專利名稱：免疫系統(tǒng)的激活和抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用NF-κB的誘導(dǎo)劑和抑制劑激活和抑制免疫系統(tǒng)，以及應(yīng)用所述誘導(dǎo)劑和抑制劑治療移植排斥、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、傳染病和癌癥。
背景技術(shù)：
抗原呈遞是啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟，而人們認為樹突細胞(DC)是原初T細胞最有效的抗原呈遞細胞。這部分是由于它們高度表達MHC和共同刺激分子(Hart(1997)Blood 90，3245-3287)。然而，對于調(diào)節(jié)抗原呈遞功能的生物化學途徑所知甚少，這部分是由于難以轉(zhuǎn)染DC。在本文中，本發(fā)明人使用IκB降解的抑制劑，即有效抑制NF-κB激活的PSI，顯示消除DC誘導(dǎo)混合淋巴細胞反應(yīng)的能力。抑制DC功能和消除抗原呈遞的機制涉及下調(diào)節(jié)多個步驟，其中包括共同刺激分子(CD86和CD80)、II型HLA(DQ＞DR)以及細胞因子如IL-12。此外，暴露于所述DC的T細胞不能通過隨后遇到正常DC而被刺激。這些結(jié)果指出NF-κB是阻斷抗原呈遞的有效靶。
樹突細胞在初次免疫應(yīng)答應(yīng)答呈遞抗原到原初T細胞的過程中是非常重要的。它們是骨髓衍生的細胞，在20世紀70年代早期由Steinman和Cohn(1973)J.Exp.Med 179，1109首次描述。起初因為難以分離足夠數(shù)量的樹突細胞，因此對它們的研究遇到困難，但通過用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)CD34+細胞或人類單核細胞，在體外產(chǎn)生一種DC亞群，部分克服了這個問題。這些培養(yǎng)的DC具有未成熟DC的表型，可以通過與TNFα或LPS一起孵育成熟成為高度表達MHC、CD80/86的細胞(Bender等(1996)J.Immunol.Methods 196，121；Romani等(1996)J.Immunol.Methods(1996)196，137；Reddy等(1997)Blood 90，3640)。
從外周血中的集落形成后單位(post colony-forming unit)CD14+中間體也可以衍生DC。DC遷移到皮膚、粘膜、脾和胸腺中的外周位點。它們涉及多種臨床上重要的過程，其中包括同種異體移植排斥、特應(yīng)性疾病、自身免疫和抗腫瘤免疫。
可以使用細胞因子，主要是GM-CSF、IL-4和TNFα，從CD34+干細胞或CD14+外周血單核細胞離體培養(yǎng)DC(Scabolsc等(1995)J.Immunol.154，5651-5661)。來自這些來源的DC都有免疫活性，并且能夠攝入外源呈遞的抗原、加工所述抗原并將其呈遞給細胞毒性T細胞(Grabbe等(1995)Immunology Today 16，117-121；Girolomoni和Ricciardi-Castagnoli(1997)Immunology Today 18，102-104)。DC可以傳遞體內(nèi)產(chǎn)生的抗原特異性腫瘤免疫(Kwak等(1995)Lancet 345，1016-1020)，而用腫瘤抗原離體脈沖處理自體DC，可以誘導(dǎo)可測量的抗腫瘤效應(yīng)(Hsu等(1996)Nature Medicine 2，52-58)?？梢允褂媚[瘤膜粗裂解物、純化肽或肽片段，有效脈沖處理DC。在例如WO/00/26249中描述了來自患者的自體樹突細胞的離體擴充、加載肽抗原和作為繼承性免疫治療的再輸注。
通過證明阻斷抗原呈遞下調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并且可用于治療疾病的動物模型，證實抗原呈遞在產(chǎn)生免疫應(yīng)答中的重要性。因此，已經(jīng)使用鼠II類MHC的抗體治療實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(Smith等(1994)Immunology 83，1)，而用抗體或CTLA4-Ig融合蛋白阻斷CD80/86共同刺激分子在移植或關(guān)節(jié)炎的動物模型中是有益的(Lu等(1999)GeneTher.6，554-563)。這已經(jīng)引起人們尋找可用于人類疾病或移植中的下調(diào)節(jié)抗原呈遞的新途徑。
人門已經(jīng)推測NF-κB涉及免疫系統(tǒng)。這一點在例如Baeueurle P.A.和Henkel T.的論文中有概述(Annual Reviews in Immunology，1994，第12卷，第141-179頁)。然而，由于以前無法研究激活或失活NF-κB對抗原呈遞細胞的效應(yīng)，因而沒有人證明NF-κB在免疫系統(tǒng)的激活和抑制中確實是關(guān)鍵性的。本發(fā)明人第一次證明了NF-κB在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。
轉(zhuǎn)錄因子NF-κB象蛋白一樣，其激活來自轉(zhuǎn)錄后修飾，以允許預(yù)先形成的轉(zhuǎn)錄因子從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到核。一種名為IκB的抑制劑蛋白的磷酸化和降解控制該轉(zhuǎn)運，該抑制劑蛋白與NF-κB形成復(fù)合物，因此將其保留在胞質(zhì)中。通過合適信號刺激細胞導(dǎo)致IκB的修飾，而IκB的修飾又導(dǎo)致它從NF-κB解離和/或降解。
IκB蛋白與NF-κB的結(jié)合屏蔽了NF-κB的核定位信號(NLS)。根據(jù)細胞類型和細胞發(fā)育階段用特定因子刺激細胞時，IκB受到修飾，無法結(jié)合NF-κB，導(dǎo)致NF-κB與IκB解離。
NF-κB是一種異二聚體蛋白，由一個50kD亞基(p50)和一個65kD亞基(p65)組成。已經(jīng)克隆了編碼p50和p65的cDNA，并且顯示所述cDNA在300個氨基酸的區(qū)上同源。
最近已經(jīng)克隆了NF-κB家族的另一成員Rel B，該成員是來自血清刺激的成纖維細胞的立即早期反應(yīng)基因。
p50和p65都能夠形成同二聚體，但所述同二聚體的性質(zhì)不同p50同二聚體具有強DNA結(jié)合物親和性，但不能反式激活轉(zhuǎn)錄，p65同二聚體僅能微弱結(jié)合DNA，但能夠反式激活。p50作為110kD前體(p110)的氨基末端部分合成，該前體沒有DNA結(jié)合活性和二聚活性。所述羧基末端部分包含八個錨蛋白重復(fù)，這是一個在幾種涉及細胞周期控制和分化的蛋白中發(fā)現(xiàn)的基序。
已經(jīng)鑒定了五個IκB家族成員IκBα、IκBβ、p105/IκBγ、p110/IκBΔ和IκBε(Baeuerle和Baltimore，Cell 1996，第87卷，第13-20頁)。所有IκB樣家族成員都包含多個錨蛋白重復(fù)，所述重復(fù)對于抑制NF-κB激活是必不可少的。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人巨噬細胞和類風濕性滑膜中炎癥反應(yīng)的許多關(guān)鍵特性依賴于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。本發(fā)明人已經(jīng)研究了蛋白體抑制藥物pSI，該藥物最初描述為蛋白體胰凝乳蛋白酶樣活性的抑制劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多促炎介質(zhì)(如TNFα、IL-6、IL-2)的產(chǎn)生依賴于NF-κB(可受PCT/GB98/02753所公開的AdvIκBα的抑制)，而抗炎細胞因子和介質(zhì)(即IL-10、IL-1受體拮抗物、IL-11)則不受影響。這提醒我們NF-κB準確區(qū)分這兩類介質(zhì)，這就提出問題考慮到炎癥和免疫系統(tǒng)的密切關(guān)系，NF-κB在誘導(dǎo)免疫中到底起什么作用。
本發(fā)明人首先研究了蛋白體抑制藥物PSI的效應(yīng)，該藥物不需要使用基因治療。已知該藥物抑制IκB降解，因此抑制樹突細胞免疫刺激功能中的NF-κB激活，所述激活是產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答的關(guān)鍵早期步驟。
據(jù)報道使用PSI治療單核細胞衍生的成熟DC，抑制它們在混合淋巴細胞反應(yīng)中誘導(dǎo)T細胞增殖的能力。為闡明該效應(yīng)的機制，進行細胞表面分析、細胞因子測定和共培養(yǎng)，這些研究提示阻斷NF-κB使得免疫抑制機制可以在樹突細胞和T細胞的相互作用中發(fā)揮作用。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明所述改變導(dǎo)致無反應(yīng)性應(yīng)答性應(yīng)答。也就是說，它們導(dǎo)致無法產(chǎn)生免疫應(yīng)答，甚至在除去原始的抑制化合物后也是如此。
本發(fā)明人也已經(jīng)意識到NF-κB也可以用作誘導(dǎo)或調(diào)整免疫應(yīng)答的靶。這是未曾預(yù)期到的，因為已經(jīng)顯示NF-κB已經(jīng)在DC中被激活(Feuillard等(1996)Eui.J Immunol 262547-2551；Granelli-Piperno等(1995)Proc Natl.Acad.Sci.USA 92，10944-10948)，因此本來預(yù)期進一步的激活不是有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供抑制哺乳動物(如人類)中抗原呈遞或誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的APC(如DC)功能的胞內(nèi)抑制劑。
“APC功能的胞內(nèi)抑制劑”包括任何合適的抗原呈遞細胞功能抑制劑。所謂“APC功能”包括呈遞抗原的能力、表達II類MHC的能力、表達細胞表面分子如共同刺激分子(包括CD80和CD86)的能力、產(chǎn)生細胞因子的能力和誘導(dǎo)無反應(yīng)性而不是激活的能力。APC功能的抑制劑通常是DC功能的抑制劑。所述抑制劑最好是APC內(nèi)細胞內(nèi)信號傳遞的抑制劑。“APC內(nèi)細胞內(nèi)信號傳遞”包括細胞膜和細胞核之間的通信，控制基因表達(包括表達CD80和CD86)和控制細胞骨架組構(gòu)的信號傳遞。抑制細胞內(nèi)信號傳遞包括，例如，在下文更詳細描述的NF-κB抑制劑。
為避免疑問，包含CPG基序的細胞因子和分子不是APC功能的胞內(nèi)抑制劑，因為它們在細胞外起作用。所述抑制劑當然是不殺傷所述細胞的抑制劑。
本發(fā)明的另一方面提供一種抑制哺乳動物體內(nèi)抗原呈遞或誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的NF-κB抑制劑。
藥學有效劑量指在哺乳動物中足以誘導(dǎo)所需應(yīng)答的量。可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)臨床試驗和實驗性試驗確定該量。
哺乳動物指任何哺乳動物，但尤其是指人類。
無反應(yīng)性是免疫耐受性的一種形式，其中淋巴細胞(在這種情況下是T淋巴細胞)在不合適的環(huán)境下暴露于抗原后，變得對隨后任選的免疫原性刺激不應(yīng)，所述免疫原性刺激通常是由激活的抗原呈遞細胞呈遞的免疫原性劑量抗原(參見Roitt，I.，Broskoff，J.和Male，D.(1998，第5版)Immunology，Mosby，London)。因此，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)哺乳動物中耐受性反應(yīng)的方法。
抗原呈遞指將抗原作為結(jié)合于細胞表面MHC分子的肽片段展示；只有以這種方式呈遞抗原時，T細胞才識別所述抗原。
本發(fā)明的再一方面提供一種治療變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的APC(如DC)功能的細胞內(nèi)抑制劑以在哺乳動物中誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答。
本發(fā)明的又一方面提供一種治療變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的NF-κB抑制劑以在哺乳動物中誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答。所述自身免疫病可以是任何自身免疫病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、多發(fā)性硬化、局限性回腸炎、橋本甲狀腺炎、腹腔疾病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Graves病。
可以使用本文描述的方法治療的變態(tài)反應(yīng)包括對下列變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)Fel d 1(家貓Felis domesticus的貓皮和唾液腺變應(yīng)原，其氨基酸序列在WO 91/06571中公開)、Der pI、Der pII、Der fI或Der fII(來自家塵螨嗜皮螨屬(dermatophagoides)的主要蛋白變應(yīng)原，其氨基酸序列在WO 94/24281中公開)。
本發(fā)明基本上可應(yīng)用于任何變態(tài)反應(yīng)，包括由下列選出的變應(yīng)原引起的變態(tài)反應(yīng)草、樹和雜草(包括豚草)的花粉；真菌和霉菌；食物如魚、貝類、龍蝦(crab lobster)、花生、堅果、面筋、蛋和牛奶；有螫針昆蟲(stinging insect)如蜜蜂、黃蜂和大黃蜂以及搖蚊科(chirnomidae)(非吸血蠓)；蜘蛛和螨，包括家塵螨；在哺乳動物如貓、狗、牛、豬、綿羊、馬、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙土鼠的皮屑、尿、唾液、血液或其它體液中發(fā)現(xiàn)的變應(yīng)原；一般空氣中的顆粒；膠乳；以及蛋白去污劑添加劑。
還可以治療針對來自下列昆蟲的蛋白的變態(tài)反應(yīng)家蠅、果蠅、sheep blow fly、錐蠅、米象、蠶、蜜蜂、非吸血蠓幼蟲、蠟螟幼蟲、面粉蟲、蟑螂和黃粉甲(Tenibrio molitor)的幼蟲。
本發(fā)明的再一方面提供預(yù)防哺乳動物(如人類)中移植排斥的方法，所述方法包括給予藥學有效量的APC(如DC)功能的細胞內(nèi)抑制劑以在哺乳動物中誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答。
本發(fā)明的又一方面提供預(yù)防移植排斥的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的NF-κB抑制劑以誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及用作藥物的APC功能抑制劑例如NF-κB抑制劑，所述藥物用以誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答、抑制移植組織的排斥、或作為抗自身免疫病藥物或用于治療變態(tài)反應(yīng)。
