專利名稱：一株嚴格厭氧海洋細菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一株嚴格厭氧活性海洋細菌，特別是該種海洋菌株培養(yǎng)物的活性提取物及其制法和該提取物在抗細菌藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
海洋微生物來源的新藥開發(fā)是二十一世紀世界范圍的研究熱點問題，以其新菌種來源、產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)活性物質(zhì)、克服傳統(tǒng)抗生素耐藥性以及實現(xiàn)資源可持續(xù)等特點而為人們所普遍關(guān)注。目前已經(jīng)從各類海洋微生物中分離到許多結(jié)構(gòu)新穎的抗細菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗腫瘤抗生素以及一些抗炎癥和鎮(zhèn)痛的活性物質(zhì)、酶抑制劑等。海洋中存在一類嚴格厭氧的微生物——硫酸鹽還原細菌，這類微生物在自身代謝過程中能夠分解低分子有機物并還原硫酸鹽為硫化氫，在地球化學循環(huán)中起著極為重要的作用。至今尚未見有報道從硫酸鹽還原細菌類群中分離提取到具有藥理活性的次生代謝產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種脫硫脫硫弧菌海洋菌株培養(yǎng)液的活性提取物。
本發(fā)明的另一個目的是提供了該活性提取物分離方法。
本發(fā)明進一步的目的是提供了該活性提取物在制備抗細菌藥物中的應用。
本發(fā)明中涉及的一株嚴格厭氧活性海洋細菌DM18是從中國黃海海域缺氧環(huán)境中分離獲得，該菌株合適的生長鹽濃度范圍為0.5％～5.0％；對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌有抗性，依據(jù)《Bergy’s manual of systematicalbacteriology》(vol.3.The Williams & wilkins Co.Baltimore.1984，663-669)，鑒定為Desulfovibrio desulfuricans，即脫硫脫硫弧菌，已于2006年3月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.1657。
海洋菌株DM18具有下述性質(zhì)菌株細胞呈弧狀，菌體大小為(0.6～1.0)μm×(3.5-5.0)μm，具有單根極生鞭毛，能運動，革蘭氏染色為陰性，胞內(nèi)含脫硫綠啶類的亞硫酸鹽還原酶，嚴格厭氧，能利用硫酸鹽或者其他氧化態(tài)硫化物作為電子受體來異化有機物，并產(chǎn)生H2S。最佳生長溫度范圍26～30℃，最佳生長pH為7.0～7.5。對有機碳(能)源的利用情況如下在(1)乳酸+硫酸鹽，(2)丙酮酸+硫酸鹽，(3)丙酮酸(未加硫酸鹽)，(4)蘋果酸+硫酸鹽，(5)膽堿+硫酸鹽，(6)膽堿營養(yǎng)組合中生長良好；在(1)蘋果酸(未加硫酸鹽)，(2)乙酸+硫酸鹽，(3)丁酸+硫酸鹽營養(yǎng)組合中不能生長。另外能利用硝酸鹽、亞硝酸鹽和2，4，6-三硝基苯(TNT)作為氮源和電子受體。
海洋菌株DM18的16S rDNA全基因(1391bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Genbank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登陸號為DQ417602。其全序列如下CTGCCCTTATGATCGGGATAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCGGATACGCTCAAAATGAACTTTTTGAGGAAAGATGGCCTCTGCTTGCATGCTATCACGTAAGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCATCGATGGGTAGCCGATTTGAGAGGATGATCGGCCACACTGGAACTGAAACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAACCTCTGTCAGAAGGGAAGAAACTACGTTGTGCTAATCAGCAGCGTACTGACGGTACCTTCAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCTGTAGTGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCCTTTGATACTGCACAAC
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這種海洋菌株DM18可以利用常規(guī)的液體培養(yǎng)方式，可使培養(yǎng)基中含有用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其他營養(yǎng)源。其中碳源可為乳酸、丙酮酸、蘋果酸、膽堿等。氮源可為氯化銨、硝酸鹽、亞硝酸鹽和2，4，6-三硝基苯(TNT)。至于其他營養(yǎng)源則可適當添加一些無機鹽類，例如氯化鈉、磷酸鹽類及鉀、鈣、鋅、錳、鐵之類的金屬鹽。對溫度、時間等培養(yǎng)條件并無嚴格的限制，以適宜于DM18海洋菌株的生長為準，并以選擇使培養(yǎng)物的活性提取物的收率最高的條件為好。當然這些培養(yǎng)基的組分、氫離子濃度、培養(yǎng)溫度、攪拌條件等均應根據(jù)所使用的菌株種類及外部條件等進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)，以獲得最好的效果。由以上所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當?shù)姆椒ň湍芴崛∑渲械幕钚越M分，這些方法是常使用于提取代謝物的方法，例如可利用活性提取物與其它雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進行提取，這些方法可以單獨使用，也可以適當配合或者反復使用。其中，以如下培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和提取方法來培養(yǎng)海洋菌株DM18產(chǎn)生抗生素為最佳液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；陳化海水或者人工海水1000mL；調(diào)pH7.2～7.4；其中人工海水配方為NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸餾水1000ml，pH調(diào)為7.2～7.4。
A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105mpa滅菌20min；冷卻后接種海洋菌株DM18，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于26～30℃恒溫培養(yǎng)5～7天；B.擴大培養(yǎng)按體積比5～10％的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DM18菌液，于26～30℃恒溫培養(yǎng)10～15天；C.提取將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃、減壓蒸干，得兩份干固體；D.提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅膠，減壓干燥后制成干樣品上硅膠柱，用體積比為氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脫液洗脫，采用枯草桿菌紙片法活性跟蹤手段，跟蹤活性洗脫峰；所得活性洗脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，水和甲醇作為流動相，用體積濃度為5～100％的甲醇水溶液作洗脫液進行30分鐘梯度洗脫，再用100％甲醇洗脫20分鐘；并檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性跟蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
