專利名稱：一種防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的中草藥制劑及其用法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的中草藥制劑及其用法。
背景技術：
蜜蜂細菌性幼蟲病是嚴重危害蜜蜂正常生長發(fā)育的傳染性疾病，對養(yǎng)蜂生產(chǎn)和蜂產(chǎn)品質量安全構成重大威脅。至今為止，已報道的蜜蜂細菌性幼蟲病包括美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病，這兩種蜜蜂細菌性幼蟲病曾經(jīng)給世界養(yǎng)蜂業(yè)造成了巨大的損失。2005年早春，在浙江慈溪、富陽、江山等地出現(xiàn)了一種嚴重的蜜蜂幼蟲病，其蜂群發(fā)病率在10％左右，一般感染小日齡幼蟲，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)病幼蟲顏色發(fā)黃，失去光澤，嚴重時腐爛，但腐爛幼蟲沒有難聞的酸臭味，病蟲通常在4～5日齡時死亡，病重群出現(xiàn)成年蜂爬蜂癥狀，群勢下降很快。使用抗生素飼喂發(fā)病蜂群，幼蟲腐爛癥狀很快好轉，所以，初步判斷該病可能由致病性細菌引起。該癥狀與目前已知的蜜蜂細菌性幼蟲病——美洲幼蟲腐臭病的癥狀(美幼病)的癥狀有明顯差異，與歐洲幼蟲腐臭病(歐幼病)的發(fā)病癥狀雖有某些類似之處(兩者都感染小日齡幼蟲，病蟲通常在4～5日齡死亡，發(fā)病后會發(fā)生腐爛)，但也存在明顯不同(該病腐爛幼蟲沒有難聞的酸臭味，病重蜂群出現(xiàn)成年蜂爬蜂癥狀)。采用美幼病和歐幼病病原檢測方法對發(fā)病幼蟲進行病原檢測，沒有檢測到美幼病和歐幼病對應的病原。通過試驗接種試驗、蜂群接種試驗、細菌形態(tài)特征觀察、生理生化特征檢測及16S rRNA基因序列分析等方法進行菌種鑒定，結果表明引起該蜜蜂幼蟲腐爛病的病原為屎腸球菌。
目前，防治蜜蜂幼蟲腐爛病的方法主要有以下幾種1)燒毀發(fā)病蜂群由于美洲蜜蜂幼蟲腐臭病病原具有頑強的存活力，且發(fā)病時對蜂群的危害是致命的，所以美國和歐盟規(guī)定美幼病發(fā)病群必須燒毀處理，以控制疾病的傳播和漫延，燒毀發(fā)病蜂群的方法會給蜂農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
2)使用土霉素防治美幼病1951年Gochnauer等報道土霉素治療美洲幼蟲腐臭病非常有效，而后的幾十年人們就普遍使用土霉素來防治美洲幼蟲腐臭病。但是近些年來人們越來越多的遇到了使用土霉素治療美洲幼蟲腐臭病效果下降的情況，有時甚至完全失效，后來證實是幼蟲芽孢桿菌對土霉素產(chǎn)生了抗性。
3)使用其他抗生素防治美幼病如何控制已經(jīng)對土霉素產(chǎn)生了抗性的美洲幼蟲腐臭病成為蜂病防治的新課題。很多人將注意力投向了使用其他的抗生素來代替土霉素。2001年，F(xiàn)eldlaufer MF等報道鹽酸林可霉素(lincomycinhydrochloride)能有效地控制美洲幼蟲腐臭病，而且對蜜蜂的生長沒有毒性。2002年，Elzen P等報道泰樂菌素(tylosin)對控制有土霉素抗性的美洲幼蟲腐臭病很有效，而且它對蜜蜂的生長也沒有毒性。然而這些候選抗生素的發(fā)現(xiàn)或許會在一定時期內有效，但卻不能從根本上解決問題，因為新的抗生素的使用同樣還存在會使病原菌產(chǎn)生抗性的問題。
因此，至今為止，蜜蜂幼蟲腐臭病和新發(fā)現(xiàn)的蜜蜂幼蟲腐爛病的防治仍是依賴使用抗生素為主要防治本發(fā)明的的使用會導致病原菌抗藥性的增強而失效，還不可避免地引起蜂產(chǎn)品中抗生素的殘留，給蜂產(chǎn)品安全生產(chǎn)構成嚴重威脅。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種抑菌效果優(yōu)良的防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的中草藥制劑及其用法。
本發(fā)明的防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的中草藥制劑，其配方為每10mL無菌水中含五倍子提取物粉劑410mg、百蕊草提取物粉劑10mg、大青葉提取物粉劑10mg、山楂提取物粉劑10mg、大蒜提取物粉劑410mg。
上述中草藥制劑的制備方法是按比例取上述各組分，將五倍子提取物粉劑、百蕊草提取物粉劑、大青葉提取物粉劑、山楂提取物粉劑和大蒜提取物粉劑一起放入無菌水中、攪拌均勻充分溶解即可。