本發(fā)明還提供NF-κB抑制劑，用于生產(chǎn)治療移植排斥、變態(tài)反應(yīng)或自身免疫病的藥物。
所述NF-κB抑制劑最好是蛋白水解的抑制劑，例如蛋白體抑制劑。所述抑制劑可以是可從Calbiochem獲得的PSI。已知PSI是蛋白體的抑制劑(Traechner等，EMBO J.(1994)，第13卷，第5433-41頁；Griscavage等，PNAS(1996)，第93卷，第3308-12頁；Bondeson等，J.Immunol.(1999)，第162卷，第2939-45頁)。也可以使用ALLN(Jobin等，Hepatology(1998)，第27卷，第1285-95頁)；Lactacystin(Delic等(1998)，第77卷，第1103-07頁)；MG-132(Jobin等，同上)；C-LFF和鈣蛋白酶抑制劑(Neauparfant和Hiscott，Cytokine & Growth FactorReviews(1996)，第7卷，第175-190頁)；或CVT-134(Lum等，Biochem.Pharmacol(1998)，第55卷，第1391-97頁)作為抑制劑。
其它抑制劑包括咖啡酸苯乙酯(Natarajan等，PNAS(1992)，第93卷，第9090-95頁)；吡咯烷二硫代碳酸酯(Schreck等，J.Exp.Med.(1992)，第175卷，第1181-94頁)；洛伐他汀(Guijarro等，Nephrol DialTransplant(1996)，第11卷，第990-996頁)；Aselastine HCL(Yoneda，Japan.J.Pharmacol.(1997)，第73卷，第145-153頁)；Tepaxalin(Kazmi等，J Cell.Biochem.(1995)，第57卷，第299-310頁)；(-)-沒食子茶精-3-五倍子酸(Lin & Lin，Mol.Pharmacol.(1997)，第52卷，第465-472頁)；deoxyspergualin(Tapper等，J Immunol.(1995)，第155卷，第2427-36頁)；苯基-N-叔丁基硝酮(Kotake等，Biochem.Biophys Acta(1998)，第1446卷，第77-84頁)；槲皮素(Sato等，J Rheumatol.(1997)，第24卷，第1680-84頁)；Cucumin(Chan，Biochem，Pharmacol.(1998)，第55卷，第965-973頁)；或E3330(Goto等，Mol.Pharmacol(1996)，第49卷，第860-873頁)。
從本文指出的NF-κB抑制劑和激活劑的例子可以清楚地看出，優(yōu)選所述抑制劑或激活劑進入所述細胞并在細胞內(nèi)起作用，即作為細胞內(nèi)NF-κB抑制劑或激活劑起作用，如作為導(dǎo)致NF-κB抑制或激活的細胞內(nèi)信號傳遞事件的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的另一實施方案中，NF-κB的抑制劑抑制NF-κB，即直接對NF-κB的水平(量)、細胞定位或活性起作用。例如，所述抑制劑可以是天然出現(xiàn)的與NF-κB直接相互作用的NF-κB調(diào)節(jié)劑，例如IκB。
所述抑制劑最好是IκB，尤其是IκBα，IκBα在例如Makarov的論文，Gene Therapy，1997，第4卷，第846-852頁以及PCT/GB98/02753中有描述。其它NF-κB抑制劑包括反義cDNA或編碼任何已知NF-κB亞基的寡核苷酸，所述NF-κB亞基如p50、p65、Rel B。Bondeson等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，5668描述了一種編碼IκB的腺病毒。
所述抑制劑也可以是選擇性破壞編碼NF-κB的mRNA的核酶，或者是防止NF-κB轉(zhuǎn)錄的反義分子，或者是阻斷NF-κB作用的抗體或抗體樣分子。這些抑制劑將在下面更詳細描述。人們將會認識到，APC(如DC)功能抑制劑也可以包括例如抑制APC內(nèi)細胞內(nèi)信號傳遞的核酶或反義分子或抗體或抗體樣分子。
人們將會認識到，NF-κB抑制劑的抑制劑可以作為NF-κB誘導(dǎo)劑。因此，阻斷IκBα功能或表達的抗體或反義分子或核酶可以作為NF-κB誘導(dǎo)劑。所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用在下文描述。
以下文獻中描述了本文公開的病毒或病毒樣顆粒的基因組中編碼的核酶Cech和Herschlag“單鏈DNA的位點特異性切割”US5,180,818；Altman等“用RNA酶P切割靶RNA”US 5,168,053、Cantin等“HIV-1 RNA的核酶切割”US 5,149,796；Cech等“RNA核酶限制性內(nèi)切核糖核酸酶和方法”US 5,116,742；Been等“RNA核酶聚合酶、脫磷酸酶、限制性內(nèi)切核酸酶和方法”，US 5,093,246；以及Been等“RNA核酶聚合酶、脫磷酸酶、限制性內(nèi)切核糖核酸酶和方法；通過轉(zhuǎn)酯作用在特定位點切割單鏈RNA”，US 4,987,071，所有文獻都通過引用結(jié)合到本文中。
所述抑制劑最好由核酸序列編碼，例如由在載體如腺病毒內(nèi)的核酸序列編碼。編碼所述抑制劑的核酸序列最好有效連接表達所述序列所必需的調(diào)節(jié)元件。所述載體可用于基因治療，以允許編碼所述抑制劑的核酸序列能夠插入哺乳動物的體內(nèi)。本領(lǐng)域內(nèi)已知基因治療的方法，例如使用腺病毒。所述載體也可以包含編碼抗原性分子的核酸序列。
所使用的載體構(gòu)建物最好是AdvIκBα，該構(gòu)建物在PCT/GB98/02753中公開。
“有效連接”指這樣的并列設(shè)置在該設(shè)置下可以執(zhí)行各成分的正常功能。因此，編碼序列“有效連接”調(diào)節(jié)元件指這樣的設(shè)置在該設(shè)置下編碼NF-κB抑制劑(或誘導(dǎo)劑，如下文更詳細的描述使用)的核酸序列能夠在調(diào)節(jié)序列的控制下表達。
“調(diào)節(jié)序列”指在特定宿主生物中表達有效連接的編碼序列所必需的核酸序列。例如，適合真核細胞的調(diào)節(jié)序列是啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
“載體”指包括單鏈、雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA的DNA分子。合適的載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、疸病毒和細菌質(zhì)粒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體是通過將它們的基因組隨機整合進宿主基因組而復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄病毒。WO 92/07573描述了合適的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
腺病毒是線性雙鏈DNA病毒。合適的腺病毒載體描述于Rosenfeld等，Science，1991，第252卷，第432頁。
腺伴隨病毒(AAV)屬于細小病毒科，包括約4-6KB的單鏈DNA。
痘病毒載體是大病毒，有幾個可插入基因的位點。它們對熱穩(wěn)定，可以在室溫儲存。安全性研究指出痘病毒載體是復(fù)制缺陷型，不能從宿主傳傳播到宿主或從宿主傳播到環(huán)境。
可以將包含編碼NF-κB抑制劑(或誘導(dǎo)劑，如下文描述)的核酸的載體以脂質(zhì)體的形式，采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，引入哺乳動物體內(nèi)?；蛘?，可以使用氣溶膠形式的脂質(zhì)體，通過粘膜或肺到達機體。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
免疫脂質(zhì)體(抗體導(dǎo)向的脂質(zhì)體)尤其可用于靶向過量表達細胞表面蛋白、并且可獲得針對所述蛋白的抗體的細胞類型，這對于樹突細胞或前體是有可能的，例如使用針對CD1、CD14或CD83的抗體(或其它樹突細胞或前體細胞表面分子，如上文所述)。為制備免疫脂質(zhì)體，依照Martin和Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酰]磷脂酰乙醇胺)。將MPB-PE加入脂質(zhì)體雙分子層中，使抗體或其片段與脂質(zhì)體表面形成共價偶聯(lián)。將本發(fā)明的DNA或其它遺傳構(gòu)建物方便地加載到脂質(zhì)體上以傳遞到靶細胞，例如通過以下步驟在包含所述DNA或其它遺傳構(gòu)建物的溶液中形成所述脂質(zhì)體，然后在高達0.8MPa的氮氣壓力下，順序擠出通過0.6μm和0.2μm孔徑的聚碳酸酯濾膜。在擠出步驟后，在80000xg超速離心45分鐘，分離已包載的DNA構(gòu)建物和游離DNA構(gòu)建物。將新鮮制備的脫氧緩沖液中的MPB-PE脂質(zhì)體與新鮮制備的抗體(或其片段)混合，在4℃下氮氣環(huán)境中恒定豎轉(zhuǎn)式旋轉(zhuǎn)(end over end rotation)過夜，進行所述偶聯(lián)反應(yīng)。在80000xg超速離心45分鐘，分離免疫脂質(zhì)體和未偶聯(lián)的抗體?？梢宰⑸涿庖咧|(zhì)體，例如腹膜內(nèi)注射，或?qū)⑵渲苯幼⑸淙氚屑毎嬖诘奈稽c，例如通過皮下注射。DNA疫苗形式的編碼NF-κB抑制劑的裸DNA，也可以用作NF-κB抑制劑。
如上文所提到的，另一種可用的抑制劑是應(yīng)用NF-κB序列(如RelB)的反義核酸。這樣的反義核酸包含能夠結(jié)合NF-κB核酸序列、抑制所述NF-κB序列轉(zhuǎn)錄的核酸序列。產(chǎn)生反義核酸的方法本身是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
反義寡核苷酸是能夠特異性結(jié)合互補核酸序列的單鏈核酸。通過與合適的靶序列結(jié)合，形成RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA雙鏈體。因為這些核酸與基因的有義鏈或編碼鏈互補，所以常常將它們稱為“反義的”。最近，已經(jīng)證明形成三股螺旋是可能的，其中寡核苷酸結(jié)合到DNA雙鏈體上。人們發(fā)現(xiàn)寡核苷酸能夠識別DNA雙螺旋大溝中的序列。因此形成三股螺旋。這提示有可能合成通過識別大溝氫鍵位點而特異性結(jié)合雙鏈DNA的序列特異性分子。
上述寡核苷酸通過結(jié)合到靶核酸上，能夠抑制所述靶核酸的功能。例如，這可能是阻斷轉(zhuǎn)錄、加工、添加poly(A)、復(fù)制、翻譯的結(jié)果，或者是促進細胞的抑制機制，例如促進RNA降解的結(jié)果。
在實驗室中制備反義寡核苷酸，然后將其引入細胞，例如通過微注射或從細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基攝入細胞，或者在用攜帶反義基因的質(zhì)粒或反轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體轉(zhuǎn)染細胞后，在細胞內(nèi)表達所述反義基因。人們首先發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸在勞斯肉瘤病毒、皰疹性口腔炎病毒、1型單純皰疹病毒、猿猴病毒和流感病毒的細胞培養(yǎng)物中抑制病毒復(fù)制或表達。從那以后，人們廣泛研究了在包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物和麥胚提取物的無細胞系統(tǒng)中反義寡核苷酸對mRNA翻譯的抑制。已經(jīng)使用與AIDS HIV反轉(zhuǎn)錄病毒RNA互補的寡核苷酸，在體外證明了反義寡苷酸抑制病毒功能(Goodchild，J.1998“反義寡脫氧核苷酸對人免疫缺陷病毒復(fù)制的抑制”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究顯示最有效的寡核苷酸與poly(A)信號互補；同樣有效的是靶向RNA 5’末端的寡核苷酸，尤其是靶向帽和臨近引物結(jié)合位點以及在引物結(jié)合位點上的5’非翻譯區(qū)的寡核苷酸。所述帽、5’非翻譯區(qū)和poly(A)信號位于反轉(zhuǎn)錄病毒RNA末端的重復(fù)序列(R區(qū))內(nèi)，與它們互補的寡核苷酸可以結(jié)合所述RNA兩次。
反義寡核苷酸一般長15到35個堿基。例如，已經(jīng)顯示20聚體寡核苷酸抑制表皮生長因子受體mRNA的表達(Witters等，Breast CancerRes Treat 5341-50(1990))，而已經(jīng)顯示25聚體寡核苷酸降低促腎上腺皮質(zhì)激素的表達90％以上(Frankel等，J Neurosurg 91261-7(1999))。然而，人們知道，可能理想的是使用超出該范圍長度的寡核苷酸，例如10、11、12、13或14個堿基，或36、37、38、39或40個堿基。
所述反義核酸可以由合適載體編碼，例如由下面討論的類型編碼。
所述抑制劑或者可以是抗NF-κB疫苗或是針對NF-κB的抗體或其片段如Fv。所述疫苗或抗體可以針對NF-κB的任何合適部分，只要其導(dǎo)致NF-κB的抑制。所述抗體最好是單克隆抗體。產(chǎn)生疫苗和抗體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的?；蛘?，所述抗體可以是仍然保持抗NF-κB活性的合適抗體片段，例如Fab或(Fab)2片段或Fv。所述抗體可以連接允許進入細胞的多肽序列，即所述抗體(尤其是抗體片段)可以連接到促進細胞(如DC)攝入所述抗體的部分。例如，所述抗體可以連接本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的能夠促進細胞攝入所述分子或相互作用多肽的親脂性分子或多肽結(jié)構(gòu)域。因此，所述部分可以衍生自允許進入細胞的Antennapedia螺旋3(Derossi等(1998)Trends Cell Biol 8，84-87)或者HIV的序列(一般是tat)。這樣的序列是已知的，包括允許進入細胞的穿透肽(penetraiion peptide)和HIV的序列(一般是工程化的tat)?；蛘?，可以將編碼所述抗體(最好是抗體片段)的cDNA作為如上文所述的載體傳遞。
本發(fā)明的再一方面提供刺激哺乳動物(如人類)抗原呈遞或免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予藥用有效劑量的APC(如DC)功能的細胞內(nèi)誘導(dǎo)劑。
“APC功能的細胞內(nèi)增強劑”包括任何合適的抗原呈遞細胞功能增強劑。所述增強劑一般是DC功能的增強劑。所述增強劑最好是APC內(nèi)細胞內(nèi)信號傳遞的增強劑。
術(shù)語“APC功能”和“APC內(nèi)的細胞內(nèi)信號傳遞”如上文所定義。
