，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，該雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)為CCTCC-C200618。
結(jié)果長勢良好的陽性雜交瘤細(xì)胞，大小均一，渾圓，透亮，分裂旺盛；間接免疫熒光法檢測的分泌的本發(fā)明的單克隆抗體與該病毒之間的特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察被該病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞核，即病毒繁殖區(qū)域，顯示黃綠色熒光，而正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)熒光。
轉(zhuǎn)印免疫印跡檢測其分泌的本發(fā)明的單克隆抗體與VP19蛋白結(jié)合，顯示蘭色條帶；而陰性對(duì)照無條帶顯示，病毒電泳后與已有的CCTCC-C200423號(hào)雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗F不反應(yīng)。
二、檢測抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19單克隆抗體的中和性
1、中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜的提取1)取健康海捕中國對(duì)蝦，用注射器吸取抗凝劑(0.45M NaCl，0.01M KCl，0.01M EDTA·Na2，0.01M Hepes，pH7.4)后從心臟抽血，4℃條件下200×g離心10分鐘，沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)重懸，4℃條件下200×g再離心10分鐘。
2)將1)步所得沉淀用提膜緩沖液(10％蔗糖，10mM Hepes，10mM EDTA，1mM PMSF)重懸，4℃條件下勻漿，顯微鏡觀察細(xì)胞破碎情況，至90％細(xì)胞破碎。
3)將2)步所得破碎細(xì)胞懸液4℃，200×g離心10分鐘，棄沉淀。
4)取上清，4℃，8000×g離心10分鐘，棄沉淀。
5)取上清，4℃，100,000×g離心20分鐘，棄上清，取沉淀。
6)將5)步所得細(xì)胞膜沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，分裝，凍存于-80℃。
2、采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測本發(fā)明單克隆抗體的中和性1)取一中制備的白斑癥病毒(即，提純的白斑癥病毒)稀釋液(1∶100，磷酸鹽緩沖液稀釋)與本發(fā)明單克隆抗體等體積混合，室溫孵育2小時(shí)。取一中制備的白斑癥病毒稀釋液(1∶100，磷酸鹽緩沖液稀釋)與等體積的磷酸鹽緩沖液混合，室溫2小時(shí)，做病毒與膜結(jié)合陽性對(duì)照。
2)取1中提取的中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜包被于96孔酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃過夜；將酶標(biāo)板倒扣于濾紙上，去多余液體。
3)將2)中包被了中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜的96孔酶標(biāo)板中加入2％-3％的牛血清白蛋白(BSA)封閉，每孔150μl，4℃過夜或37℃孵育1小時(shí)；將上述酶標(biāo)板用含0.05％吐溫-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗三次，每次5分鐘。
4)將3)步處理過的酶標(biāo)板中分別加入與單抗孵育后的白斑癥病毒液、未與單抗孵育的白斑癥病毒液(病毒與膜結(jié)合陽性對(duì)照)，以及磷酸鹽緩沖液(病毒與膜結(jié)合陰性對(duì)照)，每孔200μl，4℃孵育4小時(shí)；然后酶標(biāo)板用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分鐘。
5)將4)步處理過的酶標(biāo)板中加入抗白斑癥病毒單抗庫的多種單抗的混合液，每孔150μl，25℃孵育4小時(shí)。然后酶標(biāo)板用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分鐘。
6)將5)步處理過的酶標(biāo)板中加入生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶200稀釋)，每孔150μl，37℃孵育1小時(shí)；然后酶標(biāo)板用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分鐘。
7)將6)步洗過的酶標(biāo)板中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素(1∶200稀釋)里，每孔150μl，37℃孵育1小時(shí)。然后酶標(biāo)板用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分鐘。
8)將7)步處理過的酶標(biāo)板中加入4-硝基酚磷酸鹽(pNPP)底物液，每孔150μl，2-5分鐘后，加入2M NaOH終止反應(yīng)，每孔50μl，用酶標(biāo)儀400nm波長測OD值。
本發(fā)明所采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測的結(jié)果(見圖5)用酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)檢測中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜與白斑癥病毒的結(jié)合，反應(yīng)陽性，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照消除了抗白斑癥病毒的混合單抗和生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，以及堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素的非特異性吸附對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響。陽性對(duì)照與陰性對(duì)照的比值不小于2，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。檢測結(jié)果表明，本發(fā)明單克隆抗體可以一定程度地封閉病毒，部分阻斷病毒與中國對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞膜的結(jié)合。