本發(fā)明從海洋菌株DM18中提取得到的活性提取物，通過抗菌模型篩選，采用瓊脂稀釋法(葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程(第二版)，東南大學出版社，1997553～564)測定對枯草桿菌枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值，證實其培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗細菌活性乙酸乙酯相中制備出的活性組分抗枯草桿菌的MIC值為0.65μg/ml，抗金黃色葡萄球菌的MIC值為0.82μg/ml；正丁醇相中制備出的活性組分抗枯草桿菌的MIC值為1.35μg/ml，抗金黃色葡萄球菌的MIC值為0.94μg/ml。
利用本發(fā)明的活性提取物中的有效組分，可以用于制備抗細菌的藥物。
具體實施例方式
下面的實施例可以幫助本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1.液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；陳化海水1000mL。
A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105mpa滅菌20min；冷卻后接種海洋菌株DM18，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于30℃恒溫培養(yǎng)5天；B.擴大培養(yǎng)按體積比5～10％的種子培養(yǎng)液接種，采用厚質(zhì)帶蓋玻璃瓶作培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DM18菌液，于26℃恒溫培養(yǎng)15天；C.提取將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃、減壓蒸干，得兩份干固體；D.提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅膠，減壓干燥后制成干樣品上硅膠柱，用體積比為氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脫液洗脫，采用枯草桿菌紙片法活性跟蹤手段，跟蹤活性洗脫峰；所得活性洗脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，水和甲醇作為流動相，用體積濃度為5～100％的甲醇水溶液作洗脫液進行30分鐘梯度洗脫，再用100％甲醇洗脫20分鐘；并檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性跟蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
實施例2.液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；人工海水1000mL；調(diào)pH7.2～7.4；其中人工海水配方為NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸餾水1000ml，pH調(diào)為7.2～7.4。
A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105mpa滅菌20min；冷卻后接種海洋菌株DM18，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于26℃恒溫培養(yǎng)7天；B.擴大培養(yǎng)按體積比5～10％的種子培養(yǎng)液接種，采用厚質(zhì)帶蓋玻璃瓶作培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DM18菌液，于30℃恒溫培養(yǎng)10天；C.提取將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃、減壓蒸干，得兩份干固體；D.提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅膠，減壓干燥后制成干樣品上硅膠柱，用體積比為氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脫液洗脫，采用枯草桿菌紙片法活性跟蹤手段，跟蹤活性洗脫峰；所得活性洗脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，水和甲醇作為流動相，用體積濃度為5～100％的甲醇水溶液作洗脫液進行30分鐘梯度洗脫，再用100％甲醇洗脫20分鐘；并檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性跟蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
實施例3.液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；陳化海水1000mL。
A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105mpa滅菌20min；冷卻后接種海洋菌株DM18，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于28℃恒溫培養(yǎng)6天；B.擴大培養(yǎng)按體積比5～10％的種子培養(yǎng)液接種，采用厚質(zhì)帶蓋玻璃瓶作培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DM18菌液，于28℃恒溫培養(yǎng)12天；C.提取將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃、減壓蒸干，得兩份干固體；D.提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅膠，減壓干燥后制成干樣品上硅膠柱，用體積比為氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脫液洗脫，采用枯草桿菌紙片法活性跟蹤手段，跟蹤活性洗脫峰；所得活性洗脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，水和甲醇作為流動相，用體積濃度為5～100％的甲醇水溶液作洗脫液進行30分鐘梯度洗脫，再用100％甲醇洗脫20分鐘；并檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性跟蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
實施例4.活性組分活性測定結(jié)果。
采用瓊脂稀釋法(葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程(第二版)，東南大學出版社，1997553～564)測定對枯草桿菌枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值，證實其培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗細菌活性乙酸乙酯相中制備出的活性組分抗枯草桿菌的MIC值為0.65μg/ml，抗金黃色葡萄球菌的MIC值為0.82μg/ml；正丁醇相中制備出的活性組分抗枯草桿菌的MIC值為1.35μg/ml，抗金黃色葡萄球菌的MIC值為0.94μg/ml。