為避免疑問，包含CPG基序的細胞因子和分子不是APC功能的細胞內(nèi)誘導(dǎo)劑或增強劑，因為它們在細胞外起作用。
本發(fā)明的又一方面提供通過給予藥用有效劑量的NF-κB誘導(dǎo)劑，刺激哺乳動物的抗原呈遞或免疫應(yīng)答的方法。所述方法最好用于通過刺激哺乳動物的免疫系統(tǒng)，治療(包括預(yù)防性治療)傳染病或癌癥。傳染病包括朊病毒相關(guān)疾病，其中包括海綿狀腦病。該方法可用于治療(包括預(yù)防性治療)特征在于機體內(nèi)(有害)分子(例如多肽)的異常類型和/或異常高水平的疾病或病癥，例如與慢性炎癥有關(guān)的炎癥介質(zhì)(例如細胞因子)的水平；細胞或結(jié)締組織基質(zhì)的分解產(chǎn)物，例如纖連蛋白片段；β-淀粉樣多肽(與早老性癡呆有關(guān))。刺激針對這樣的分子的免疫應(yīng)答能夠幫助從機體中除去所述分子，因此幫助解決或預(yù)防所述病癥。
優(yōu)選所述癌癥抗原是下面任一種表位或包含至少一種下面任一種表位i)在腫瘤中以異常高水平表達的正常細胞蛋白；如多種腫瘤中的細胞周期蛋白D1；乳腺癌中的細胞周期蛋白E；多種腫瘤中的mdm2；在各種腫瘤中都表達的EGFR、erb-B2、erb-B3、FGF-R、胰島素樣生長因子受體、Met、myc、p53和BCL-2。
ii)在腫瘤中突變的正常細胞蛋白；如在多種腫瘤中的Ras突變；在多種腫瘤中的p53突變；CML和ALL中的BCR/ABL易位；AML和MDS中的CSF-1受體突變；結(jié)腸癌中的APC突變；MEN2A、2B和FMTC中的RET突變；神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的EGFR突變；PML中的PML/PARA易位；前B細胞白血病和兒童急性白血病中的E2A-PBX1易位。
iii)腫瘤中與病毒感染有關(guān)的病毒編碼蛋白；如宮頸癌中的人乳頭瘤病毒蛋白；B細胞淋巴瘤和Hodgkin淋巴瘤中的EB病毒蛋白；成人T細胞白血病中的HTLV-1蛋白；肝細胞癌中的乙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒蛋白；卡波西肉瘤中的皰疹樣病毒蛋白。
iv)感染IHV的患者體內(nèi)的HIV編碼蛋白。
因此，上述癌癥相關(guān)抗原可以分為三個主要的類別(i)在腫瘤細胞中高水平表達的正常自身抗原；(ii)在腫瘤細胞中表達的突變型自身抗原；(iii)在腫瘤中表達的與病毒感染有關(guān)的病毒抗原。優(yōu)選類(i)。
類(i)包括三個亞型a)過量表達的正常細胞蛋白；
b)在正常細胞中以組織特異性方式表達、但也在腫瘤中表達的蛋白；和c)屬于胚胎抗原的蛋白，所述蛋白在大多數(shù)成人組織中沉默，而在腫瘤中異常表達。
b)和c)的例子有b)組織特異性分化抗原如腫瘤反應(yīng)性CTL的靶，如GATA-1、IKAROS、SCL(在造血譜系和白血病中表達)；和免疫球蛋白恒定區(qū)(用于治療多發(fā)性骨髓瘤)；和c)用于治療白血病和維爾姆斯瘤的維爾姆斯瘤抗原1(WT1)，和于治療肝部和腸腫瘤的癌胚抗原(CEA，一種胎蛋白)。在一個實施方案中，通過腫瘤樣品的粗提物提供所述癌相關(guān)抗原。
在Stauss和Dahl(1995)Tumour Immunology，Dalgleish/Browning，第7章中描述了在人類腫瘤中過量表達癌基因編碼的蛋白以及在人類腫瘤中表達的突變型癌基因，該文獻特此通過引用結(jié)合到本文中。
優(yōu)選治療患有以下疾病的患者癌癥；更優(yōu)選以下任何一種乳腺癌；膀胱癌；肺癌；前列腺癌；甲狀腺癌；白血病和淋巴瘤如CML、ALL、AML、PML；結(jié)腸癌；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；精原細胞瘤；肝癌；胰腺癌；膀胱癌；腎癌；宮頸癌；睪丸癌；頭頸癌；卵巢癌；成神經(jīng)細胞瘤和黑素瘤。
CML是慢性髓細胞白血病；ALL是急性成淋巴細胞白血??；AML是急性髓細胞白血??；而PML是前髓細胞白血病。
或者，患者患有由病原體引起的任何疾病或有患此病的危險，尤其是由細菌、酵母、病毒、錐蟲等引起的疾病。優(yōu)選所述疾病由病原體的慢性感染引起。優(yōu)選所述病原體不容易被宿主免疫系統(tǒng)清除。
優(yōu)選所述疾病是病毒感染，更優(yōu)選由以下任一種病毒引起的疾病HIV、乳頭瘤病毒、EB病毒、HTLV-1、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒或任何引起慢性感染的病毒。尤其優(yōu)選所述病毒是HIV。
在一些疾病如某些類型甲狀腺病中，細胞產(chǎn)生異常大量的激素。因此，本發(fā)明的方法可用于幫助消除產(chǎn)生大量激素的細胞。所述抗原可以是細胞過度產(chǎn)生的激素、參與合成所述激素的生物合成酶。
也可以有效治療患有細菌感染的患者，所述細菌感染尤其是引起慢性感染的感染。所述細菌感染可以是細胞內(nèi)感染。因此，所述方法可用于治療肺結(jié)核。
本發(fā)明人已經(jīng)意識到NF-κB的關(guān)鍵功能使其受到刺激后導(dǎo)致哺乳動物(如人類)體內(nèi)免疫應(yīng)答增強。
本發(fā)明的又一方面提供用作藥物、尤其是作為免疫應(yīng)答刺激劑的NF-κB誘導(dǎo)劑。所述NF-κB誘導(dǎo)劑可以用作抗傳染病劑，或作為抗癌藥，或用于治療如上文所述特征在于(有害)分子的異常類型和/或異常高水平的疾病或病癥。
在患有傳染病或癌癥或特征在于機體內(nèi)分子的異常類型和/或異常高水平的病癥的患者體內(nèi)增強免疫應(yīng)答，將通過增加機體自身對抗所述傳染病或癌癥或病癥的免疫應(yīng)答而幫助治療患者。
本發(fā)明的再一方面提供用于生產(chǎn)藥物的NF-κB誘導(dǎo)劑，所述藥物用于刺激免疫應(yīng)答。所述誘導(dǎo)劑最好用于治療傳染病或癌癥或如上文所限定的病癥。
優(yōu)選的NF-κB誘導(dǎo)劑包括MEKKI、NIK、IKK1、IKK2、TRAF2、TRAF5、TRAF6、TAK、TPL-2或Rel B或其它NF-κB亞基如p65或cRel。也可以使用能夠誘導(dǎo)NF-κB的所述誘導(dǎo)劑的片段和突變蛋白。所述誘導(dǎo)劑可以由如上文關(guān)于NF-κB抑制劑所述的載體編碼，然后將其引入需要治療的患者的細胞中。
優(yōu)選的NF-κB誘導(dǎo)劑是MyD88的顯性失活突變體(即能夠抑制野生型MyD88分子的信號傳遞，例如在其中存在野生型和抑制性MyD88分子的細胞中)。所述抑制可能由于阻斷內(nèi)源野生型MyD88與內(nèi)源MyD88的結(jié)合配偶體如Toll樣受體(TLR)之間的相互作用所致。所述顯性失活突變體可以是MyD88lpr(Burns等(1988)J Biol Chem 273(20)，12203-12209)或缺乏死亡域的MyD88片段(參見Burns等(1988)和該文獻評論的參考文獻)。據(jù)認為MyD88(骨髓分化蛋白)具有一個模塊組構(gòu)，所述模塊組構(gòu)由N末端死亡域(DD)、C末端Toll域和將兩個結(jié)構(gòu)域分開的短接頭組成(在Burns等(1998)中綜述)。所述N末端DD涉及約90個氨基酸的基序，據(jù)認為該基序介導(dǎo)與其它DD序列的蛋白-蛋白相互作用，形成同二聚體或異二聚體(Boldin等(1995)J Biol Chem270，387-391)。
所述抑制性MyD88可以是活性不如MyD88的MyD88分子，最好基本不能結(jié)合DD(例如MyD88的DD或IRAK的DD)。例如，所述抑制性MyD88可以是活性不如MyD88，最好基本不能通過DD而二聚體化。所述抑制性MyD88分子可以是MyD88的截短形式，例如其中缺失全部或部分名為死亡域的結(jié)構(gòu)域的MyD88分子。它可以是突變型MyD88分子，例如在DD中例如由于非保守性突變而發(fā)生突變的MyD88分子。例如，它可以在相當于全長小鼠MyD88的Phe56的位置發(fā)生突變，例如突變?yōu)锳sh。它可以是如上文提到的名為MyD88lpr的突變型MyD88分子，其中還缺失MyD88的N末端53個氨基酸Burns等(1998)J.Biol.Chem.273，12203-12209。與野生型MyD88例如小鼠野生型MyD88相比，MyD88lpr具有一個點突變(F56N；小鼠序列編號)。該點突變位于DD內(nèi)，防止DD的二聚體化(Burns等(1998))。該突變對應(yīng)于lprcp突變，已知lprcp突變可能是通過破壞DD域的構(gòu)象而消除Fas的細胞毒性信號傳遞(Nagata(1994)Semin Immunol 6，3-8；Huang等(1996)Nature 384，638-641)。
已經(jīng)公開了野生型MyD88和顯性失活MyD88(MyD88-lpr)的構(gòu)建物(Burns K.等J.Biol Chem 1998)，但MyD88-lpr被錯誤地描述成在其死亡域上發(fā)生一單氨基酸突變，其中Phe56突變?yōu)锳sn。該突變對應(yīng)于Fas配體死亡域中存在的lprcp突變，lprcp突變通過破壞死亡域的構(gòu)象而消除其下游信號傳遞。實際上，除所述點突變外，在N末端域還存在一個53個氨基酸的缺失(缺失所述genebank序列的1-159堿基)。該缺失導(dǎo)致缺失部分死亡域。
優(yōu)選所述抑制性MyD88包含有功能的Toll域，即能夠與Toll域例如野生型MyD88(如野生型人或小鼠MyD88)的Toll域或TLR相互作用的Toll域。優(yōu)選所述抑制性MyD88包含全長MyD88 Toll域。全長Toll域?qū)τ赥oll-Toll域相互作用是必不可少的。
測量蛋白-蛋白相互作用(以及它們的增強或破壞)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的。在Burns等(1998)中也描述了測量DD和Toll-Toll相互作用的合適方法。合適的方法可以包括，例如，酵母雙雜種相互作用、共純化、ELISA、共免疫沉淀、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)和表面等離子體(plasmon)共振技術(shù)。因此，假如通過ELISA、共免疫沉淀或表面等離子體共振方法或酵母雙雜種相互作用或共純化方法可以檢測到一種MyD88多肽與包含DD或Toll域的多肽之間的相互作用，那么就可以認為所述MyD88分子能夠結(jié)合DD或Toll域或與其相互作用。優(yōu)選的方法是表面等離子體共振。
初步研究表明MEKK1能夠誘導(dǎo)NF-κB并增強APC(如DC)功能。優(yōu)選所述誘導(dǎo)劑能夠在DC或其前體中誘導(dǎo)NF-κB。因此，APC功能誘導(dǎo)劑或增強劑可以用于疫苗生產(chǎn)。相似的，APC功能抑制劑可以用于防止細胞識別特定抗原，因此誘導(dǎo)無反應(yīng)性狀態(tài)。
因此，本發(fā)明提供一種分子，所述分子包含(1)一個包含或編碼細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑的部分(調(diào)節(jié)部分)，所述細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑例如抗原呈遞細胞(APC)如DC的功能的胞內(nèi)抑制劑或細胞內(nèi)增強劑，和(2)一個包含或編碼抗原性分子的部分(抗原性部分)。具體地說，本發(fā)明提供編碼一種抗原和一種調(diào)節(jié)劑的多核苷酸，所述調(diào)節(jié)劑例如DC功能的抑制劑或增強劑。所述分子最好是或包含編碼一種抗原以及一種APC(如DC)功能增強劑的DNA疫苗。所述調(diào)節(jié)劑例如APC(如DC)功能增強劑可以是保留或增強了其細胞內(nèi)信號傳遞活性的細胞內(nèi)信號分子或其衍生物。優(yōu)選所述衍生物保留或增強DC功能。所述衍生物最好是NF-κB的激活劑/誘導(dǎo)劑。它可以是NF-κB或其成分。所述DNA疫苗可以包含包括以下部分的重組多核苷酸一個編碼APC(如DC)功能的增強劑的部分以及一個編碼抗原性分子的部分。或者，所述抗原性分子可以由獨立的多核苷酸分子編碼；而這是不太優(yōu)選的。
人們將認識到，可以使用如所述的優(yōu)選的抑制劑。
優(yōu)選的增強劑是MEKK和MyD88的顯性失活突變體，例如MyD88lpr。
人們將認識到在本發(fā)明的疫苗中可以使用如上文所述的優(yōu)選增強劑/誘導(dǎo)劑。
所述抗原性分子可以包含一種或多種表位的一個以上拷貝。例如，它可以包含單一表位形成氨基酸序列的單一拷貝，所述氨基酸序列例如長約8到30個氨基酸的序列，優(yōu)選長約10到18個氨基酸的序列，更優(yōu)選長約15個氨基酸的序列。它可以包含所述表位形成序列的多個拷貝，或者包含至少兩種不同表位形成序列的單一或多個拷貝?？梢赃B接所述抗原性序列，形成結(jié)構(gòu)域樣結(jié)構(gòu)，或?qū)⑺隹乖蛄蟹胖迷谳d體多肽的不同點。所述多核苷酸可以編碼一種或幾種不同的抗原性分子，其中每一種分子都包含一個或多個抗原性部分或表位。
本發(fā)明還包括編碼在本發(fā)明中使用的NF-κB誘導(dǎo)劑的DNA疫苗。所述疫苗可以包括DNA序列，所述DNA序列中加入了來自一種病原體的目的抗原、或者如上文所述的一種癌特異性抗原或異常分子如β淀粉樣蛋白、或者朊病毒，所述病原體如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等，HIV、HTLV、流感、結(jié)核、瘧疾的病原體。此外，所述疫苗還可能包括一種NF-κB激活劑、可能包括兩種或多種NF-κB激活劑以發(fā)揮最大作用?？乖图せ顒┒继幱谡{(diào)節(jié)抗原和激活劑表達的合適啟動子序列的控制之下。刺激免疫應(yīng)答的另一種方法可以是提供包含編碼NF-κB誘導(dǎo)劑的核酸序列的載體，所述編碼NF-κB誘導(dǎo)劑的核酸序列有效連接表達所述序列所必需的調(diào)節(jié)元件。所述載體可以包含誘導(dǎo)型啟動子，以使得通過增強NF-κB的激活而增強免疫反應(yīng)。
在Thomson等(1996)J.Immunol.157，822-826和WO 96/03144中描述了使用重組多表位疫苗傳遞多CD8CTL表位，這兩份文獻都通過引用結(jié)合到本文中。在本發(fā)明中，可能希望在單一疫苗中包括一種肽(或編碼一種肽的核酸)，其中所述肽以任何順序包括例如來自腫瘤相關(guān)抗原的一種或多種抗原性氨基酸序列(例如每種序列長約8到18個氨基酸)以及一種CD4T細胞刺激表位(例如來自破傷風類毒素)。所述“串珠(bead-on-a-string)”疫苗一般是DNA疫苗。
所述抗原性分子可以包含在轉(zhuǎn)化細胞或癌細胞上存在的表位(即腫瘤相關(guān)抗原或表位，例如由高比率的人黑素瘤產(chǎn)生的MAGE-1抗原(vad der Bruggen等(1991)Science 254，1643))。或者，它可以包含在致病生物如病毒中存在的表位，或者在受到致病生物感染的細胞(最好是人類細胞)上存在的表位，所述細胞例如上文提到的病毒感染的細胞。
所述表位可以是T細胞表位，即能夠誘導(dǎo)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的T細胞應(yīng)答(TH-1應(yīng)答)的表位，所述T細胞應(yīng)答最好是CD8+細胞毒性T細胞應(yīng)答，或者是能夠誘發(fā)CD4+輔助T細胞應(yīng)答(TH-2反應(yīng))的表位。在某些情況下可能不希望有細胞毒性T細胞應(yīng)答，例如當所述抗原是分枝桿菌抗原(例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)或麻風分枝桿菌(M.leprae)抗原)時。
