專利名稱：化合物梅花參皂苷Ananaside A及其制備方法和抗腫瘤用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種皂苷類化合物及其制備方法，尤其是從海洋動物梅花參(Thelenota ananas Jaeger)中分離到一種皂苷類化合物及其抗腫瘤的用途。
背景技術：
梅花參(Thelenota ananas J.)，又名“鳳梨參”，為海洋棘皮動物(Echinodermata)海參綱(Holothuriae)刺參科(Stichopodidae)動物，其體形很大，長一般為700mm，寬約100mm，高約80mm，廣泛分布于我國西沙群島和臺灣南端，具有補肝腎，益精，養(yǎng)血的功效。
皂苷是梅花參的主要次生代謝產物之一，是其化學防御的主要物質基礎，具有抗真菌，抗凝血、免疫調節(jié)，細胞毒和抗病毒等各種生物活性。在體外細胞毒活性篩選中，發(fā)現(xiàn)梅花參的乙醇提取物具有強烈誘導稻瘟霉(Pyricularia oryzae)菌絲體變形，最小變形濃度MMDC＝8μg/ml，但迄今為止尚不清楚其主要的有效成分，也未見有關其所含的皂苷類成分的化學結構及抗腫瘤活性的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供化合物梅花參皂苷Ananaside A及其制備方法。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了梅花參皂苷Ananaside A用于抗腫瘤的用途。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為
化合物梅花參皂苷Ananaside A，該化合物為無色結晶性粉末，溶點m.p.210-211℃(MeOH-H2O)，[α]20D-15.6°(c＝0.2，MeOH)，Liebermann-Burchard反應和Molisch反應均呈陽性。由電噴霧質譜信號m/z 1243[M+Na]+和m/z 1197[M-Na]-，高分辨質譜得該化合物精密質量數(shù)為m/z 1243.4800[M+Na]+(Calc.Mass1243.4794)，推算其分子式為C54H85O27SNa。紅外光譜(KBr)cm-1max-3417，強寬峰(羥基)，1761(羰基)，1638(雙鍵)，1223，1071(υs，磺酸基)。1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。
以15％HCl水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯(lián)用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Ananaside A的糖鏈由木糖、奎諾糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為1∶1∶1∶1。
由上述分析得到，梅花參皂苷Ananaside A的化學結構式如下
表1化合物ananaside A的的1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)

Xyl木糖，Qui奎諾糖，Glc葡萄糖，MeGlc3-氧甲基葡萄糖上述梅花參是生長于中國福建海域的梅花參。
本發(fā)明還提供制備梅花參皂苷Ananaside A的方法，具體如下將原料梅花參粉碎，用乙醇作為溶劑進行提取，將提取液濃縮得到浸膏，通過大孔吸附樹脂柱進行層析分離，收集乙醇洗脫部分，濃縮，得到海參總皂苷；將海參總皂苷應用硅膠柱層析，薄層層析檢測，收集含Ananaside A的餾份，濃縮；再經ODS RP-C18反相柱低壓層析進行分離和純化，得到Ananaside A。
上述Ananaside A應用酸水解，脫硫反應，紅外光譜儀，電噴霧質譜儀，高分辨質譜儀，核磁共振氫譜儀，核磁共振碳譜儀，以及多種二維核磁共振譜儀，得到上述海參烷型三萜皂苷化學結構為3-O-{6′-O-磺酸鈉-3′-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃奎諾糖(1→2)-β-D-吡喃木糖}-海參烷--22，25-環(huán)氧-9-烯-3β，12α，17α-三醇。
