專利名稱：金黃色葡萄球菌腸毒素i及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程，涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素I(StaphylococcalEnterotoxin I，SEI)的制備以及用于刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。具體的說(shuō)，就是利用來(lái)源于金黃色葡萄球菌的編碼SEI的基因與一種質(zhì)粒載體重組，并將其轉(zhuǎn)化至合適宿主進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)親和純化獲得高純度的重組SEI蛋白，并利用其超抗原活性應(yīng)用于淋巴細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞抑制，并與作為目前臨床上使用的金葡菌濾液制劑主要有效成分的金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)進(jìn)行活性比較。
背景技術(shù)：
1989年，超抗原的概念由瑞典科學(xué)家White提出，它是一類由細(xì)菌、病毒、寄生蟲產(chǎn)生的對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)大刺激功能的蛋白質(zhì)，由于其對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范圍內(nèi)廣泛研究的一種超抗原。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結(jié)合于抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的抗原結(jié)合溝槽外側(cè)，而后與T細(xì)胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區(qū)結(jié)合，形成SE-MHC-TCR三分子復(fù)合物后大量激活T細(xì)胞。由此激活的T細(xì)胞可直接殺傷表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)不表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生間接的殺傷效應(yīng)。同時(shí)，被SE激活的CD4+T細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用。IL-2等因子亦可激活NK細(xì)胞，使其發(fā)揮自然殺傷作用，IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的MHC-II類分子的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的識(shí)別。因此，經(jīng)SE激活的T細(xì)胞能對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織產(chǎn)生高效的直接或者間接的殺傷作用。如Perabo等人證實(shí)經(jīng)SEB刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)能高效誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株RT112細(xì)胞和RT4細(xì)胞調(diào)亡。Hedlund等人進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，SEA激活T細(xì)胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，注射后1天出現(xiàn)最大效應(yīng)，增殖效應(yīng)維持4天。為提高在腫瘤治療中的靶向性和特異性，人們針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原，制備了多種相關(guān)抗原的單抗-超抗原融合蛋白或?qū)慰古c超抗原偶聯(lián)，大大增強(qiáng)了所激活的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的靶向性，使其能特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，人們還利用腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的受體的配體制備了配體-超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的靶向性。另外，將超抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，將超抗原修飾的腫瘤細(xì)胞作為瘤苗繼而免疫動(dòng)物，亦獲得了令人滿意的抵抗腫瘤細(xì)胞再次攻擊的效果。
在我國(guó)，以金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)為主要有效成分的金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤防化療治療的輔助藥物應(yīng)用于臨床已有近十個(gè)年頭，大量的臨床數(shù)據(jù)證明使用后腫瘤患者的免疫能力獲得了顯著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身狀況均得到了明顯好轉(zhuǎn)。如羅鋒等對(duì)35例淺表轉(zhuǎn)移性腫瘤應(yīng)用金葡菌濾液制劑進(jìn)行局部治療，治療一個(gè)月后總有效率達(dá)82.9％。湯煒等通過(guò)對(duì)早期口腔癌采用局部金葡菌濾液制劑治療及對(duì)晚期口腔癌應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合化療，發(fā)現(xiàn)其可使大量淋巴細(xì)胞及纖維組織聚集在癌巢附近，并能觀察到腫瘤細(xì)胞顯著減少甚至部分病例腫瘤細(xì)胞消失。吳潔等將金葡菌濾液制劑作為化療的輔助藥物應(yīng)用于食管癌治療，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，可明顯升高白細(xì)胞，減輕胃腸道反應(yīng)。
盡管目前以SEC為主要有效成分的金葡菌濾液制劑已取得廣泛的應(yīng)用，但由于制劑中存在著大量的蛋白質(zhì)以及多肽類雜質(zhì)，而主要有效成分腸毒素相對(duì)含量極低，使得一部分腫瘤患者在該制劑臨床使用過(guò)程中出現(xiàn)了一定程度的相似副反應(yīng)。如，李洪等報(bào)道了分別有28％和24％的腫瘤患者在使用金葡菌濾液制劑并聯(lián)合卡鉑治療惡性胸腔積液過(guò)程中出現(xiàn)了發(fā)熱和局部疼痛等副反應(yīng)。劉秀英等在對(duì)鼻咽癌患者使用金葡菌濾液制劑聯(lián)合放療治療的過(guò)程中觀察到的主要副作用為中、低度發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的5％。黎佳全等也報(bào)導(dǎo)了患者在應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合順鉑治療惡性胸水過(guò)程中出現(xiàn)的主要副作用為發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的65.5％。雖然這些副反應(yīng)基本是暫時(shí)性的，癥狀可以自行緩解或者通過(guò)對(duì)癥治療進(jìn)行消除，但仍然對(duì)腫瘤患者的治療和康復(fù)造成了不良的影響。