所述抑制劑或誘導(dǎo)劑或抗原可以是肽模擬化合物，例如對應(yīng)于上文所討論的多肽抑制劑或誘導(dǎo)劑的肽模擬化合物。
術(shù)語“肽模擬物”指這樣的化合物，該化合物模擬作為治療劑的特定肽的構(gòu)象和所需特點，但避免可能不希望有的特點。例如，嗎啡是可以口服給予的化合物，它是內(nèi)啡肽的肽模擬物。
涉及肽的治療應(yīng)用由于缺乏口服生物利用性以及由于蛋白水解降解而受到限制。例如，一般地說，肽在體內(nèi)被外肽酶和內(nèi)肽酶快速降解，導(dǎo)致一般非常短的生物半衰期。將肽作為可能的治療劑的另一缺點是它們?nèi)狈νㄟ^口服給予的生物利用性。胃腸道內(nèi)蛋白水解酶對肽的降解可能是起重要作用的因素。然而，問題比這更復(fù)雜，因為人們已經(jīng)認識到，甚至不受快速代謝物失活影響的小環(huán)狀肽仍然顯示口服生物利用性差。這可能是由于穿過腸膜的轉(zhuǎn)運差、肝提取將其從血液中快速清除以及隨后排泄入腸。這些觀察提示多酰胺鍵可能干擾口服生物利用性。據(jù)認為肽鏈中連接氨基酸殘基的肽鍵在口服給予所述肽藥物時斷裂。
有多種不同方法設(shè)計和合成肽模擬物。在如Sherman和Spatola，J.Am.Chem.Soc.，112433(1990)公開的一種方法中，用多種化學官能團以基本上等排(isoteric)的方式取代一個或多個酰胺鍵。該逐步方法已經(jīng)取得一定的成功，獲得活性類似物。在一些情況下，已經(jīng)顯示這些類似物比它們天然出現(xiàn)的對應(yīng)物具有更長的生物半衰期。該方法仍然有限制。很少成功地取代一個以上的酰胺鍵。因此，所獲得的類似物仍然對該分子中其它地方的酶促失活敏感。當取代肽鍵時，優(yōu)選新的接頭部分具有與肽鍵基本相同的電荷分布和基本相同的極性。
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，例如在Mézière等(1997)J.Immunol.159 3230-3237中描述的那些方法，合成其中肽鍵倒轉(zhuǎn)的反-倒位(retro-inverso)肽模擬物。該方法涉及制造包含涉及骨架的改變、而不是改變側(cè)鏈取向的假肽。包含NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵的反-倒位肽對蛋白水解更有抗性。
在另一方法中，使用多種非編碼氨基酸或修飾過的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸來修飾哺乳動物肽。或者，已經(jīng)通過共價修飾穩(wěn)定了假定有生物活性的構(gòu)象，所述修飾如環(huán)化或加入γ內(nèi)酰胺或其它類型的橋。參見，例如Veber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111166(1983)。
許多合成策略中的共同主題是在基于肽的框架中引入一些環(huán)狀部分。所述環(huán)狀部分限制所述肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)象空間，這常常導(dǎo)致所述肽對特定生物活性受體的親和性增加。該策略的另一好處是在肽中引入環(huán)狀部分還導(dǎo)致肽對細胞肽酶的敏感性降低。
合成環(huán)狀穩(wěn)定肽模擬物的一種方法是環(huán)合復(fù)分解(RCM)。該方法涉及下列步驟合成肽前體，使其與RCM催化劑接觸，產(chǎn)生構(gòu)象受到限制的肽。合適的肽前體可以包含兩個或多個不飽和C-C鍵?？梢允褂霉滔嚯暮铣杉夹g(shù)進行所述方法。在該實施方案中，錨定到固體支持物上的所述前體與RCM催化劑接觸，然后從所述固體支持物上切割下產(chǎn)物，產(chǎn)生構(gòu)象受到限制的肽。
可以使用在合成多肽之前或之后化學修飾一個或多個氨基酸殘基的多肽作為抗原，只要所述多肽的功能即在體內(nèi)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答基本保持未變。所述修飾包括與酸或堿(尤其是生理上可接受的無機或有機酸和堿)形成鹽、形成末端羧基的酯或酰胺、以及連接氨基酸保護基如N-叔丁氧羰基。所述修飾可以保護多肽免受體內(nèi)代謝。
本發(fā)明的另一方面提供嵌合分子的成套部分(a kit of parts)或組合物，其中包括(1)一種細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑，例如APC(如DC)功能的胞內(nèi)抑制劑或細胞內(nèi)增強劑，和(2)包含或編碼一種抗原性分子的抗原性部分。
本發(fā)明的又一方面包括一種成套部分或組合物或嵌合分子(如嵌合多肽)，其中包含如上文所述的一個NF-κB抑制或激活/誘導(dǎo)部分和一個抗原性部分。
本發(fā)明這些方面中的任一個部分或兩個部分還可以包含一個轉(zhuǎn)運部分和/或一個細胞結(jié)合部分。所述細胞結(jié)合部分最好能夠結(jié)合樹突細胞或其前體。所述轉(zhuǎn)運部分有助于所述分子內(nèi)化，或者至少有助于所述抗原性部分、最好所述信號傳遞抑制或增強部分內(nèi)化。因此，外源應(yīng)用的肽可以連接于HIV tat肽。該肽可以指導(dǎo)它們進入I型MHC途徑，由CTL呈遞(參見，例如，Kim等(1997)J.Immumol.159，1666-1668。WO 95/31483描述了可以按照本發(fā)明修飾的嵌合分子。
樹突細胞可以根據(jù)CD80、CD86、CD40、CD1a、HLA-DR和/或CD83細胞表面分子的表達來鑒定。未成熟的樹突細胞可能是CD34+或CD14+。因此，所述細胞結(jié)合部分可能能夠結(jié)合一種或多種這些細胞表面分子(例如，能夠結(jié)合這樣一種分子的抗體)。
未成熟的DC顯示增強的抗原捕獲和加工。它們顯示大量的細胞內(nèi)I型MHC和II型MHC；增強的胞吞作用和吞噬作用；高CCR1、CCR5和CCR6；低CCR7；高CD68；低CD40、CD54、CD80、CD83和CD86；沒有DC-LAMP。
成熟DC顯示增強的抗原加工。它們顯示出高表面I型MHC和II型MHC；低胞吞作用和吞噬作用；低CCR1、CCR5和CCR6；高CCR7；低CD68；高CD40、CD54、CD58、CD80、CD83和CD86；高DC-LAMP；和高p55 fascin。
所述細胞結(jié)合部分可用于將如本文所述的任何抑制劑或激活劑導(dǎo)向APC(如DC或未成熟DC)，所述抑制劑或激活劑例如核酸、DNA疫苗或抗體。
所述多核苷酸或DNA疫苗最好能夠在患者體內(nèi)表達所編碼的反義分子或多肽，更優(yōu)選在患者的APC(如DC或未成熟DC)中表達。如本文所述，如果合適，可以從任何合適的多核苷酸(遺傳構(gòu)建物)表達所述反義分子或多肽(例如NF-κB抑制劑或誘導(dǎo)劑/激活劑)或抗原，然后將其傳遞給所述患者。通常表達所述反義分子或多肽的遺傳構(gòu)建物包含有效連接啟動子的所述多肽編碼序列，所述啟動子能夠在患者細胞中表達轉(zhuǎn)錄的多核苷酸(如RNA)分子，然后翻譯所述多核苷酸分子合成所述多肽。合適的啟動子是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括用于遍在表達的例如看家基因的啟動子或用于組織特異性基因表達的啟動子(取決于需要表達所述多肽的位點，例如在樹突細胞或其前體中)。尤其是假如所述多肽的傳遞或攝入被靶向選定的細胞(即樹突細胞或其前體)，那么最好使用樹突細胞或樹突前體細胞選擇性啟動子，但這不是必不可少的。
在樹突細胞中選擇性表達的啟動子可以是來自CD36或CD83基因的啟動子。
可以如下將所述疫苗靶向特定的細胞群體例如抗原呈遞細胞例如，通過注射所述部位、使用靶向載體和傳遞系統(tǒng)，或者從患者體內(nèi)選擇性純化所述細胞群體并離體給予所述肽或核酸(例如可以如Zhou等(1995)Blood 86，3295-3301；Roth等(1996)Scand.J.Immunology43，646-651中所述分選樹突細胞)。此外，靶向載體可以包含指導(dǎo)所述抗原在合適位點表達的組織特異性或腫瘤特異性啟動子。
如上文所提到的，可能希望使用誘導(dǎo)型啟動子。人們將認識到，可能理想的是能夠在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)所述多肽(例如NF-κB抑制劑或激活劑/誘導(dǎo)劑)的時序表達。因此，可能希望所述多肽的表達直接或間接地(參見下文)處于啟動子的控制之下，而所述啟動子可以通過例如一種小分子濃度來調(diào)節(jié)，當需要激活或抑制(取決于所述小分子是導(dǎo)致所述啟動子的激活還是抑制)所述多肽的表達時，可以將所述小分子給予所述患者。人們將會認識到假如所述表達構(gòu)建物能夠在所述細胞中穩(wěn)定一段時間(至少一周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、八個月或更長時間)，即能夠表達所述多肽(在任何必需的調(diào)節(jié)分子存在下)，這將是特別有利的。本發(fā)明優(yōu)選的構(gòu)建物包括可調(diào)型啟動子。可調(diào)型啟動子的例子包括在下面文獻中提到的啟動子Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(15)，8657-62(由雷帕霉素控制，雷帕霉素是一種口服可生物利用的藥物，使用兩種獨立的腺病毒或腺伴隨病毒(AAV)載體，一種載體編碼編碼誘導(dǎo)型人生長激素(hGH)靶基因，另一種編碼二分雷帕霉素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子)；Magari等(1997)J ClinInvest 100(11)，2865-72(由雷帕霉素控制)；Bueler(1999)Biol Chem380(6)，613-22(腺伴隨病毒載體的綜述)；Bohl等(1998)Blood 92(5)，1512-7(由腺伴隨載體中的強力霉素控制)；Abruzzese等(1996)J MolMed 74(7)，379-92(綜述誘導(dǎo)因子，如激素、生長因子、細胞因子、細胞抑制劑、輻射、熱激和相關(guān)的效應(yīng)元件)。也可以使用四環(huán)素誘導(dǎo)載體。這些是由相對無毒的抗生素激活的啟動子，并且已經(jīng)顯示可用于調(diào)節(jié)哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的表達。同時基于類固醇的誘導(dǎo)劑可能是特別有用的，因為類固醇受體復(fù)合物進入核，DNA載體在核中轉(zhuǎn)錄前必須分離。
可以通過在兩個水平上調(diào)節(jié)表達而進一步改善該系統(tǒng)，例如通過使用如上文討論并且是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的組織特異性啟動子和由外源誘導(dǎo)劑/抑制劑(如小分子誘導(dǎo)劑)控制的啟動子。因此，調(diào)節(jié)的一個水平可能涉及連接合適的多肽編碼基因到誘導(dǎo)型啟動子上，而調(diào)節(jié)的另一水平包括使用組織特異性啟動子驅(qū)動編碼必需的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子(它控制所述多肽(例如NF-κB抑制劑或誘導(dǎo)劑/激活劑編碼基因從所述誘導(dǎo)型啟動子的表達)的基因。通過所述遺傳構(gòu)建物細胞類型特異性打靶，可以進一步改善控制。
如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的，可以在完整的哺乳動物體內(nèi)評估前，在體外產(chǎn)生的APC(例如DC)中評估本發(fā)明的方法和構(gòu)建物。實施例1描述了合適的方法。
可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法制備本發(fā)明的構(gòu)建物。
本發(fā)明的再一方面提供用于本發(fā)明的載體、疫苗和抗體。
可以使用合適的藥學上可接受的載體、填充劑或其它添加劑配制本發(fā)明的疫苗和載體(本發(fā)明的治療分子)。可以通過任何合適的方法給予它們，例如肌內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、口服途徑、肛門途徑、鼻內(nèi)途徑等。優(yōu)選皮下給予或肌內(nèi)給予。人們將認識到最好口服給予上文討論的誘導(dǎo)劑，如小分子誘導(dǎo)劑。
可能最好是用包含所述治療分子(如遺傳構(gòu)建物)的合適傳遞溶媒局部灌注包含靶細胞的區(qū)域一段時間；另外或者用另一種方法，可以將所述傳遞溶媒或治療分子直接注射(如皮下注射)入包含靶細胞的可到達區(qū)域。傳遞遺傳構(gòu)建物(如腺病毒載體構(gòu)建物)到患者細胞的方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的。
尤其是可以使用繼承性治療(adoptive therapy)方法，或者可以使用基因槍傳遞所述構(gòu)建物到例如皮膚中的樹突細胞。
繼承性療法包括以下步驟(1)從患者獲得抗原呈遞細胞或其前體，最好是樹突細胞或其前體；(2)使所述抗原呈遞細胞與上文所述的NF-κB抑制劑或誘導(dǎo)劑/激活劑離體接觸，任選地還與需要針對其的免疫應(yīng)答的抗原或上文討論的的嵌合分子或多核苷酸離體接觸；然后(3)將經(jīng)如此處理的抗原呈遞細胞重新引入患者體內(nèi)。
所述樹突細胞宜是用多肽脈沖處理的自體樹突細胞，所述多肽如NF-κB激活劑或一種抗原。在Murphy等(1996)The Prostate 29，371-380和Tjua等(1997)The Prostate 32，272-278中描述了使用自體樹突細胞的T細胞療法，其中使用來自腫瘤相關(guān)抗原的肽脈沖處理所述樹突細胞。
在另一實施方案中，使所述抗原呈遞細胞如樹突細胞與編碼所述NF-κB抑制劑或激活劑/誘導(dǎo)劑的多核苷酸接觸。所述多核苷酸可以是任何合適的多核苷酸，優(yōu)選它能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突細胞，因此分別導(dǎo)致所述抗原呈遞細胞所負責的抗原呈遞的激活或抑制。
如上文提到的，所述多核苷酸方便的是包含在病毒多核苷酸或病毒中。例如，已經(jīng)顯示腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細胞誘導(dǎo)與MUC1有關(guān)的抗原特異性抗腫瘤免疫(參見Gong等(1997)Gene Ther.4，1023-1028)。相似的，可以使用基于腺病毒的系統(tǒng)(參見，例如，Wan等(1997)Hum.Gene Ther.8，1355-1363)；可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(Specht等(1997)J.Exp.Med.186，1213-1221和Szabolcs等(1997)Blood 90，2160-2167)；也可以使用粒子介導(dǎo)的到樹突細胞的轉(zhuǎn)移(Tuting等(1997)Eur.J.Immunol.27，2702-2707)；還可以使用RNA(Ashley等(1997)J.Exp.Med.186，1177-1182)。