海洋菌株DM18的16S rDNA全基因序列表Organization Applicant----------------------Street沙河口區(qū)黃河路794號City大連市StateCountry中國PostalCodePhoneNumber0411-84109382FaxNumberEmailAddress<110>OrganizationName大連交通大學Application Project-------------------<120>Title一株嚴格厭氧海洋細菌的活性提取物及其制法和用途<130>AppFileReference無<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringctgcccttat gatcgggata acagttggaa acggctgcta ataccggata cgctcaaaat60gaactttttg aggaaagatg gcctctgctt gcatgctatc acgtaaggat gagtccgcgt120cccattagct tgttggcggg gtaacggccc accaaggcat cgatgggtag ccgatttgag180aggatgatcg gccacactgg aactgaaaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg240gggaatattg cgcaatgggc gaaagcctga cgcagcgacg ccgcgtgagg gatgaaggtt300ttcggatcgt aaacctctgt cagaagggaa gaaactacgt tgtgctaatc agcagcgtac360tgacggtacc ttcaaaggaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga420gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgtaggctgt agtgtaagtc480aggggtgaaa tcccacggct caaccgtgga actgcctttg atactgcaca acttgaatcc540
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權(quán)利要求
1.一株嚴格厭氧海洋細菌DM18 CGMCC No.1657培養(yǎng)液的活性提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋菌株DM18培養(yǎng)液的活性提取物，其特征在于為乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的海洋菌株DM18培養(yǎng)液的活性提取物，其特征在于A.液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O 0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；陳化海水或者人工海水1000mL；調(diào)pH7.2～7.4；其中，人工海水配方為NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸餾水1000ml，pH調(diào)為7.2～7.4；B.培養(yǎng)條件溫度為26～30℃，培養(yǎng)時間為5～15天。
4.一種權(quán)利要求2所述的海洋菌株DM18培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法，其特征在于包括下列步驟A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105mpa滅菌20min；冷卻后接種海洋菌株DM18，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于26～30℃恒溫培養(yǎng)5～7天；B.擴大培養(yǎng)按體積比5～10％的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DM18菌液，于26～30℃恒溫培養(yǎng)10～15天；C.提取將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃、減壓蒸干，得兩份干固體；D.提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，拌入300目～400目硅膠，減壓干燥后制成干樣品上硅膠柱，用體積比為氯仿∶甲醇＝80∶1的洗脫液洗脫，采用枯草桿菌紙片法活性跟蹤手段，跟蹤活性洗脫峰；所得活性洗脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，水和甲醇作為流動相，用體積濃度為5～100％的甲醇水溶液作洗脫液進行30分鐘梯度洗脫，再用100％甲醇洗脫20分鐘；并檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性跟蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海洋菌株DM18培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法，其特征在于液體培養(yǎng)基為KH2PO40.5g；NH4Cl 1.0g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O2.0g；70％(重量)乳酸鈉5.0g；酵母膏1.0g；CaCl2·2H2O 0.1g；FeSO4·7H2O0.5g；硫代乙醇酸納0.1g；維生素C 0.1g；陳化海水或者人工海水1000mL；調(diào)pH7.2～7.4；其中人工海水配方為NaCl 25.0g，Na2SO44.0g，KCl 0.7g，NaHCO30.20g，KBr 0.10g，H3BO30.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl2溶液，10mL 1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrO2溶液，蒸餾水1000ml，pH調(diào)為7.2～7.4。
6.權(quán)利要求1或者2所述的海洋菌株DM18培養(yǎng)液的活性提取物在制備抗細菌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物領域，涉及一株嚴格厭氧活性海洋細菌、該菌株培養(yǎng)物的活性提取物及其制法，以及該提取物在抗細菌藥物方面的應用價值。一株從中國黃海分離獲得的海洋菌株DM18、鑒定為Desulfovibrio desulfuricans的擴大培養(yǎng)液，其乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相經(jīng)硅膠柱層析和反相高壓液相分離，得到兩個有效部分的油狀物，對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌有抗性，具有作為抗細菌藥物的潛在用途。
文檔編號A61P31/04GK1891237SQ200610046178
公開日2007年1月10日 申請日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者穆軍, 焦炳華, 梁占國, 呂紅麗, 李彥生, 韋華生, 周榮麗 申請人:大連交通大學