因此，對(duì)于目前金葡菌濾液制劑在臨床應(yīng)用中遇到的問(wèn)題，需要制備高純度的腸毒素并建立嚴(yán)格可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步克服解決，以求減少在使用過(guò)程中產(chǎn)生的毒副作用并增強(qiáng)其腫瘤抑制療效。目前，已經(jīng)有人利用基因工程手段制備金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原，如姜永強(qiáng)等將SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大腸桿菌中經(jīng)熱激誘導(dǎo)獲得表達(dá)，但這些方法中純化步驟均采用了離子交換的方法，存在吸附選擇特異性差等弱點(diǎn)。徐明愷等將SEC2基因克隆至pET-28a中表達(dá)，但表達(dá)的重組產(chǎn)物比天然蛋白增加36個(gè)氨基酸，因此抗原決定簇及產(chǎn)物活性改變的可能性均較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種利用基因工程手段制備獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素I(Staphylococcal Enterotoxin I，SEI)，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本發(fā)明利用其超抗原活性應(yīng)用于體外促脾淋巴細(xì)胞增殖和以及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C(Staphylococcal Enterotoxin C，SEC)進(jìn)行超抗原活性比較。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素I(SEI)的制備方法，本發(fā)明構(gòu)建一種可用于表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素I的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過(guò)重組構(gòu)建而成，質(zhì)粒見(jiàn)說(shuō)明書附圖6。
本發(fā)明方法具體通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)首先設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物SEQ ID NO.35’-caa tca taa ctt agt aaa ggaaat gcc-3’(上游引引物)，SEQ ID NO.45’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’(下游引物)，以金黃色葡萄球菌(FRI 100)基因組為模板，采用PCR擴(kuò)增獲得編碼SEI蛋白的基因片段，利用T-A克隆將其連入至pGEM-T質(zhì)粒載體上的多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建pGEM-T-SEI重組質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序證實(shí)獲得的編碼SEI蛋白的基因片段序列(見(jiàn)SEQ ID NO.2)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列(AY920267)完全一致。
(2)設(shè)計(jì)分別帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的上下游引物SEQ ID NO.55’-gtagga tcccaa ggt gat att ggt gta ggt-3′(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))，SEQ ID NO.65’-ggactc gagtta gtt act atc tac ata tga-3’(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))，以pGEM-T-SEI質(zhì)粒為模板，采用PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)的編碼腸毒素SEI蛋白的基因序列，將該基因片段用相應(yīng)內(nèi)切酶切割后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-1質(zhì)粒相連接，成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI。
(3)將pGEX-4T-1-SEI表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)帶GST標(biāo)簽的GST-SEI融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心并收集上清。將菌體上清液與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，用洗脫液洗脫GST-SEI融合蛋白并收集，將收集到的融合蛋白與凝血酶在合適條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)后的混合物再次與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，分離并收集經(jīng)過(guò)純化的SEI蛋白，取樣電泳檢測(cè)。能特征性地結(jié)合GST的親和填料，優(yōu)選偶聯(lián)有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4Fast Flow。經(jīng)檢測(cè)獲得電泳純的純化產(chǎn)物后，將該純化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)脫鹽、冷凍干燥即得重組SEI凍干粉。
初始獲得的蛋白為帶有GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽的融合蛋白GST-SEI，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組SEI蛋白。
初始獲得的GST-SEI融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素I在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
通過(guò)前面方法制備獲得電泳純的SEI蛋白后，采用MTT法，以有絲分裂原ConA為陽(yáng)性對(duì)照，建立合適的體外模型以觀察重組SEI蛋白對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及受SEI刺激增殖的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。應(yīng)用此模型同時(shí)觀察金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的超抗原活性并與重組SEI蛋白的活性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示重組SEI蛋白具有典型的超抗原活性，并比SEC的作用更強(qiáng)。