3、螯蝦體內(nèi)中和檢測抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的中和性
1)將上述一中制備的病毒用無菌磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH 7.4)稀釋(1∶100)，與本發(fā)明單克隆抗體等比例(1∶1)混合，室溫孵育2小時(shí)。取一中制備的白斑癥病毒用無菌磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH 7.4)稀釋(1∶100)，與等體積的磷酸鹽緩沖液混合，室溫2小時(shí)，做陽性對(duì)照。
2)將上述1)中制備的病毒和本發(fā)明單克隆抗體的孵育液、未結(jié)合單抗的病毒液，以及磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH 7.4)從腹面第三腹節(jié)皮下注射入螯蝦，50μl/只，螯蝦分組情況如下表1。
表1螯蝦分組注射情況 ③各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組養(yǎng)殖條件相同，每天換水一次。注射之后每天早晚觀察記錄的死亡數(shù)。
本發(fā)明所采用的螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖6)陽性對(duì)照組中螯蝦在注射白斑癥病毒后第1天開始死亡，第8天死亡率達(dá)100％；與本發(fā)明單克隆抗體孵育后的白斑癥病毒注射的螯蝦組，在注射后第3天開始死亡，第11天死亡率達(dá)100％。因此，據(jù)各組螯蝦存活時(shí)間長短，檢測出本發(fā)明單克隆抗體有一定的中和性。
總結(jié)結(jié)果本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)制備了抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體。
本發(fā)明所用儀器及試劑冰凍切片機(jī)(購自LEICA公司)；熒光顯微鏡(購自O(shè)lympus公司)；酶標(biāo)儀(購于MOLEULAR公司)；電泳槽(購于BIO-RAD公司)；洗脫儀(購于BIO-RAD公司)；1640(購自GIBCO公司)；胎牛血清(購自HYCLONE公司)；HAT(購自GIBCO公司)；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(購自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(購自SIGMA公司)；硝酸纖維素膜(購自PALL公司)；堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠血清(購自SIGMA公司)；生物素標(biāo)記羊抗小鼠血清(購自SIGMA公司)；堿性磷酸酶標(biāo)記親和素(購自SIGMA公司)；NBT-BCIP(購自SIGMA公司)；4-硝基酚磷酸鹽(pNPP)(購自SIGMA公司)。十二烷基磺酸鈉(購于Sigma公司)；丙烯酰胺(購于Sigma公司)；亞甲叉雙丙烯酰胺(購于Sigma公司)；Tris-Base(購于Sigma公司)；十二烷基磺酸鈉(購于Sigma公司)；過硫酸銨(購于Sigma公司)；四甲基乙二胺(TEMED)(購于Sigma公司)；疏基乙醇(購于Sigma公司)；甘油(購于Sigma公司)；溴酚蘭(購于Sigma公司)；Tris-Base(購于Sigma公司)；甘氨酸(購于Sigma公司)；十二烷基磺酸鈉(購于Sigma公司)；考馬斯亮藍(lán)-R250(購于Sigma公司)；4-硝基酚磷酸鹽(pNPP)(購于Sigma公司)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200618的雜交瘤細(xì)胞分泌的，該單克隆抗體有中和白斑癥病毒的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜上的VP19蛋白。
3.一種制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的方法，所述的制備方法是從以分離的白斑癥病毒和分離的病毒囊膜蛋白VP19為抗原開始，采用免疫學(xué)方法，產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞；其特征在于再采用免疫學(xué)的篩選方法，篩選出抗白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的單克隆抗體；再采用免疫學(xué)的檢測鑒定方法，檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定其對(duì)應(yīng)的抗原決定簇VP19蛋白是病毒的黏附蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的方法，其特征在于所述的免疫學(xué)的篩選方法是間接免疫熒光抗體法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體的方法，其特征在于所述的免疫學(xué)的檢測鑒定方法是酶聯(lián)免疫吸附法和螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗白斑癥病毒黏附蛋白VP19的單克隆抗體。其由保藏號(hào)為CCTCC－C200618的雜交瘤細(xì)胞分泌的，該單抗的抗原決定簇是白斑癥病毒囊膜上的VP19蛋白。該單抗的制備方法是從以分離的白斑癥病毒和分離的病毒囊膜蛋白VP19為抗原開始，采用免疫學(xué)方法，產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞；再采用免疫學(xué)的篩選方法，篩選出抗白斑癥病毒囊膜蛋白VP19的單克隆抗體；再采用免疫學(xué)的檢測鑒定方法，檢測該單克隆抗體的中和性，鑒定其對(duì)應(yīng)的抗原決定簇VP19蛋白是病毒的黏附蛋白。本發(fā)明為檢測白斑癥病毒提供手段和方法；為白斑癥病毒的受體、配體的鑒定奠定了基礎(chǔ)；為開發(fā)被動(dòng)免疫口服疫苗的重要原料；為制備抗獨(dú)特型抗體、亞單位疫苗及基因工程疫苗等提供了理論依據(jù)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1850861SQ20061004458
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 姜有聲 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)