本發(fā)明的中草藥制劑用于防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的使用方法對發(fā)病蜂群隔2天喂一次50mL中草藥制劑，連喂3次為一療程。
飼喂時，可將中草藥加到蜂群的飼喂器內，再加入200mL糖漿，一同飼喂。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有的有益的效果是1.采用本發(fā)明的中草藥復方制劑能有效抑制蜜蜂幼蟲腐爛病的病原，該復方制劑比單方制劑的抑菌效果更優(yōu)越。
2.采用本發(fā)明的中草藥復方制劑比使用抗生素防治蜜蜂幼蟲病更安全，不會對蜂產(chǎn)品造成抗生素殘留問題。
3.中草藥復方制劑不會造成類似病原菌對抗生素的抗性問題。
4.中草藥復方制劑易溶于水，在喂藥時把藥劑按適當比例加到飼喂蜜蜂的糖漿中，在給蜜蜂喂糖時一起飼喂藥劑，方便易行，便于推廣應用。
5.本發(fā)明所采用的中草藥為常見的中草藥品種，且能人工栽培，資源豐富，因此產(chǎn)品價格低廉，適于產(chǎn)業(yè)化推廣。
6.本發(fā)明所使用的中草藥制劑對環(huán)境溫和友好，不會污染環(huán)境，且為天然有機產(chǎn)品的提取物，對綠色、有機蜂產(chǎn)品生產(chǎn)具有重要的推廣應用價值。
具體實施例方式
以下結合實例進一步說明本發(fā)明。
蜜蜂幼蟲腐爛病病原的確認1)在蜜蜂繁殖和生產(chǎn)季節(jié)，發(fā)現(xiàn)蜂群中的小日齡幼蟲發(fā)生病變，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)病幼蟲顏色發(fā)黃，失去光澤，嚴重時腐爛，但腐爛幼蟲沒有難聞的酸臭味，病蟲通常在4～5日齡時死亡，病重群出現(xiàn)成年蜂爬蜂癥狀，群勢下降很快。
2)挑取3個癥狀典型的樣品，分別放入1.5mL滅菌離心管中，用75％酒精進行表面消毒，無菌水沖洗3次，無菌條件下剪開幼蟲表皮后搗碎；取勻漿在EFB培養(yǎng)基(每升含酵母浸膏10g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，牛心浸出液干粉10g，磷酸氫二鉀13.6g，瓊脂10g，pH 6.6)平板上劃線；37℃培養(yǎng)24h，菌落直徑為1mm左右，珍珠白，半透明水滴樣，邊緣整齊，表面光滑。在光鏡和電鏡下觀察，菌體呈橢圓形，排列成短鏈或者成對散在，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。細菌DNA的提取采用常規(guī)酚法(見《分子克隆實驗指南》(第三版)北京科學出版社，2003，pp.27-30)。以PrimerA(5′-AAGATTTGATC(CA)TGGCTCAG-3′)和PrimerB(5′-TACGGCTCTACCTTGTTACGACTT-3′)作為引物擴增。PCR擴增條件94℃3min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物的克隆參照《實用分子生物學方法手冊》李永明、趙玉琪等著，北京科學出版社，2000，pp.46-48)介紹的DNA分子克隆方法，經(jīng)克隆后測序，將測序結果用BLAST軟件與GenBank中的數(shù)據(jù)庫進行比較(http//ncbi.nih.gov/BLAST)分析，確定該發(fā)病蜂群的病原為屎腸球菌。
實施例1單方中草藥制劑抑制蜜蜂幼蟲腐爛病病原屎腸球菌試驗單方中草藥粉劑購自西安奧晶科技發(fā)展有限公司(每克中草藥粉劑由10克中草藥提取制得)。單方中草藥藥液配制按1克中草藥粉劑加9mL無菌水的比例配制藥液，藥液濃度為10％。
方法取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片10片放入清潔干燥的2mL離心管中。121℃，高壓滅菌30min后，放在烘箱中，使之完全干燥。在上述含有10片紙片的2mL離心管中加入藥液0.5mL，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在離心管上記錄藥物名稱及濃度，放37℃恒溫箱內干燥。
菌液的制備從發(fā)病幼蟲樣品中分離并保存的屎腸球菌菌株。細菌在EFB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，使生長濁度達到1.25×109/mL；使用時再將菌液用滅菌的EFB液體培養(yǎng)基稀釋1000倍，使細菌濃度達到1.25×106/mL，備用。