本發(fā)明方法的特點(diǎn)是(1)提供了一種高純度的重組SEI蛋白，利用體外小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)該重組蛋白具有典型的超抗原活性，且較SEC更強(qiáng)。該重組蛋白在未被凝血酶切割前帶有GST標(biāo)簽，適合親和純化，經(jīng)凝血酶處理后的該蛋白質(zhì)氨基酸序列及相應(yīng)的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO.1，與相應(yīng)的天然蛋白相比，該重組蛋白在N端增加了2個(gè)氨基酸殘基；(2)提供了一種含有SEI基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合構(gòu)建而成，可轉(zhuǎn)化入合適的表達(dá)宿主，它含有強(qiáng)啟動(dòng)子，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEI融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸構(gòu)建而成的表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，表達(dá)產(chǎn)物帶有GST標(biāo)簽，并使用含有能特異結(jié)合GST的親和填料來(lái)純化該產(chǎn)物；(4)提供了一種工程菌，該菌株含有表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI，在合適的誘導(dǎo)劑作用下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEI融合蛋白。(5)適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開(kāi)發(fā)，用于腫瘤患者臨床康復(fù)與治療。
本發(fā)明方法對(duì)重組SEI進(jìn)行了高效表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度占全菌蛋白的15-25％左右，且為可溶性表達(dá)，便于后續(xù)分離純化。融合蛋白經(jīng)凝血酶高效切割后，所得到的重組蛋白與相應(yīng)的天然蛋白相比，只在N端多出2個(gè)氨基酸。本發(fā)明方法采用親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，具有步驟簡(jiǎn)單，純化速度快的特點(diǎn)，相比從金葡菌培養(yǎng)濾液中分離提取以及利用離子交換層析或分子篩層析等方法能獲得高純度的重組SEI蛋白。體外應(yīng)用該蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，結(jié)果證明該目的蛋白具有典型的超抗原活性。鑒于在臨床獲得應(yīng)用的金葡菌濾液制劑的主要有效成分為SEC，本發(fā)明通過(guò)比較證實(shí)重組SEI蛋白的超抗原活性較SEC更強(qiáng)，因此該重組SEI蛋白有望開(kāi)發(fā)成為一種新的超抗原制劑用于腫瘤患者的臨床康復(fù)和治療。
在本說(shuō)明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行或按照供應(yīng)商所建議的操作說(shuō)明進(jìn)行。


圖1為PCR擴(kuò)增所得編碼SEI基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker，泳道2編碼SEI蛋白基因PCR產(chǎn)物。
圖2為PCR擴(kuò)增后所測(cè)編碼SEI基因序列測(cè)序結(jié)果圖。
圖3為重組pGEM-T-SEI質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker，泳道2重組pGEM-T-SEI質(zhì)粒，泳道三重組pGEM-T-SEI質(zhì)粒Nco I與Pst I雙酶切產(chǎn)物。
圖4為PCR擴(kuò)增所得含酶切位點(diǎn)的編碼SEI蛋白成熟肽基因瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker，泳道2含酶切位點(diǎn)的編碼SEI蛋白成熟肽基因PCR產(chǎn)物。
圖5為重組pGEX-4T-1-SEI質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1核酸Marker，泳道2重組pGEX-4T-1-SEI質(zhì)粒，泳道三重組pGEX-4T-1-SEI質(zhì)粒BamH I與Xho I雙酶切產(chǎn)物。
圖6為重組SEI表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI示意圖，標(biāo)示的“sei”即為編碼SEI蛋白基因序列插入位置。
圖7為重組SEI在BL21(DE3)大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker，泳道2經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白。
圖8為重組SEI純化電泳圖，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker，泳道2純化后的重組SEI蛋白，泳道3純化后的GST-SEI融合蛋白，泳道4Thrombin切割后的GST、SEI混合溶液。
圖9為重組SEI與SEC對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用(48h)，與空白對(duì)照組相比**P＜0.01。
圖10為重組SEI與SEC對(duì)耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的抑制作用(48h)，與空白對(duì)照組相比***P＜0.001。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例提供了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例中所公開(kāi)的技術(shù)表示由本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，這些技術(shù)能有效實(shí)施本發(fā)明。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思的前提下，可以對(duì)這些具體實(shí)施方案進(jìn)行多種改變，仍然能獲得相似的結(jié)果。
實(shí)施例1SEI的基因克隆和pGEM-T-SEI重組質(zhì)粒的構(gòu)建編碼SEI蛋白的全長(zhǎng)基因序列的PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物序列SEQ ID NO.3(上游引物)5’-caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc-3’SEQ ID NO.4(下游引物)5’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’以金黃色葡萄球菌(FRI 100)基因組模板，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得852bp的DNA片段，PCR結(jié)果凝膠電泳圖參見(jiàn)圖1。
PCR體系H2O 60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L)8μLBSA(5mg/mL)10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L) 4μLdNTP(20mmol/L) 2μLTemplate(Genome of FRI 100，10ng/μL) 1μLTaq Polymerase(5U/μL) 1μLPCR程序