可以從患者(即自體樹突細胞)或一個或多個健康個體(MHC匹配或不匹配)獲得APC如樹突細胞，如上文在體外處理，然后進行繼承性治療，即將經(jīng)如此操作的樹突細胞引入體內(nèi)，所述樹突細胞隨后激活CTL反應(yīng)。所謂“健康個體”指總體健康狀態(tài)良好的個體，優(yōu)選所述個體的免疫系統(tǒng)有活性，并且更優(yōu)選不曾患過可容易測試和檢測的任何疾病。
因此，本發(fā)明的方法包括繼承性免疫治療的方法。
優(yōu)選將103到1011DC給予患者；更優(yōu)選106到107DC。
可以通過任何方便的途徑給予所述APC如DC。優(yōu)選靜脈內(nèi)給予所述DC。還優(yōu)選局部給予所述DC到疾病位點(例如腫瘤或局部病毒感染或細菌感染部位)。對于癌癥尤其優(yōu)選局部給予。方便的是，將所述DC給予供應(yīng)疾病位點或疾病所處的組織的動脈。
可以將所述細胞(或疫苗)給予正在用某種其它方法治療所述疾病的患者。因此，雖然可以單獨使用所述治療方法，但理想的是將其作為一種輔助治療。
可以在其它治療之前、期間或之后給予所述APC(如DC)或疫苗。
當需要治療的疾病是癌癥時，優(yōu)選已經(jīng)或正在或即將用常規(guī)治療或手術(shù)以及本發(fā)明的方法治療所述癌癥。方便的是，根據(jù)所述治療，使用放射療法或化學療法治療所述癌癥。
當需要治療的疾病是病原體感染時，優(yōu)選已經(jīng)、正在或即將用常規(guī)方法或手術(shù)治療所述感染。
假如需要治療的患者受到HIV感染，優(yōu)選使用本發(fā)明的方法輔助其它療法，所述其它療法例如使用反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑如AZT或3TC的療法或者聯(lián)合療法如HART(高活性反轉(zhuǎn)錄病毒療法)。
當使用本發(fā)明的方法治療實體瘤時，優(yōu)選將所述APC(如DC)或疫苗作為第一手術(shù)后治療(first post-surgery treatment)給予。
當使用本發(fā)明的方法治療白血病時，優(yōu)選在放射治療或化學治療后給予所述APC(如DC)或疫苗。還優(yōu)選組合使用所述DC與骨髓移植聯(lián)合治療白血病患者。
癌癥治療如繼承性免疫治療在控制或消除最小殘余疾病時最有效，而不是在減少大體積疾病(bulk disease)時有效?？梢韵胂竺庖咧委熡捎谧⑷爰毎拘訲淋巴細胞而暫時增加大體積疾病的尺寸。在治療后可以監(jiān)測疾病的程度和體積，但不能使用該指標作為正式的終點。在長時間內(nèi)以常規(guī)方法隨訪患者，保證沒有顯示長期的不利事件。
其它傳遞或靶向策略可以包括以下方法?？梢允褂脧椀缐嚎s空氣驅(qū)動的DNA/蛋白包被納米顆粒穿透(例如使用BioRad裝置)培養(yǎng)物中或體內(nèi)的細胞。用于傳遞的構(gòu)建物最好具有細胞類型特異性啟動子。
適于胃腸外給予的制劑包括水性或非水無菌注射溶液，所述溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑以及使所述制劑與目標受體血液等滲壓的溶質(zhì)；以及水性和非水懸浮液，所述懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以盛裝在單位劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿或管形瓶)中，并且可以保存在冷凍干燥(凍干)環(huán)境下，僅需要在臨用前加入無菌液體溶媒如注射用水?？梢詮谋绢I(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的種類的無菌粉末、顆粒劑或片劑制備臨時配制的注射液和懸浮液。鼻用噴霧劑也是有用的形式。
所述構(gòu)建物的劑量例如取決于所述構(gòu)建物的大小和給予其的目的。一般地說，根據(jù)需要治療組織的表面積計算該范圍。構(gòu)建物的有效劑量取決于所述構(gòu)建物的大小、所使用的傳遞溶媒/靶向方法以及所述寡核苷酸的化學組成，但技術(shù)人員可以例如利用來自動物的數(shù)據(jù)和上文提到的體外測試系統(tǒng)確定合適的劑量。
例如，對于治療和預(yù)防目的，都可以系統(tǒng)地給予患者所述構(gòu)建物。例如，可以通過如上文所述的任何有效方法給予所述構(gòu)建物，所述方法如胃腸外途徑(如靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑)或口服途徑、鼻途徑，或允許所述構(gòu)建物例如到達患者血流并在血流中循環(huán)的途徑。除局部給予構(gòu)建物外，最好系統(tǒng)給予構(gòu)建物，但在不采用局部給予構(gòu)建物時系統(tǒng)給予構(gòu)建物也有實用性。
據(jù)認為樹突細胞攝入所述核酸并表達所編碼的多肽可能是引發(fā)免疫應(yīng)答的機制；然而，樹突細胞可能沒有受到轉(zhuǎn)染，但仍然是重要的，因為它們從所述組織的轉(zhuǎn)染細胞中獲取表達的肽。
優(yōu)選將所述疫苗(如DNA疫苗)肌內(nèi)給予。也優(yōu)選將所述疫苗給予皮膚上或皮膚內(nèi)。
如上文提到的，本發(fā)明提供一種成套部分或組合物或嵌合分子，其中包括(1)一個包含或編碼NF-κB抑制劑或誘導(dǎo)劑的調(diào)節(jié)部分和(2)一個包含或編碼抗原性分子的抗原性部分。
關(guān)于本發(fā)明的任一前述方面，尤其是如上文所述的疫苗或所述成套部分或嵌合分子或組合物，所述抗原性分子最好包含在轉(zhuǎn)化細胞或癌細胞或致病生物上存在的表位，或者在受到致病生物感染的細胞上的表位。
因此，本發(fā)明提供有效對抗癌癥、或癌細胞或腫瘤細胞、或?qū)怪虏∩锘蚋腥局虏∩锏募毎囊呙?，所述疫苗包含有效量的如上文所述NF-κB誘導(dǎo)劑或其它APC功能誘導(dǎo)劑，或包含有效量的編碼NF-κB誘導(dǎo)劑或其它APC功能誘導(dǎo)劑的多核苷酸。所述疫苗最好還包含一種抗原或編碼抗原的多核苷酸，所述抗原具有在所述癌細胞或腫瘤細胞上存在的表位或者在致病生物或感染致病生物的細胞上存在的表位。所述疫苗最好是核酸疫苗。
本發(fā)明的再一方面提供一種藥用組合物，所述藥用組合物包含本發(fā)明任一前述方面的NF-κB誘導(dǎo)劑、NF-κB抑制劑、疫苗、分子、多核苷酸、成套部分或嵌合分子或組合物以及一種藥學上可接受的載體。
本發(fā)明還提供用于醫(yī)藥的本發(fā)明前述任一方面的疫苗、分子、多核苷酸、成套部分、組合物或嵌合分子。本發(fā)明還提供應(yīng)用本發(fā)明前述任一方面的疫苗、分子、多核苷酸、成套部分、組合物或嵌合分子生產(chǎn)用于治療需要調(diào)節(jié)抗原呈遞的患者的藥物。
清楚的是本發(fā)明提供殺傷患者體內(nèi)異常表達第一表位(firstepitope)的靶細胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)從所述患者獲得APC(如樹突細胞)；(2)使所述APC(如樹突細胞)與APC(如DC)功能增強劑離體接觸；(3)任選地使所述細胞與所述表位接觸或與編碼所述表位的多核苷酸或表達載體接觸，然后(4)將經(jīng)如此處理的APC(如樹突細胞)重新引入患者體內(nèi)。
清楚的是本發(fā)明提供殺傷患者體內(nèi)異常表達第一表位的靶細胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)從所述患者獲得樹突細胞；(2)使所述樹突細胞與NF-κB誘導(dǎo)劑離體接觸；(3)任選地使所述細胞與所述表位接觸或與編碼所述表位的多核苷酸或表達載體接觸，然后(4)將經(jīng)如此處理的樹突細胞重新引入患者體內(nèi)。
所述靶細胞可以是癌細胞。
本發(fā)明還提供在體內(nèi)或體外抑制或刺激樹突細胞成熟和激活的方法，所述方法包括給予有效量的NF-κB抑制劑或誘導(dǎo)劑。
所述抑制劑或誘導(dǎo)劑如上文定義。
為避免疑問，在使用術(shù)語“樹突細胞”的地方，除非上下文另外指明，該術(shù)語包括任何合適的抗原呈遞細胞。優(yōu)選所述抗原呈遞細胞是樹突細胞。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案將在下文描述。


圖1.用PSI處理的DC的細胞生存力。成熟DC或者未處理，或者用不同劑量PSI處理4小時。洗滌后，細胞在如所述沒有補充單核細胞條件培養(yǎng)基的RPMI 1640中培養(yǎng)。處理后6天，細胞重懸浮于含10μg/ml碘化丙錠PI的PBS中并用FACSscan分析。
圖2.用蛋白體抑制劑CbZ-Ile-Glu(O-tert-bytyl)-Ala-leucinal(PSI)處理的DC的免疫刺激能力。成熟DC用PSI(0.1μM▲)、(0.5μM■)、(1μM●)或不用PSI(○)處理4小時。洗滌后，將每類DC不同數(shù)目的細胞和105異種淋巴細胞接種到96孔板中。在第6天根據(jù)3H-TdR攝入測定確定增殖。(每一點代表五個單獨實驗的平均值+/-SEM)。
圖3.使用單克隆抗體、HLA-DR、CD86(PE綴合的)；(Pharmingen，San Diego，CA)研究PSI對表面抗原表達的效應(yīng)。PSI處理后第6天，用上文列出的MoAb研究未經(jīng)處理(綠線)、PSI(0.1μM)處理(藍點線)、PSI(1μM)處理(紅點線)群體的表型，并用FACSscan(Becton Dickinson)分析所述群體。
圖4.異種-MLR缺乏增殖反應(yīng)的恢復(fù)。成熟DC用溶媒(A)或PSI(1μM)(B)處理4小時。洗滌后，將每種處理DC以逐級增加的數(shù)目與105異種淋巴細胞接種到包含溶媒(○，●)、2ng/ml IL-2(□，■)或10g/ml抗CD28抗體(△，▲)的96孔板中。第6天使用3H-TdR攝入測定確定增殖。(每一點代表三個單獨實驗的平均值+/-SEM)。
圖5.PSI預(yù)處理的DC抑制異種-MLR中淋巴細胞的生長能力。成熟DC如上文所述用PSI處理。洗滌后，混合每種DC獲得不同組合物僅用溶媒處理的DC(○)、1/4數(shù)目PSI處理的DC與3/4數(shù)目溶媒處理的DC混合(●)、1/8數(shù)目PSI處理的DC與7/8溶媒處理的DC混合(■)、或僅包含用PSI處理的DC(▲)。每種混合物以逐級增加的數(shù)目與105異種淋巴細胞接種到96孔板中。第6天使用3H-TdR攝入測定確定增殖。
圖6.與用PSI處理或未經(jīng)處理的DC預(yù)培養(yǎng)的異種淋巴細胞的反應(yīng)削弱。淋巴細胞與1/10數(shù)目的PSI處理(●，▲)或未經(jīng)處理DC(○，△)共培養(yǎng)。2天后，通過CD83、CD86包被的平板除去每種DC。使用溶媒處理的DC(○，●)或PSI(1μM)處理的DC(△，▲)再培養(yǎng)淋巴細胞4天。使用3H-TdR攝入測定確定增殖。(每一點代表三個單獨實驗的平均值+/-SEM)。
圖7.PSI預(yù)處理的DC降低表面抗原在異種淋巴細胞上的表達。使用溶媒處理的DC(綠線)或PSI(1μM)處理的DC(紅線)，在與異種MLR實驗相同的條件下培養(yǎng)淋巴細胞6天。用MoAb、CD3、CD25(PE綴合的；Pharmingen)、CD54(PE綴合的；Serotec)、CD50(FITC綴合的；Serotec)測定每種淋巴細胞的表型，并通過FACScan分析每種淋巴細胞。
圖8.與溶媒處理或PSI處理的DC共培養(yǎng)的異種淋巴細胞的細胞因子產(chǎn)生。成熟DC如上文所述用溶媒或PSI(1μM)處理。將異種淋巴細胞和每種DC以每孔2×105細胞接種到96孔板上，并用PMA(10nM)處理或不刺激達49小時。通過ELISA分析上清中的IL-2、IL-4和γ干擾素。
圖9.用溶媒或PSI處理的DC的細胞因子產(chǎn)生。成熟DC如上所述用溶媒或PSI(1μM)處理。將每種DC和異種淋巴細胞以每孔2×105細胞接種到96孔板上，并用PMA(10nM)刺激或不刺激達48小時。通過ELISA分析上清中的IL-6、IL-8、IL-12和TNFα。
圖10.MEKK-1的表達大大增強單核細胞衍生的樹突細胞在異源MLR中的抗原呈遞。簡要地說，通過用50ng/ml GM-CSF和10mg/mlIL-4培養(yǎng)外周血單核細胞，產(chǎn)生樹突細胞。第5天，所述細胞用不含插入片段的腺病毒或編碼MEKK-1的腺病毒感染2小時(感染復(fù)數(shù)100∶1)，或保持不感染。2天后，用105純化的異源T細胞在96孔平底板中與104樹突細胞一起培養(yǎng)5天，用0.5μCi/孔脈沖處理過夜，第二天收獲細胞。編碼MEKK-1的樹突細胞在誘導(dǎo)T細胞增殖方面比未感染的DC強4倍，而對于感染了未攜帶插入片段的腺病毒的樹突細胞就不是這樣。
圖11.樹突細胞中MyD88顯性失活抑制劑(MyD88lpr)的表達誘導(dǎo)NF-κB激活用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用不含插入片段的對照腺病毒(Ad0)和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88-lpr)感染。使用感染復(fù)數(shù)100。表達6小時和24小時后，裂解細胞，通過EMSA檢查核提取物中的NF-κB DNA結(jié)合活性。驚人的是，MyD88lpr的表達本身就能夠誘導(dǎo)NF-κB激活，這與以前發(fā)現(xiàn)的完全相反。
圖12.顯性失活(抑制劑)而不是野生型MyD88的表達本身誘導(dǎo)TNFα產(chǎn)生，而不抑制樹突細胞中LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生。
用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒(Adβ-gal)、編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)和編碼野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)感染。已經(jīng)顯示Adtoll沒有功能，應(yīng)該忽略。使用感染復(fù)數(shù)100。24小時后，用100ng/mlLPS刺激細胞。驚人的是，在缺少其它刺激的情況下，顯性失活MyD88的表達本身可以誘導(dǎo)樹突細胞產(chǎn)生TNFα。此外，它不能抑制LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生，該發(fā)現(xiàn)與以前的發(fā)現(xiàn)相反。
圖13.野生型MyD88的表達消除MyD88-lpr(顯性失活)誘導(dǎo)的樹突細胞產(chǎn)生TNFα用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒(Adβ-gal)、編碼野生型MyD88的腺病毒(AdMyD88wt)和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88lpr)感染。在某些情況下使用Adlpr與Adβ-gal或AdMyD88wt以1∶1和1∶5比例的雙重感染。單感染使用感染復(fù)數(shù)100。24小時后，取出上清并分析。驚人的是，在缺少其它刺激的情況下，顯性失活MyD88的表達本身可以誘導(dǎo)樹突細胞產(chǎn)生TNFα。野生型Myd88能夠抑制Myd88lpr誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生。