抑菌圈大小的測定取50μL制備的菌液加到EFB平板上，涂抹均勻。用滅菌的鑷子小心的將藥敏片貼到涂有菌液的EFB平板上。37℃恒溫培養(yǎng)24小時后，測量并記錄抑菌圈大小。每種藥敏片做3個重復。
結果試驗的18種中草藥的抑菌作用如表1。
表1 18種中草藥的抗菌作用(mm)

從表1可以看出，大蒜、大青葉、百蕊草、山楂、五倍子、甘草的抑菌效果明顯，良姜、白術、白頭翁、黃連次之；黃芪、金銀花、龍膽紫、大黃、板藍根、黃芩、青蒿、黃柏等中草藥的抑菌圈均在10mm以下，抑制作用弱。
實施例2本發(fā)明的復方中草藥制劑抑制蜜蜂幼蟲腐爛病病原屎腸球菌試驗中草藥粉劑購自西安奧晶科技發(fā)展有限公司(每克中草藥粉劑由10克中草藥提取制得)。復方中草藥制劑藥液制備按每10mL無菌水加入5種中草藥大蒜、大青葉、百蕊草、山楂、五倍子，各種中藥的添加量見表3，攪拌均勻充分溶解，制備復方中草藥制劑藥液。
取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片10片放入清潔干燥的2mL離心管中。121℃，高壓滅菌30min后，放在烘箱中，使完全干燥。在上述含有10片紙片的2mL離心管中加入藥液0.5mL，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在離心管上記錄試驗組別編號，放37℃恒溫箱內干燥。
菌液的制備從發(fā)病幼蟲樣品中分離并保存的屎腸球菌菌株。細菌在EFB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，使生長濁度達到1.25×109/mL；使用時再將菌液用滅菌的EFB液體培養(yǎng)基稀釋1000倍，使細菌濃度達到1.25×106/mL，備用。
抑菌圈大小的測定取50μL制備的菌液加到EFB平板上，涂抹均勻。用滅菌的鑷子小心的將藥敏片貼到涂有菌液的EFB平板上。37℃恒溫培養(yǎng)24小時后，測量并記錄抑菌圈大小。每種藥敏片做3個重復。
中草藥復方的篩選根據(jù)抑菌圈大小，選擇對屎腸球菌抑菌效果最好的5種中草藥，選用5個濃度水平，使用DPS軟件，采用二次正交旋轉組合試驗設計，設計5因素5水平36組試驗。試驗因素及水平見表2，試驗結果見表3。
表2二次正交旋轉組合試驗的因子和各因子的零水平、變化區(qū)間

表3二次正交旋轉組合試驗各處理結果

注C1五倍子；C2百蕊草；C3大青葉；C4山楂；C5大蒜-210mg；-1110mg；0210mg；1310mg；2410mg用DPS軟件對上表進行分析，最高值的各個因素組合如表4。
表4最高值的各個因素組合

注x1五倍子；x2百蕊草；x3大青葉；x4山楂；x5大蒜從上述正交實驗結果可知，試驗的5種中草藥的最佳配方為每10mL水中含五倍子410mg、百蕊草10mg、大青葉10mg、山楂10mg、大蒜410mg。
權利要求
1.一種防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原屎腸球菌的中草藥制劑，其特征是該中草藥制劑配方為每10mL無菌水中含五倍子提取物粉劑410mg、百蕊草提取物粉劑10mg、大青葉提取物粉劑10mg、山楂提取物粉劑10mg、大蒜提取物粉劑410mg。
2.權利要求1所述的中草藥制劑用于防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的方法，其特征是對發(fā)病蜂群隔2天喂一次50mL中草藥制劑，連喂3次為一療程。
全文摘要
本發(fā)明公開的防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原屎腸球菌的中草藥制劑，其配方為每10mL無菌水中含五倍子提取物粉劑410mg、百蕊草提取物粉劑10mg、大青葉提取物粉劑10mg、山楂提取物粉劑10mg、大蒜提取物粉劑410mg。用于防治蜜蜂幼蟲腐爛病病原的方法是對發(fā)病蜂群隔2天喂一次50mL中草藥制劑，連喂3次為一療程。本發(fā)明的中草藥制劑能有效抑制蜜蜂幼蟲腐爛病的病原，抑菌效果優(yōu)良。且中草藥品種資源豐富，價格低廉，適于產(chǎn)業(yè)化。不會造成類似病原菌對抗生素的抗性問題，也不會對蜂產(chǎn)品造成抗生素殘留問題。
文檔編號A61P31/00GK1903309SQ20061005287
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權日2006年8月10日
發(fā)明者蘇松坤, 羅建能, 戎映君, 錢建華, 任錦芳, 陳盛祿, 陳集雙 申請人:浙江大學