1、95℃預(yù)變性3min2、95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步驟2循環(huán)34次4、72℃延伸10min含編碼SEI蛋白的全長(zhǎng)基因序列的pGEM-T-SEI重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增所得的SEI全長(zhǎng)基因克隆入pGEM-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。提取該重組質(zhì)粒，經(jīng)Nco I與Pst I酶切鑒定后送樣測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的編碼SEI蛋白的基因全長(zhǎng)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的編碼相同蛋白質(zhì)的序列(AY920267)完全一致。測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)圖2。pGEM-T-SEI質(zhì)粒酶切鑒定參見(jiàn)圖3。
含內(nèi)切酶位點(diǎn)的編碼SEI成熟肽基因序列的PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物序列SEQ ID NO.5(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))5’-gtagga tcccaaggt gat att ggt gta ggt-3′，SEQ ID NO.6(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))5’-ggactc gagtta gttact atc tac ata tga-3’，以含SEI全長(zhǎng)基因的pGEM-T-SEI重組質(zhì)粒作為模板，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得675bp的DNA片段，PCR結(jié)果參見(jiàn)圖4。
PCR體系H2O 70μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L) 8μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L)4μLdNTP(20mmol/L)2μLTemplate(pGEM-T-SEI) 1μLTaq Polymerase(5U/μL)1μLPCR程序1、95℃預(yù)變性3min2、95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min
3、依步驟2循環(huán)30次4、72℃延伸10min含編碼SEI成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEI重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI和Xho I分別酶切上述步驟中得到的含內(nèi)切酶位點(diǎn)的編碼SEI蛋白成熟肽的基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒。分別回收酶切后的含酶切位點(diǎn)的編碼SEI成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的大片段，并將兩者連接，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)BamH I和Xho I酶切鑒定，結(jié)果表明目的基因片段已插入載體質(zhì)粒，電泳結(jié)果參見(jiàn)圖5。pGEX-4T-1-SEI質(zhì)粒示意圖參見(jiàn)圖6。目的基因在pGEX-4T-1-SEI質(zhì)粒上的詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。
實(shí)施例2重組SEI的表達(dá)SEI表達(dá)菌株的構(gòu)建從含有pGEX-4T-1-SEI重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中提取該質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)抗生素抗性篩選陽(yáng)性克隆，獲得可以大量表達(dá)GST-SEI融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEI的表達(dá)將上述工程菌單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6h，作為種子液。將該種子液以1-5％的接種量接種于含氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h，按0.01％-0.1％的體積比加入0.1mol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h。
實(shí)施例3重組SEI的純化樣品的預(yù)處理經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液4℃10000rpm離心，棄上清收集沉淀。沉淀用原菌液體積的1/10量的PBS重懸，將混懸液置FRENCH細(xì)胞破碎儀中，于700psi下破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎儀繼續(xù)超聲破碎2min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂解液中加入20％的Triton-100至終濃度為1％，充分混勻，冰浴靜置30min。靜置完畢后將菌體裂解液4℃12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在分子量50kD處有較濃的條帶，此即為誘導(dǎo)表達(dá)的GST-SEI融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示該條帶濃度大占總蛋白濃度的15-25％。經(jīng)誘導(dǎo)后菌體裂解液蛋白電泳結(jié)果參見(jiàn)圖7。
GST-SEI融合蛋白的純化取1mL經(jīng)過(guò)預(yù)處理的蛋白溶液，經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后加入至預(yù)平衡的1mL Glutathione Sepharose 4Fast Flow柱中，輕輕混勻，結(jié)合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3次，每次10mL，流盡液體。向柱中加入0.5mL還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。反應(yīng)20min后收集溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度。重復(fù)上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于0.1mg/mL停止收集，結(jié)果顯示各洗脫液組分中蛋白濃度呈正態(tài)分布。將各收集組分用SDS-PAGE檢驗(yàn)純度與濃度，結(jié)果顯示純化得到的GST-SEI融合蛋白為單一條帶，分子量約50kD，電泳結(jié)果參見(jiàn)圖8。
融合蛋白的切割將上述純化得到的GST-SEI融合蛋白收集組分合并，經(jīng)過(guò)脫鹽柱或者用10000截留分子量的透析帶透析，將溶液置換成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶緩沖溶液并同時(shí)去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反應(yīng)24h，取樣電泳，檢測(cè)酶切反應(yīng)程度，酶切結(jié)果見(jiàn)圖8。