圖14.顯性失活MyD88在樹突細胞中的表達增強抗原特異性T細胞增殖用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用不含插入片段的對照腺病毒(Ad0)、編碼作為原型抗原的綠熒光蛋白的腺病毒(AdGFP)和編碼與顯性失活MyD88連接的GFP的腺病毒(AdGFP-lpr)感染。48小時后，將劑量逐漸增加的樹突細胞與2×104抗原特異性T細胞一起培養(yǎng)，第3天測定增殖。傳遞抗原特異性GFP到樹突細胞誘導(dǎo)抗原特異性T細胞增殖，該作用受到顯性失活MyD88的表達的增強。這與我們的抑制樹突細胞中的MyD88活性誘導(dǎo)樹突細胞激活的出乎意料的結(jié)果一致。
圖15.在樹突細胞中表達顯性失活MyD88增強異源混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用不含插入片段的對照腺病毒(Ad0)和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。48小時后，將劑量逐漸增加的樹突細胞與1×105異源T細胞一起培養(yǎng)，第6天測定增殖。顯性失活MyD88的表達增強異源T細胞增殖，該發(fā)現(xiàn)指示DC抗原呈遞增強。
圖16.在樹突細胞中表達顯性失活MyD88增強共同刺激分子(CD80、CD86)的表達用50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)外周血單核細胞5天，產(chǎn)生未成熟DC。然后所述DC或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼GFP的對照腺病毒感染，以及用編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。48小時后，收集樹突細胞并染色檢查CD80和CD86，這是有效抗原呈遞功能所需的兩種非常重要的共同刺激分子。顯性失活形式的MyD88的表達，增強了CD80和CD86的細胞表面表達，這指示樹突細胞抗原呈遞功能增強。
圖17.顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化通過在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，從外周血單核細胞分化出人巨噬細胞。然后所述細胞或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒或編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用如圖顯示的感染復(fù)數(shù)100(或者在一種情況下使用50)。在6小時、24小時和48小時后，裂解細胞，使用蛋白質(zhì)印跡分析和磷酸(phospho)-p38 MAPK特異性抗體測定提取物的p38MAPK活性。未曾預(yù)料到的是，顯性失活MyD88的表達在人巨噬細胞中誘導(dǎo)p38MAPK活性。
圖18.顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達誘導(dǎo)IRAK磷酸化通過在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，從外周血單核細胞分化出人巨噬細胞。也使用在5％FCS DMEM中培養(yǎng)的HELA細胞。這兩種細胞類型或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒、編碼野生型MyD88的腺病毒和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(AdMyD88lpr)感染。使用感染復(fù)數(shù)100。在5分鐘或12小時后，裂解細胞，使用蛋白質(zhì)印跡分析測定提取物中的IRAK和磷酸-IRAK。在HELA細胞中，發(fā)現(xiàn)顯性失活MyD88(MyD88-lpr)的表達抑制IL-1誘導(dǎo)的IRAK激活。然而，未曾預(yù)料到的是，顯性失活MyD88表達誘導(dǎo)人巨噬細胞中不因加入LPS而增加的IRAK活性。該發(fā)現(xiàn)提示MyD88活性也是巨噬細胞(而不是HELA細胞)中抑制IRAK磷酸化的抑制信號所需的，它的阻斷導(dǎo)致IRAK激活。
圖19.顯性失活MyD88在巨噬細胞中的表達誘導(dǎo)IκBα磷酸化通過在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，從外周血單核細胞分化出人巨噬細胞。所述細胞在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒或編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用感染復(fù)數(shù)100。24小時后，裂解細胞，使用蛋白質(zhì)印跡測定磷酸-IκBα。未曾預(yù)料到的是，顯性失活MyD88的表達在人巨噬細胞中誘導(dǎo)IκBα磷酸化。
圖20.在缺乏任何刺激的情況下，顯性失活MyD88而不是野生型MyD88在巨噬細胞中的表達誘導(dǎo)TNFα、IL-6和IL-8產(chǎn)生。
通過在5％FCS RPMI中加入100ng/ml M-CSF 2-3天，從外周血單核細胞分化出人巨噬細胞。然后所述細胞或者保持不感染，或者在無血清培養(yǎng)基中用編碼β-gal的對照腺病毒、編碼野生型MyD88的腺病毒和編碼顯性失活MyD88的腺病毒(Adlpr)感染。使用感染復(fù)數(shù)100。(a)48小時后，收集上清，測定在缺乏任何其它刺激的情況下TNFα、IL-6和IL-8細胞因子的產(chǎn)生。在編碼顯性失活MyD88的細胞中可以檢測到細胞因子產(chǎn)生，而在編碼野生型MyD88的細胞或?qū)φ占毎袡z測不到細胞因子產(chǎn)生。這提示在巨噬細胞中阻斷MyD88活性導(dǎo)致細胞激活和釋放炎性細胞因子，這與在樹突細胞中一樣，而與HSF或HUVEC不同。(b)在表達0小時、4小時、24小時和48小時，收集上清，通過ELISA測定TNF、IL-6和IL-8。僅顯示了得自編碼顯性失活MyD88(MyD88-lpr)的細胞的結(jié)果，因為對照細胞或編碼野生型MyD88的細胞有本底水平的細胞因子表達。
具體實施例方式
材料和方法1.試劑人重組GM-CSF和TNFα分別由Glenn Larsen博士(GI)和D Tracey博士(BASF)饋贈。人重組IL-4購自R&D System(Minneapolis，USA)。PMA、LPS和離子霉素得自Sigma Chemical Co.(St Louis，USA)。蛋白體抑制劑Cbz-Ile-Glu(O-叔丁基-Ala-ceremal(PSI)得自Calbiochem(Nottingham，UK)。M-CSF得自Genetics Institute(Boston，USA)。
2.制備外周血單核細胞對得自健康志愿者(North London Blood Trahsfusion Service，Colindale，UK)的白細胞提取(leukopheresis)殘余物進行密度離心，獲得外周血單核細胞(PBMC)。肝素化殘余物用HBSS稀釋2倍，取25ml小心地覆蓋在50ml無菌管中的等體積Ficoll-Hypaque lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)上，然后室溫下于2000rpm離心30分鐘。離心后，收集分界層，用HBSS洗兩次(在2000rpm離心10分鐘)。然后收集PBMC并將其重懸浮于30ml含5％FCS的RPMI。
3.分離外周血T細胞和單核細胞以及培養(yǎng)HeLa細胞將PBMC在Beckman JE6淘析器中進行細胞分離后，獲得外周血T細胞和單核細胞。在含1％FCS的RPMI(淘析培養(yǎng)基)中進行淘析。使用抗CD45、CD3、CD14和CD19的熒光染料綴合抗人單克隆抗體(Becton Dickinson，Oxford，UK)通過流式細胞術(shù)，評價淋巴細胞和單核細胞的純度。T淋巴細胞部分通常包含約80％表達CD3的細胞、約6％表達CD19的細胞和＜1％表達CD14的細胞。單核細胞部分通常包括＞85％表達CD14的細胞、＜0.5％表達CD19的細胞和＜3％表達CD3的細胞。HeLa細胞維持在5％FCS，1％青霉素/鏈霉素DMEM中。
4.用M-CSF使單核細胞分化以進行腺病毒感染為優(yōu)化腺病毒感染，將新鮮淘析的單核細胞以1×106細胞/ml在含100ng/ml M-CSF(Genetics Institute，Boston，USA)的10cm培養(yǎng)皿(Falcon，UK)中培養(yǎng)。2-3天后，用PBS洗滌，除去未貼壁的細胞，余下的貼壁單核細胞用10ml細胞解離溶液(Sigma，UK)在37℃孵育1小時。所述細胞懸浮液在含5％FCS的RPMI中洗兩次，通過錐蟲藍排除評價細胞生存力(90％)。根據(jù)FACS染色，該階段的細胞99％是CD14陽性，所述細胞以1×106細胞/ml在24孔或48孔平底組織培養(yǎng)板(Falcon，UK)中培養(yǎng)以進行進一步的實驗。
5.使單核細胞分化為樹突細胞將新鮮淘析的單核細胞以1×106細胞/ml在10cm培養(yǎng)皿(Falcon，UK)中培養(yǎng)5-6天，培養(yǎng)基為補充了50ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的5％FCS RPMI。在第3天，補充細胞因子。與直接從血或骨髓前體分化出樹突細胞相比，本方法有幾個好處。除容易和產(chǎn)生大量細胞外，該方法產(chǎn)生具有穩(wěn)定“未成熟DC”表型的均一細胞群體。通過在所述DC中加入TNFα(10ng/ml)、LPS(100ng/ml)或單核細胞條件培養(yǎng)基(50％體積比)再培養(yǎng)2-3天，促進該表型至成熟。
6.單核細胞條件培養(yǎng)基臨用前通過加入5ml人γ球蛋白(10mg/ml，Sigma Chemical Co.)10分鐘，制備Ig包被的平板(100mm，F(xiàn)alcon)。平板使用前用RPMI 1640培養(yǎng)基(無血清)洗三次。經(jīng)淘析的單核細胞(3×107)以7ml的體積覆蓋所述Ig包被的平板1小時。洗去未貼壁的細胞，用新鮮完全RPMI培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)γ球蛋白粘附的細胞24小時。
7.腺病毒載體和它們的繁殖A.Byres博士和M.Wood博士(Oxford University，UK)提供編碼大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(Adβ-gal)或沒有插入片段(Ad0)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體。通過AdTrack與B.Vogelstein教授(The HowardHuges Medical Institute，Baltimore，MD)提供的AdEasy-1腺病毒質(zhì)粒雙重重組，產(chǎn)生表達GFP的腺病毒(AdGFP)。從Xu博士(University ofTexas，Southwestern)和K.Burns博士(Lausanne，Switzerland)提供的質(zhì)粒產(chǎn)生AdMyD88wt和AdMyD88lpr。具體地說，使用pAdTrackCMV產(chǎn)生AdMEKK-1wt，而使用名為AdTrack.CMVKS17的pAdTrack.CMV載體衍生物產(chǎn)生AdMyD88wt和AdMyD88lpr。如下構(gòu)建pAdTrack.CMVKS17除去AdTrack.CMV的EcoRI位點及其多克隆位點(MCS)，并插入載體pBCSK(+)(Stratagene)的更大的多克隆位點。在通過熱休克方法用1μg線性化pAdTrack.CMV-MEKK1wt、AdTrack.CMVKS17-MyD88wt或AdTrack.CMVKS17-My88lpr構(gòu)建物和100ng復(fù)制缺陷型腺病毒載體pAdEasy-1轉(zhuǎn)化的BJ5183細菌細胞中產(chǎn)生重組病毒。通過卡那霉素抗性選擇陽性重組克隆。選擇后，使用提取的DNA在293人胚腎細胞中進行病毒繁殖。通過兩個氯化銫梯度起速離心純化病毒；如He等(He T.C.等(1998).Science 2811509-12)所述。如下在HEK 293細胞中通過噬菌斑測定確定病毒貯液的滴度在無血清DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)中暴露1小時，隨后用(1.5％)瓊脂/(含4％FCS的2xDMEM)混合物(體積比1∶1)覆蓋，培養(yǎng)10-14天。(HeT.C.等(1998).Science 2811509-12)。
9.腺病毒感染細胞收集M-CSF分化的巨噬細胞和未成熟或成熟的樹突細胞，計數(shù)并重新接種。然后所述細胞在無血清RPMI中用過量表達目的基因的復(fù)制缺陷型腺病毒感染。對于巨噬細胞和未成熟DC使用感染復(fù)數(shù)100，對于成熟DC使用感染復(fù)數(shù)300。2小時后，除去病毒，將細胞在完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1-2天以過量表達目的基因。然后所述細胞用于其它實驗。
10.建立抗原特異性T細胞系綠熒光蛋白購自Clontech。為建立抗原特異性多克隆T細胞系，將1×106PBMC/ml與抗原(使用綠熒光蛋白時是1μg/ml，使用破傷風類毒素時是5μg/ml)培養(yǎng)7天，然后用20ng/ml IL-2再培養(yǎng)10-14天。每4天補充IL-2。這導(dǎo)致PBMC中抗原特異性T細胞的擴充和大多數(shù)其它細胞群體的細胞死亡。培養(yǎng)17-21天后，進行再刺激步驟將所述T細胞與照射處理的自體PBMC以1∶1的比例在存在新鮮抗原、缺乏IL-2的情況下培養(yǎng)。4天后，加入IL-2，再培養(yǎng)10-14天。該再刺激步驟重復(fù)至少4次，然后應(yīng)用抗原特異性T細胞于其它實驗。
11.抗原特異性T細胞的增殖測定為評價抗原特異性T細胞系的特異性，將1×105抗原特異性T細胞與1×105照射處理的自體PBMC和各種濃度的抗原在96孔平底微量滴定板中培養(yǎng)。3天后，細胞用[3H]胸苷脈沖處理過夜，第二天收獲細胞。
為測量樹突細胞誘導(dǎo)的抗原特異性T細胞增殖，將1×105抗原特異性T細胞與劑量逐級變化的照射處理過或絲裂霉素處理過的樹突細胞一起培養(yǎng)，所述處理過的樹突細胞未經(jīng)脈沖處理過、用抗原脈沖處理、未感染或用腺病毒感染。2天后測量[3H]胸苷摻入。所有抗原特異性增殖測定都一式三份進行。
12.混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)為測定未照射處理或照射處理過(137Cs源，3000rad)的DC的免疫刺激能力，將未感染、腺病毒感染、LPS處理或單核細胞條件培養(yǎng)基處理的DC以逐級增加的劑量與1×105異源淘析的T細胞在96孔平板微量滴定板(Falcon)中培養(yǎng)，一式四份。第5天用[3H]胸苷(0.5μCi/孔；Amersham Life Science，UK)脈沖處理16小時后，通過胸苷摻入測定增殖。