本發(fā)明對梅花參皂苷Ananaside A進行了體外抗腫瘤試驗，表明其具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗所用細胞株為國際通用的腫瘤細胞株，即A-549(肺癌)MCF-7(乳腺癌)IA-9(卵巢癌)CAKI-1(腎癌)U-87-MG(神經母細胞癌)PC-3(前列腺癌)KB(鼻咽癌)KB-VIN(鼻咽癌)SK-MEL-2(黑色素瘤)HCT-8(腸癌)試驗方法為國際通用的SRB法根據(jù)細胞生長速率，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞以90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長24小時再加藥10μl/孔。每個濃度設三復孔。并設相應濃度的生理鹽水溶媒對照及無細胞調零孔。腫瘤細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細胞，4℃放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標儀520nm波長下測定OD值。試驗結果見表2表2.Ananaside A抗人類腫瘤的療效試驗結果(ED50，μg/ml)

表2的結果表明，Ananaside A對10種不同的腫瘤細胞株均顯示明顯的抑制作用。
本發(fā)明提供了一種新的化合物梅花參皂苷及其制備方法，并發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤作用，因此得到了新的治療腫瘤的藥物或為研制新的抗癌藥物提供了新的先導化合物，也為開發(fā)利用中國的海洋藥用生物資源提供了一條重要途徑。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步說明本發(fā)明。
實施例1將梅花參(干品)10公斤粉碎，于5倍量(重量)的80％乙醇中浸泡7天，得到乙醇提取液，再重復提取3次，合并提取液，減壓回收乙醇后得浸膏；將浸膏混懸于30％乙醇中，以乙醚萃取3～5次，棄乙醚萃取液；下層乙醇液減壓回收乙醇后得浸膏；浸膏溶于蒸餾水中，通過DA201-B大孔吸附樹脂柱，用水和50％乙醇依次洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得梅花參總皂苷提取物；將總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑(下層)洗脫，薄層層析檢測，收集含Ananaside A的餾份，再經ODS RP-C18反相柱層析，以甲醇∶水(55∶45)進行梯度洗脫，薄層層析檢測，得Ananaside A純品。
實施例2將梅花參鮮品10公斤，分別用5倍量(重量)95％、85％、85％的乙醇依次浸泡浸泡7天后提取乙醇提取液并合并，減壓回收乙醇后得流浸膏；將流浸膏溶于3倍量的水中，過濾，濾液通過DA201-B大孔吸附樹脂柱，依次用水和50％乙醇洗脫；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，得到梅花參總皂苷；將總皂苷進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑(下層)洗脫，薄層層析檢測，收集含Ananaside A的餾份，再經ODS RP-C18反相柱層析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)進行梯度洗脫，薄層層析檢測，得Ananaside A純品。
權利要求
1.一種化合物梅花參皂苷Ananaside A，其特征在于具有如下化學結構
2.權利要求1所述的化合物梅花參皂苷Ananaside A的制備方法，其特征在于步驟如下(1)提取將原料梅花參粉碎，用乙醇作為溶劑進行提取，將提取液濃縮得到浸膏，通過大孔吸附樹脂柱進行層析分離，收集乙醇洗脫部分，濃縮得到海參總皂苷；(2)分離將上述海參總皂苷應用硅膠柱層析，薄層層析檢測，收集含Ananaside A的餾份，濃縮；再經ODS RP-C18反相柱低壓層析進行分離和純化，得到Ananaside A。
3.如權利要求2所述的化合物梅花參皂苷Ananaside A的制備方法，其特征在于(1)提取浸泡時乙醇濃度為85～95％、用量為梅花參的5倍量(重量)，冷浸提取7天，重復提取2～4次；大孔樹脂柱層析時，將浸膏混懸于水中，依次用水和50％乙醇洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇；(2)分離∶薄層層析以氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶劑梯度洗脫，ODS RP-C18反相柱層析以甲醇∶水(55∶45)進行梯度洗脫。
4.權利要求1所述化合物梅花參皂苷Ananaside A治療腫瘤的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皂苷類化合物及其制備方法，尤其是從海洋動物梅花參中分離得到一種皂苷類化合物及其抗腫瘤的用途。化合物梅花參皂苷Ananaside A，其分子式C
文檔編號A61K31/7048GK1978459SQ20061005279
公開日2007年6月13日 申請日期2006年8月4日 優(yōu)先權日2006年8月4日
發(fā)明者巫軍 申請人:巫軍