重組SEI的純化將反應(yīng)后的蛋白溶液加入至預(yù)平衡的GlutathioneSepharose 4Fast Flow柱子中，輕輕混勻，靜置20min后使液體流盡并收集。SDS-PAGE檢測(cè)溶液中蛋白純度與濃度。結(jié)果顯示融合蛋白的GST標(biāo)簽已去除，在26KD分子量附近有單一條帶，即為純化的SEI蛋白，將純化后的蛋白溶液脫鹽后凍干保存。SEI純化蛋白電泳結(jié)果參見(jiàn)圖8。
實(shí)施例4MTT法測(cè)定重組SEI對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，將其懸浮于含10％小牛血清的RPMIM1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，每孔100μL鋪于96孔板中，設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、空白孔(脾淋巴細(xì)胞+培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+三個(gè)不同濃度梯度的SEI)，每種設(shè)四個(gè)復(fù)孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEI終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于鋪板后44h在待測(cè)孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)法(570nm為測(cè)定波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng))測(cè)定各孔OD570nm-OD630nm值，作圖分析作用腸毒素對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用，并用student t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)分析。
各孔的吸光度與對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照Con A和0.01-1μg/mL SEI在作用48h后ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞均有極顯著增加(P＜0.01，同時(shí)隨著藥物濃度的增加作用效果也更顯著(參見(jiàn)圖9)。按相同實(shí)驗(yàn)方案檢測(cè)SEC對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用，經(jīng)比較，重組SEI對(duì)ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用比SEC更強(qiáng)。
實(shí)施例5MTT法測(cè)定重組腸毒素SEI的體外抑瘤活性設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔(培養(yǎng)基+腫瘤細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞本底釋放孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞)、陽(yáng)性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+四個(gè)不同濃度梯度的SEI)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞)、陽(yáng)性對(duì)照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+Con A)和實(shí)驗(yàn)孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+四個(gè)不同濃度梯度的SEI)]，每種設(shè)三個(gè)復(fù)孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEI終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL和0.001μg/mL，本底釋放孔中5×106個(gè)/mL脾淋巴細(xì)胞以100μL/孔加入，腫瘤作用孔中5×106個(gè)/mL脾淋巴細(xì)胞和2.5×105個(gè)/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的混合懸液以100μL/孔加入到實(shí)驗(yàn)孔中，最后按用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋藥物至要求濃度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混勻。
鋪板后44h在待測(cè)孔中加入15μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)法(570nm為測(cè)定波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng))測(cè)定各孔OD570nm-OD630nm值，僅含培養(yǎng)基的調(diào)零孔調(diào)零。按下式計(jì)算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴細(xì)胞本底釋放孔)/腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔]×100，作圖分析腸毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，并用student t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)分析。
MTT法測(cè)定SEI體外抑瘤活性實(shí)驗(yàn)(各三只小鼠)，SEI以K562-AD作靶細(xì)胞，與不加藥的抑瘤空白對(duì)照孔相比，陽(yáng)性對(duì)照Con A和0.001-1mg/L的腸毒素I在作用48h后抑瘤率均有極顯著的增高(P＜0.001)，同時(shí)隨著藥物濃度的增加作用效果也更顯著(參見(jiàn)圖10)。按相同實(shí)驗(yàn)方案檢測(cè)SEC對(duì)K562-AD細(xì)胞的抑制作用，經(jīng)比較，重組SEI對(duì)K562-AD細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于SEC。