13.細胞因子分析細胞用溶媒或1μM PSI預(yù)處理4小時，或用腺病毒載體感染2小時。然后PSSI處理的DC直接用于下面實驗，而感染的細胞再培養(yǎng)2天，使得過量表達所述相關(guān)蛋白。刺激所述細胞后24小時，收集培養(yǎng)物上清并凍存。用針對TNFα、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12和IFNγ的特異性單克隆抗體和多克隆抗體，通過標準2層或3層夾心ELISA技術(shù)測定細胞培養(yǎng)物上清中的細胞因子水平。這些測試所用的抗體對和標準購自Pharmingen，只有IL-12試劑由Genetics Institute(Boston，USA)饋贈。
14.免疫熒光染色和流式細胞術(shù)分析為進行FACS染色，首先收獲細胞。對于需要保持表面受體完整的貼壁細胞，在37℃使用溫熱的2％EDTA的PBS溶液20分鐘。細胞處于溶液中后，洗滌細胞一次，然后重懸浮于冰冷的FACS洗滌緩沖液。所有隨后的孵育均在4℃下進行。為進行每項分析，5×105細胞與相關(guān)抗原特異性抗體或同種型對照一起孵育30分鐘，然后用FACS洗滌緩沖液洗滌兩次。然后通過流式細胞術(shù)檢查細胞。使用CellQuest(Becton Dickinson)準備細胞以在FACScan流式細胞儀(Becton and Dickinson)上進行分析。直接綴合于HLA-DR、HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD80、CD86、CD3、CD14和CD25的單克隆抗體購自Pharmingen，San Diego，USA。
15.制備胞質(zhì)蛋白提取物制備胞質(zhì)提取物，通過蛋白質(zhì)印跡研究涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物化學事件。將貼壁細胞從組織培養(yǎng)板/瓶刮到新鮮PBS中，離心收獲(在4℃ 13000g 10秒鐘)。相似地通過離心沉淀未貼壁的細胞并用新鮮PBS洗一次。棄去上清后，根據(jù)需要裂解的細胞數(shù)，加入適量的冰冷的低滲裂解緩沖液(Whiteside S.T.等(1992).Nucleic Acids Res 201531-8)(每1×106細胞50-100μl)。裂解液在冰上孵育10分鐘后，離心(13000g，5分鐘，4℃)以除去核和細胞碎片。將澄清的裂解液轉(zhuǎn)移到新鮮試管，凍存于-20℃，用于隨后估計蛋白濃度以及在蛋白質(zhì)印跡中使用。
16.制備核蛋白提取物制備核蛋白提取物以研究NF-κB激活和從胞質(zhì)到核的轉(zhuǎn)運以及其DNA結(jié)合活性。在低滲裂解緩沖液中裂解細胞(參見上節(jié))后，離心(13000g，5分鐘，4℃)沉淀核，所述核在低滲裂解緩沖液中洗一次，除去污染的胞質(zhì)蛋白，然后4℃攪拌下重懸浮于高滲提取緩沖液1-2小時。低滲裂解緩沖液防止裂解時蛋白從核中濾出，而高滲提取緩沖液使核膜能滲透，使核蛋白能夠進入溶液內(nèi)。離心(13000g，10分鐘，4℃)后，將包含核蛋白的上清轉(zhuǎn)移到新鮮試管中，保存于-70℃。該制備核提取物的方法是基于Whiteside S.T.等(1992).Nucleic Acids Res 201531-8的方法。
17.免疫沉淀為免疫沉淀IRAK，將胞質(zhì)提取物與3μg抗IRAK抗體在溫和振搖下于4℃溫育1小時。然后加入50μl 50％漿液蛋白G瓊脂糖(Amersham)，再振搖2小時。隨后收集結(jié)合蛋白G瓊脂糖的IRAK，洗滌四次，重懸浮于蛋白質(zhì)印跡加樣緩沖液中，煮沸5分鐘，然后立即用于蛋白質(zhì)印跡。
18.蛋白濃度測定在使用胞質(zhì)提取物或核提取物于任何其它實驗性程序(如蛋白質(zhì)印跡、電泳遷移率變動分析)前，有必要測定它們的蛋白濃度以保證每份樣品中存在等量蛋白。通過Bradford測定評估蛋白濃度。簡要地說，將20μl合適稀釋的提取物加入96孔組織培養(yǎng)板中，一式三份，另外板上還加入20μl用作標準的一系列濃度范圍為10-1000μg/ml的BSA(Sigma，UK)。然后在每個孔中加入200μl Bradford試劑，用分光光度計(Multiscan Bichromatic，Labsystems)在595nm測定吸光度。根據(jù)BSA濃度范圍形成的線性標準曲線，測定胞質(zhì)提取物和核提取物中的蛋白量。
19.蛋白質(zhì)印跡分析和電泳遷移率變動分析通過SDS-PAGE在10％(w/v)聚丙烯酰胺凝膠上分離胞質(zhì)蛋白，然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用分別購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，USA)和Upstate Biotechnology(USA)的抗體測定IκBα和IRAK，使用從New England Biolabs獲得的抗體檢測磷酸化形式的IκBα、p38和p42/44 MAPK。
結(jié)果1.PSI抑制DC的免疫刺激功能PSI是一種蛋白體活性抑制劑，同樣能夠抑制誘導(dǎo)的IκB降解和隨后的NF-κB激活。我們使用PSI來檢查NF-κB在樹突細胞(DC)活性中的功能，尤其是在與抗原呈遞和T細胞激活有關(guān)的活性中的功能。我們以前已經(jīng)表明PSI能夠在濃度達到1μM時抑制NF-κB激活。為測試PSI對DC生存力的影響，用濃度范圍從0.1μM到5μM的PSI孵育成熟DC。根據(jù)碘化丙錠(PI)染色方法判斷，＞5μM的濃度顯示出某些毒性(圖1)，因此功能性研究僅在0.1到2μM的范圍內(nèi)進行，在大多數(shù)實驗中使用1μM。為評價NFκB在DC功能中的作用，用0.3μM、0.5μM或1μM PSI孵育成熟DC 3小時，然后洗滌細胞。由于PSI是不可逆結(jié)合蛋白體的已激活肽，因此可以在MLR的6天時間內(nèi)評價DC的功能，而不受短時間藥物暴露的影響。
在異源MLR測定中T細胞暴露于PSI處理的DC(PSI-DC)對于淋巴細胞的應(yīng)答有深刻影響，該影響可隨PSI濃度逐漸增強(titrabale)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當用0.1μM PSI預(yù)處理DC時沒有可檢測的效應(yīng)，而0.5μM和1μM導(dǎo)致T細胞不能應(yīng)答激活而增殖(圖2)。
2.PSI減少涉及抗原呈遞的分子在表面表達在MLR中T細胞識別II類HLA抗原，其中HLA-DR是最豐富的，因此在PSI處理后6天評價其表達。在0.1μM PSI觀察到對DR的最小效應(yīng)(通過FACS)，而在1μM觀察到大的降低(圖3)。CD86是在DC上表達的主要共同刺激分子，其表達也減少，在1μM PSI時基本上降低到背景的水平(圖3)。
3.IL-2抗體或抗CD28抗體不可拯救用PSI處理的樹突細胞抑制的MLR。
關(guān)于T細胞對PSI-DC增殖性應(yīng)答低的機制有兩類大的可能性。第一類可能性是這些DC不是刺激性的，因此所述T細胞沒有作出反應(yīng)。第二類可能性是所述T細胞已經(jīng)被耐受或主動免疫調(diào)節(jié)過程主動“關(guān)閉”。為區(qū)別這些可能性，我們嘗試用IL-2或抗CD28以濃度(2ng/ml IL-2或10μg/ml抗CD28)刺激所述T細胞。
在接種T細胞和DC的同時加入IL-2或抗CD28。在第6天評價增殖，揭示IL-2對于恢復(fù)增殖的效應(yīng)非常輕微，然而該結(jié)果不依賴于DC的數(shù)目并且與PSI處理無關(guān)(圖4a)。
對于未經(jīng)處理的DC觀察到同樣程度的免疫刺激(圖4b)?？笴D28沒有恢復(fù)性效應(yīng)，而考慮到PSI對主要CD28配體CD86的下調(diào)節(jié)作用，這也是已經(jīng)預(yù)料到的。這些結(jié)果與多種機制一致，因此進行其它實驗。
4.用PSI預(yù)處理的DC抑制DC誘導(dǎo)的MLR一種檢測PSI-DC是否產(chǎn)生抑制效應(yīng)的方法是將PSI處理的DC和未經(jīng)處理DC的混合物與T細胞一起培養(yǎng)。假如PSI-DC僅僅是沒有刺激性的，那么PSI處理的DC對于增殖反應(yīng)的效應(yīng)應(yīng)該最小。然而，根據(jù)增殖反應(yīng)曲線的斜率判斷，發(fā)現(xiàn)低至1/8或1/4 PSI-IDC的存在導(dǎo)致反應(yīng)降低至1/3-1/5(圖5)。隨后我們研究暴露于PSI-DC是否會誘導(dǎo)T細胞長期無應(yīng)答性。T細胞如以前所述暴露于正常DC或PSI-DC，然后收集T細胞，用DC處理所述T細胞第二次，并測量增殖性反應(yīng)(圖6)。暴露于正常DC的T細胞在兩個事件中都反應(yīng)，而如預(yù)期的，T細胞對兩輪PSI-DC都不反應(yīng)。然而，在用正常DC刺激前已經(jīng)用PSI-DC刺激的T細胞也不能反應(yīng)(圖6)。這指出暴露于PSI-DC的效應(yīng)是持續(xù)的，并且所述T細胞達到了無應(yīng)答性或無反應(yīng)性狀態(tài)。如預(yù)期的，在暴露于正常DC后第二輪暴露于PSI-DC的T細胞無法增殖。
5.暴露于PSI處理的樹突細胞的T淋巴細胞的細胞表面抗原分析為研究PSI處理的DC的效應(yīng)機制，我們在培養(yǎng)6天后分析T淋巴細胞。如預(yù)期的，T細胞產(chǎn)量更低。CD3的細胞表面表達降低。然而，最具戲劇性的，是CD25表達顯著減少，與對照相比事實上被消除(圖7)。
分析涉及細胞表面粘附的分子的表達，例如CD11a(LFA-1)以及其一種受體ICAM-1CD54的表達。這兩種分子的表達在PSI處理的淋巴細胞上都減少，CD54的表達降低到類似于CD3的程度，而CD11a的表達僅稍稍降低(圖7)。
6.T細胞暴露于PSI-DC導(dǎo)致產(chǎn)生IL-4，而不產(chǎn)生IL-2或IFNγ產(chǎn)生細胞因子是T細胞對DC刺激的關(guān)鍵應(yīng)答之一，其中表達IL-2、IFNγ和IL-4(圖8)。因此我們研究暴露于PSI-DC所發(fā)生的應(yīng)答類型。在對PSI-DC應(yīng)答時并未產(chǎn)生IL-2和關(guān)鍵的Th1細胞因子IFNγ。然而，IL-4的產(chǎn)生不受影響。該數(shù)據(jù)提示PSI-DC能夠傳遞一些信號到T細胞。這支持我們前面的觀察，即PSI-DC誘導(dǎo)T細胞中一種類型的無應(yīng)答性狀態(tài)，據(jù)信該類型需要一種活性信號。
7.PSI抑制DC產(chǎn)生TNF而不抑制產(chǎn)生IL-8我們還研究了PSI對DC在隨后的MIR中產(chǎn)生細胞因子的影響。在MIR期間，TNF和IL-6表達受到PSI-DC的抑制，而IL-6受到抑制的程度較低。與此不同，IL-8表達不受影響(圖9)。類似于在T細胞上的結(jié)果，該結(jié)果顯示PSI處理的鑒別性質(zhì)，并指出NFκB在TNF和IL-6表達中有作用，而在IL-8表達中沒有作用。
8.用MEKK1激活DC導(dǎo)致MLR反應(yīng)增強。
由于對NFκB的抑制抑制了DC功能，因此研究使用刺激NFκB的MEKK可能激活DC的效應(yīng)。用編碼MEKK1的腺病毒(activatingencoding MEKK1)以感染復(fù)數(shù)150∶1感染DC。當在MLR中使用時，這樣的MEKK1 DC的活性比正常DC強4倍(圖10)。
9.Myd88lpr激活NF-κB我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種NF-κB的有效誘導(dǎo)劑是名為Myd88lpr的Myd88的突變蛋白，所述突變蛋白包含頭53個氨基酸的缺失和一個點突變Phe56Asn。Myd88lpr通常抑制Toll相關(guān)受體信號傳遞，例如IL-1受體(1)。然而，我們觀察到通過腺病毒載體將Myd88lpr引入未成熟DC，誘導(dǎo)核NF-κB活性的有效激活，該激活在用Admyd88感染后6小時可檢測到，在感染時24小后更強烈(圖11)。
10.Myd88lpr誘導(dǎo)未成熟DC產(chǎn)生TNF至于MEKK1，我們希望研究Myd88lpr是否也激活DC功能。用AdMyd88lpr感染未成熟DC，導(dǎo)致感染后24小時所述細胞自發(fā)產(chǎn)生TNF。此外，Myd88lpr對于LPS誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生沒有抑制效應(yīng)。Myd88wt并不在DC中誘導(dǎo)TNF產(chǎn)生(圖12)。
11.Myd88lpr增強DC的抗原呈遞由于對NF-κB的抑制抑制了DC功能，因此研究使用刺激NF-κB的Myd88lpr有效激活DC的效應(yīng)。用AdMyd88lpr(也表達GFP)、Ad0或AdGFP(綠熒光蛋白)感染未成熟DC。24小時后，用2×104GFP抗原特異性T細胞與各種濃度的受感染DC一起培養(yǎng)，在三天時測量作為T細胞增殖的反應(yīng)。傳遞GFP到樹突細胞誘導(dǎo)抗原特異性T細胞增殖，Myd88lpr增強該增殖(圖14)。該結(jié)果與以前述圖(圖11和12)中所示的Myd88lpr激活NF-κB和TNT產(chǎn)生的結(jié)果一致。
12.Myd88lpr也增強DC誘導(dǎo)的異源混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)NF-κB活性作用于DC的效應(yīng)的另一項測試是研究MLR反應(yīng)。用Ad0和Admyd88lpr感染未成熟DC，48小時后，將劑量逐級增加的感染DC與105異源T細胞一起培養(yǎng)，培養(yǎng)六天后測量表現(xiàn)為增殖的反應(yīng)。用AdMyd88lpr感染比用Ad0感染或未感染細胞有更強的MLR反應(yīng)。這一點在DC數(shù)目較低時最為顯著，其中對照的反應(yīng)僅相當于僅有T細胞的反應(yīng)，其中表達Myd88lpr的DC反應(yīng)更高(圖15)。
13.Myd88lpr表達增強共同刺激分子CD80和CD86的表達細胞表面分子CD80和CD86的表達對于DC的抗原呈遞功能是重要的。在圖16中，我們顯示與未感染的DC或感染對照病毒的細胞相比，Myd88lpr在DC中的表達(通過腺病毒感染)增強CD80和CD86兩者的表達。
14.除NF-κB外，My88lpr也激活其它信號分子我們已經(jīng)顯示Myd88lpr是NF-κB的有效誘導(dǎo)劑。我們也觀察到該分子能夠激活其它信號途徑，這次是在巨噬細胞中，例如p38MAPK，這是一種已知涉及細胞機制例如控制細胞因子表達的激酶(圖17)。此外，Myd88lpr在巨噬細胞中還激活I(lǐng)RAKK1，IRAK1是TLR和IL-1R信號機制的關(guān)鍵成分(圖18)。
參考文獻1.Burns，K.，F(xiàn).Martinon，C.Esslinger，H.Pahl，P.Schneider，J.LBodmer，F(xiàn).Di Marco，L.French和J.Tschopp.1998.一種涉及白細胞介素-1信號的銜接蛋白MyD88.J Biol Chem 273，第20期12203.