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>金黃色葡萄球菌腸毒素I及制備和應(yīng)用<160>6<210>1<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(660)<223>含部分凝血酶酶切位點(diǎn)序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素I<440>1gga tcc caa ggt gat att ggt gta ggt aac tta aga aat ttc tat45Gly Ser Gln Gly Asp Ile Gly Val Gly Asn Leu Arg Asn Phe Tyr1 5 10 15aca aaa cat gat tat ata gat tta aaa ggc gtc aca gat aaa aac90Thr Lys His Asp Tyr Ile Asp Leu Lys Gly Val Thr Asp Lys Asn16 20 25 30cta cct att gca aat caa ctt gaa ttt tca aca ggt acc aat gat135Leu Pro Ile Ala Asn Gln Leu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asn Asp31 35 40 45ttg atc tca gaa tct aat aat tgg gac gaa ata agt aaa ttt aaa180Leu Ile Ser Glu Ser Asn Asn Trp Asp Glu Ile Ser Lys Phe Lys46 50 55 60gga aag aaa ctg gat att ttt ggc att gat tat aat ggt cct tgt225Gly Lys Lys Leu Asp Ile Phe Gly Ile Asp Tyr Asn Gly Pro Cys61 65 70 75aaa tct aaa tac atg tat gga ggg gcc act tta tca gga caa tac270Lys Ser Lys Tyr Met Tyr Gly Gly Ala Thr Leu Ser Gly Gln Tyr76 80 85 90tta aat tct gct aga aaa atc cct att aat ctt tgg gtt aat ggc315Leu Asn Ser Ala Arg Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly91 95 100 105aaa cat aaa aca att tct act gac aaa ata gca act aat aaa aaa360Lys His Lys Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ile Ala Thr Asn Lys Lys106 110 115 120
cta gta aca gct caa gaa att gat gtt aaa tta aga aga tat ctt405Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile Asp Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu121 125 130 135caa gaa gaa tac aat ata tat ggt cat aat aac act ggt aaa ggc450Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly His Asn Asn Thr Gly Lys Gly136 140 145 150aaa gaa tat gga tat aaa tct aaa ttt tat tca ggt ttt aat aat495Lys Glu Tyr Gly Tyr Lys Ser Lys phe Tyr Ser Gly Phe Asn Asn151 155 160 165ggg aaa gtt tta ttt cat tta aat aat gaa aaa tca ttt tca tat540Gly Lys Val Leu Phe His Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Ser Tyr166 170 175 180gat ttg ttt tat aca gga gat gga ctg cct gta agt ttt ttg aaa585Asp Leu Phe Tyr Thr Gly Asp Gly Leu Pro Val Ser Phe Leu Lys181 185 190 195att tat gaa gat aat aaa ata ata gaa tct gaa aaa ttt cat ctt630Ile Tyr Glu Asp Asn Lys Ile Ile Glu Ser Glu Lys Phe His Leu196 200 205 210gat gtc gaa ata tca tat gta gat agt aac660Asp Val Glu Ile Ser Tyr Val Asp Ser Asn211 215 220<210>2<211>654<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(654)<223>克隆所得金黃色葡萄球菌腸毒素I<440>2caa ggt gat att ggt gta ggt aac tta aga aat ttc tat aca aaa45Gln Gly Asp Ile Gly Val Gly Asn Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Lys1 5 10 15cat gat tat ata gat tta aaa ggc gtc aca gat aaa aac cta cct90His Asp Tyr Ile Asp Leu Lys Gly Val Thr Asp Lys Asn Leu Pro16 20 25 30
att gca aat caa ctt gaa ttt tca aca ggt acc aat gat ttg atc135Ile Ala Asn Gln Leu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asn Asp Leu Ile31 35 40 45tca gaa tct aat aat tgg gac gaa ata agt aaa ttt aaa gga aag180Ser Glu Ser Asn Asn Trp Asp Glu Ile Ser Lys Phe Lys Gly Lys46 50 55 60aaa ctg gat att ttt ggc att gat tat aat ggt cct tgt aaa tct225Lys Leu Asp Ile Phe Gly Ile Asp Tyr Asn Gly Pro Cys Lys Ser61 65 70 75aaa tac atg tat gga ggg gcc act tta tca gga caa tac tta aat270Lys Tyr Met Tyr Gly Gly Ala Thr Leu Ser Gly Gln Tyr Leu Asn76 80 85 90tct gct aga aaa atc cct att aat ctt tgg gtt aat ggc aaa cat315Ser Ala Arg Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Lys His91 95 100 105aaa aca att tct act gac aaa ata gca act aat aaa aaa cta gta360Lys Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ile Ala Thr Asn Lys Lys Leu Val106 110 115 120aca gct caa gaa att gat gtt aaa tta aga aga tat ctt caa gaa405Thr Ala Gln Glu Ile Asp Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu121 125 130 135gaa tac aat ata tat ggt cat aat aac act ggt aaa ggc aaa gaa450Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly His Asn Asn Thr Gly Lys Gly Lys Glu136 140 145 150tat gga tat aaa tct aaa ttt tat tca ggt ttt aat aat ggg aaa495Tyr Gly Tyr Lys Ser Lys Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Asn Gly Lys151 155 160 165gtt tta ttt cat tta aat aat gaa aaa tca ttt tca tat gat ttg540Val Leu Phe His Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Ser Tyr Asp Leu166 170 175 180ttt tat aca gga gat gga ctg cct gta agt ttt ttg aaa att tat585Phe Tyr Thr Gly Asp Gly Leu Pro Val Ser Phe Leu Lys Ile Tyr181 185 190 195gaa gat aat aaa ata ata gaa tct gaa aaa ttt cat ctt gat gtc630
Glu Asp Asn Lys Ile Ile Glu Ser Glu Lys Phe His Leu Asp Val196 200 205 210gaa ata tca tat gta gat agt aac654Glu Ile Ser Tyr Val Asp Ser Asn211 215 218<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌腸毒素I基因所用的上游引物<440>3caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增金黃色葡萄球菌腸毒素I基因所用的下游引物<440>4acg tac aca tta gcc cta gag act t<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黃色葡萄球菌腸毒素I基因兩端添加酶切位點(diǎn)所用的上游引物<440>5gta gga tcc caa ggt gat att ggt gta ggt<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>向金黃色葡萄球菌腸毒素I基因兩端添加酶切位點(diǎn)所用的下游引物<440>6gga ctc gag tta gtt act atc tac ata tga
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌腸毒素I，該蛋白為一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素I的制備方法，具體通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)以金黃色葡萄球菌基因組作為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)基因測(cè)序證實(shí)獲得的目的基因片段序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列(AY920267)完全一致，將編碼SEI蛋白的基因序列連入pGEM-T載體；(2)在該基因兩端添加BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)并利用亞克隆技術(shù)構(gòu)建pGEX-4T-1-SEI重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，采用常規(guī)方法IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)”采用常規(guī)方法IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；(3)利用能特異性地結(jié)合GST的親和純化填料純化重組SEI蛋白，電泳鑒定結(jié)果顯示獲得了高純度的重組SEI蛋白；其特征是步驟(1)用于擴(kuò)增編碼腸毒素SEI基因的上下游引物是SEQ ID NO.35’-caa tca taa ctt agt aaa gga aat gcc-3’，SEQ ID NO.45’-acg tac aca tta gcc cta gag act t-3’；步驟(2)用于擴(kuò)增含帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的編碼腸毒素SEI成熟肽基因的上下游引物是SEQ ID NO.55’gtagga tcccaa ggt gat att ggt gtaggt-3′，劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)；SEQ ID NO.65’ggactc gagtta gtt act atctac ata tga-3’，劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)；pGEX-4T-1-SEI重組質(zhì)粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過(guò)重組構(gòu)建而成；步驟(3)適合質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEI原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的宿主，選用大腸桿菌BL21。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素I的制備方法，其特征是初始獲得的蛋白為帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的融合蛋白GST-SEI，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組SEI蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌腸毒素I的制備方法，其特征是初始獲得的GST-SEI融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素I在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌腸毒素I在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用基因工程手段制備獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素I，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。該重組質(zhì)粒由pGEX－4T－1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過(guò)重組構(gòu)建而成。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的高純度的重組SEI蛋白可高效刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，受其刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷作用。與目前作為金葡菌濾液制劑主要有效成分的金黃色葡萄球菌腸毒素C相比，重組SEI蛋白具有更好的超抗原活性，可制備成為一種能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的超抗原制劑，用于腫瘤患者臨床康復(fù)與治療。
文檔編號(hào)A61K39/085GK1900119SQ200610052649
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日
發(fā)明者丁丁, 李丹曦, 潘映秋, 陳樞青 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)