討論用蛋白體抑制劑PSI以能夠阻斷NFκB誘導(dǎo)的濃度處理DC，顯示出降低MLR中的增殖性反應(yīng)。這提示NFκB功能涉及在MLR中刺激未接觸過抗原的T細胞。由于PSI的特異性是針對蛋白體的，因此它有可能影響其它轉(zhuǎn)錄因子的功能，雖然這一點未曾在描述該藥物作用的原始出版物中報道(Traenckner等(1994)EMBO J.13，5433-5441；Traenckner和Baeuerle(1995)J.Cell Sci.增刊19，79-84；和Haas等(1988)J.Leukoc.Biol.63，395-404)。需要使用其它方法的其它獨立實驗來證實NFκB的作用，而我們已經(jīng)啟動了使用在CMV啟動子控制下過量表達IκBα的腺病毒感染DC的研究。這種IκBα過量表達抑制NFκB，也抑制樹突細胞的抗原呈遞功能(Yoshimura等，未公開的數(shù)據(jù))，這與本文提出的數(shù)據(jù)一致。
在不同水平上評價了PSI處理的DC降低免疫原性的機制，并且證明是DC中抗原呈遞細胞功能的多個方面受到下調(diào)節(jié)。首先，研究了對于DC用以刺激T細胞的細胞表面分子表達的影響，并且發(fā)現(xiàn)HLA-DR和CD86的表達顯著降低，這兩種分子對于抗原識別和CD28激活都是重要的。還發(fā)現(xiàn)DC產(chǎn)生的細胞因子如IL-12和TNFα減少，這兩種細胞因子已知在早期激活T細胞中是重要的。與此不同，在T細胞/DC共培養(yǎng)物中其它細胞因子如IL-6或IL-8的產(chǎn)生沒有改變。這些結(jié)果指出PSI處理的DC降低了涉及抗原呈遞的所有三大類分子的表達，這三大類分子是T細胞識別靶(HLA-DR)、共同刺激分子(CD86)以及免疫刺激性細胞因子(IL-12和TNFα)。
解決了關(guān)于缺乏T細胞增殖性反應(yīng)的機制的其它問題。這可能僅僅是由于DC缺乏免疫原性，或者可能是由于誘導(dǎo)一種免疫耐受性形式或一種免疫調(diào)節(jié)形式。通過共培養(yǎng)實驗進一步分析了該機制，將PSI處理的DC加入未經(jīng)處理的DC中，分析該混合物在MLR中對未接觸過抗原的T細胞的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)假如將少至1/8(12.5％)的PSI處理的DC加入未經(jīng)處理的DC中，那么在增殖劑量反應(yīng)曲線上將有顯著降低，相當于活性DC的1/3到1/5。該結(jié)果以及IL-2和抗CD28不能刺激這些T細胞的事實(數(shù)據(jù)未顯示)，表明PSI處理的DC對于T細胞功能有抑制(免疫調(diào)制)效應(yīng)。此外，T細胞暴露于PSI處理的DC，誘導(dǎo)T細胞表面標記表達的深刻變化，在共培養(yǎng)第6天分析CD3表達降低，事實上消除了CD25，ICAM-1和LFA-1有一些減少。在多個耐受性模型中已經(jīng)報道了相似的效應(yīng)Zanders等(1983)Nature 303，625-627；Zanders等(1985)J.Immunol.15，302-305；Park等(1997)Eur.J.Immunol.15，302-305；和Waldmann和Cubbold(1998)Ann.Rev.Immunol.16，619-644，因此我們懷疑PSI處理的DC是否誘導(dǎo)免疫耐受性。如下進行評價首先將異源T細胞暴露于PSI處理的DC2天，然后通過用抗CD83和抗CD86淘析，除去所述DC細胞。所述T細胞然后暴露于來自同一供體的正常DC/或PSI處理的DC4天，而它們?nèi)狈Ψ磻?yīng)證明至少已經(jīng)誘導(dǎo)了“長時間持續(xù)的”(4-6天)免疫耐受性。耐受性的正式定義包括“抗原特異性”，這一點無法在該類實驗中正式測試，但在后面使用對可溶性抗原破傷風類毒素應(yīng)答的T細胞系的一系列獨立實驗中證實了這一點(Calder等，數(shù)據(jù)未公開)。然而，本文中的術(shù)語“免疫耐受性”是合適的，因為用來自同一供體的DC進行再次攻擊。
在另一組實驗中，進一步評價了暴露于PSI處理的DC的T細胞的功能。T細胞的細胞因子產(chǎn)生被顯著改變。由此IL-2產(chǎn)生受到的抑制超過90％，IRNγ產(chǎn)生也是如此，這些發(fā)現(xiàn)也與誘導(dǎo)耐受性一致。IL-2和IFNγ是“Th1”細胞因子，令人感興趣的是“Th2”細胞因子IL-4的表達沒有改變。這暗示由PSI處理的DC誘導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)/耐受性誘導(dǎo)局限于Th1亞組(subset)。需要用純化的Th1和Th2T細胞的進一步研究來說明這一點。
本文報道的研究以及使用過量表達內(nèi)源NFκB抑制劑IκBα的腺病毒的其它實驗(Yoshimura等，數(shù)據(jù)未公開)指出NFκB在調(diào)節(jié)抗原呈遞中有重要作用。這與以前的發(fā)現(xiàn)一致，即NFκB對于DC成熟是必不可少的(Rescizno等(1998)J.Exp.Med 188，2175-2180)。這也與下面概念一致NFκB是先天免疫翻譯成適應(yīng)性免疫的主要機制。因此，通過多種微生物因子或其它有害因子激活的、激活免疫系統(tǒng)的所謂“危險信號”(Matzinger(1994)Ann.Rev.Immunol 12，991-1045；Janeway等(1196)Curr.Biol.6，519-522)看起來涉及NFκB的激活。對于需要TLR4去誘導(dǎo)NFκB激活的LPS已經(jīng)確認了這一點(Chow等(1999)J.Biol.Chem.274，10689-10692)。
在抗原呈遞的調(diào)節(jié)中，值得注意的是NFκB協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)所有3個方面，即T細胞靶(MHC)、共同刺激分子(CD86)以及誘導(dǎo)性細胞因子(IL-12、TNFα)的表達。這得出明顯的預(yù)期，即阻斷NFκB的藥物(如PSI)，可能是有用的體內(nèi)免疫抑制劑，顯然這取決于它們的毒性分布型。PSI對于系統(tǒng)性應(yīng)用可能毒性太強，因此不能用于灌注靶器官如腎，以在移植前阻斷APC功能。這項研究一個有趣的推論是有意激活NFκB可能是為疫苗提供有用的輔助效應(yīng)的好策略。測試該假說的實驗正在進行中。
正在進行其它研究，以進一步分析PSI處理的DC影響T細胞功能的準確機制1.阻斷抗原呈遞細胞中的NF-κB抑制T細胞功能，其中使用PSI或其它蛋白體抑制劑如，或者其它NF-κB抑制劑如cDNA抑制劑如IκB、NF-κB組分的反義分子、藥物抑制劑如2.在DC中阻斷NF-κB誘導(dǎo)T細胞中的耐受性3.將NF-κB抑制劑應(yīng)用于)自身免疫)移植)變態(tài)反應(yīng)4.推論-假如NF-κB抑制阻斷抗原呈遞并促進耐受性，那么NF-κB刺激將上調(diào)節(jié)抗原呈遞。這可以通過多種可能的途徑完成，其中激活刺激NF-κB的途徑以增強免疫。這些包括使用腺病毒或MEKK1、NIK、IKK2、MyD88的顯性失活突變體、TRAF2、TRAF6的其它基因轉(zhuǎn)移法。可以將這些序列加入與編碼需要的免疫所針對的抗原的構(gòu)建物相同的遺傳構(gòu)建物中。NF-κB刺激也可用于調(diào)節(jié)變態(tài)反應(yīng)患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)，以改變TH1:TH2反應(yīng)平衡傾向于TH1反應(yīng)。
我們認為，結(jié)果表明PSI在DC中產(chǎn)生無反應(yīng)性狀態(tài)。即所述藥物誘導(dǎo)DC對抗原的長期無應(yīng)答性狀態(tài)。
上面觀察的推論是通過激活DC內(nèi)的細胞內(nèi)信號途徑如NF-κB，人們將能夠激活所述細胞并增強抗原呈遞功能。我們使用激活NF-κB的細胞內(nèi)信號分子MEKK1和Myd88lpr，測試了這一點。先前已經(jīng)描述了MEKK1是多種其它途徑中NF-κB的激活劑，根據(jù)MLR測量，使用腺病毒載體將MEKK1引入DC誘導(dǎo)DC功能的激活。
我們還觀察到，Myd88的一種突變蛋白Myd88lpr(通常是TLR和IL-1受體信號的抑制劑)也在DC中激活NF-κB。當Myd88lpr在DC中表達時，根據(jù)MLR測量、或使用抗原特異性T細胞測量以及誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生測量，Myd88lpr增強DC抗原呈遞功能。這些結(jié)果產(chǎn)生了這樣的可能性當細胞內(nèi)信號分子如NF-κB與抗原結(jié)合時，可以作為強有力的佐劑。這可以提供疫苗設(shè)計的一種新方法。Myd88lpr也激活p38MAPK的事實暗示激活DC的其它信號分子也可用于該目的。
權(quán)利要求
1.NF-κB抑制劑或包含編碼NF-κB抑制劑的核酸的載體在生產(chǎn)藥物方面的應(yīng)用，所述核酸與表達所述核酸所必需的調(diào)節(jié)元件有效連接，所述藥物通過給予哺乳動物從而在哺乳動物體內(nèi)抑制抗原呈遞或誘導(dǎo)無變應(yīng)性反應(yīng)，其中還給予所述哺乳動物一種抗原性分子或編碼一種抗原性分子的多核苷酸。
2.依照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述載體是一種腺病毒或慢病毒。
3.依照任一項前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述抑制劑為IκBα或PSI、或IKK2顯性失活突變體。
4.依照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述抑制劑為有效抗至少一部分NF-κB的反義核酸。
5.依照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述抑制劑為一種抗體或其能夠結(jié)合NF-κB的Fab、(Fab)2或Fv片段，或者為一種編碼所述抗體或其Fab、(Fab)2或Fv片段的cDNA。
6.依照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物包含APC，該APC在體外暴露于所述抑制劑或誘導(dǎo)劑。
7.一種編碼抗原性分子和NF-κB抑制劑的多核苷酸。
8.一種配套組件或組分，其包含(1)一個調(diào)節(jié)部分，其構(gòu)成或編碼一種NF-κB抑制劑，和(2)一個抗原性部分，其構(gòu)成或編碼一種抗原性分子。
9.依照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述抗原性分子包含在轉(zhuǎn)化細胞或癌細胞上或在致病生物上存在的表位，或包含在致病生物感染的細胞上存在的表位，或者包含在早老性癡呆或海綿狀腦病中表達的多肽。
10.依照權(quán)利要求7和8任一項的多核苷酸、配套組件或組分，它們用于醫(yī)藥。
全文摘要
公開了使用NF－κB誘導(dǎo)劑激活免疫應(yīng)答、使用NF－κB抑制劑誘導(dǎo)無反應(yīng)性應(yīng)答、以及通過給予NF－κB激活劑或抑制劑而抑制或激活免疫應(yīng)答。NF－κB抑制劑的例子包括IκBα、PSI、編碼IκBα的核苷酸序列、編碼NF－κB序列(如Rel B)的反義核酸以及抗NF－κB抗體。NF－κB誘導(dǎo)劑的例子包括NIK、MEKK、IKK2、TRRF2和Rel B。還公開了編碼NF－κB誘導(dǎo)劑和抑制劑的載體，例如腺病毒載體。
文檔編號A61P37/04GK1817367SQ20061005152
公開日2006年8月16日 申請日期2000年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
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