專利名稱：幽門螺桿菌抗原重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)疫苗，特別是涉及基于幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)抗原的重組疫苗、其制備方法及其在預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染性疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的革蘭氏陰性螺桿菌，世界上約有50％的人感染幽門螺桿菌。有關(guān)幽門螺桿菌人們已經(jīng)做了大量的研究工作，包括遺傳學(xué)、生理學(xué)以及致病因子等，而且也證實(shí)它是胃部疾病的主要致病因素。對(duì)于不同個(gè)體，不同的幽門螺桿菌菌株可以導(dǎo)致不同的病變，從臨床無癥狀到慢性胃炎、消化性潰瘍甚至胃癌。1998年日本學(xué)者Watanadbe等首先報(bào)道Hp感染的蒙古沙鼠可致胃癌發(fā)生，為Hp感染能誘發(fā)胃癌提供了直接證據(jù)。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，疫苗接種應(yīng)該是防治Hp感染的最有效的方法。隨著該菌有效的保護(hù)性抗原的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的基因克隆及動(dòng)物模型的不斷完善，Hp疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程尿素酶亞單位疫苗已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)階段。與此同時(shí)，多亞單位融合蛋白疫苗也越來越受到人們的關(guān)注。Ruggiero等人(Ruggiero P，Peppoloni S，Rappuoli R，et al.Thequest for a vaccine against Helicobacter pylorihow to move from mouse to man？Microbes Infect.20035(8)749-56..)認(rèn)為，在細(xì)菌感染過程中，由于宿主與致病菌之間的復(fù)雜作用機(jī)制，單一抗原組分的疫苗難以產(chǎn)生完全而有效的保護(hù)作用。因此，在Hp單一保護(hù)性抗原疫苗研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建的多亞單位或包括多個(gè)抗原組分的疫苗，將能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生比單一亞單位成分更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并可減少機(jī)體變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生幾率。
幽門螺桿菌產(chǎn)生一系列獨(dú)特的毒力因子，其中包括中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)、黏附蛋白和尿素酶。
Hp-NAP可以激起中性粒細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，使胃粘膜炎癥部位出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并且刺激胃粘膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。有研究表明，幽門螺桿菌感染后，粘膜炎癥部位的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與粘膜損傷進(jìn)而導(dǎo)致十二指腸潰瘍有密切關(guān)系。Evans等人(Evans Jr，D.J.，Evans，D.G.，Takemura，T.，Nakano，H.，Lampert，H.C.，Graham，D.Y.，Granger，D.N.and Kvietys，P.R.Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil activating protein.Infect.Immun，2001，632213-2220)首次定義了幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白，并且發(fā)現(xiàn)這種蛋白可以刺激人類中性粒細(xì)胞釋放活性氧簇，阻斷napA基因的表達(dá)可使相關(guān)炎性反應(yīng)減弱。
另一方面，Hp菌體培養(yǎng)條件苛刻，難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)菌抗原組分復(fù)雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護(hù)性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備。
因此，本領(lǐng)域特別需要提供一種基于幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)抗原的、對(duì)幽門螺桿菌感染具有更強(qiáng)、更完全的保護(hù)效果的多價(jià)重組疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種以幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)為基本活性成分的重組疫苗、其制備方法及其在預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染性疾病中的應(yīng)用。
根據(jù)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述疫苗以幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA為基本活性成分，并含有一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。
根據(jù)在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述疫苗以幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA與粘附素HpaA、尿素酶B亞單位活性功能片段UreB414串聯(lián)結(jié)合形成的融合蛋白為基本活性成分，并含有一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。
為了完成本發(fā)明，首先以DNA重組技術(shù)獲得單個(gè)重組蛋白和融合重組蛋白，然后再與佐劑成分，如大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、霍亂毒素CT或其B亞單位(CTB)或鋁鹽佐劑等，以不同組合方式(蛋白物理性混合或基因水平再融合等)制備出不同類型(分子外佐劑或分子內(nèi)佐劑)的重組疫苗。
中性粒細(xì)胞激活蛋白為近來發(fā)現(xiàn)的幽門螺桿菌的主要毒力因子之一。其中，中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA是大小約150kD的蛋白質(zhì)。NapA可促進(jìn)人中性粒細(xì)胞的活化，增加中性粒細(xì)胞CD11b/CD18的表達(dá)，并提高對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性(Evans D.J.Jr，et al(1995)InfectImmun63(6)2213-2220).阻斷napA基因的表達(dá)可使相關(guān)炎性反應(yīng)減弱。
尿素酶是一種催化尿素水解成氨和碳酸的鎳離子依賴性酶，為幽門螺桿菌中表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)。尿素酶通過中和胃酸幫助細(xì)菌在胃內(nèi)的定居并為細(xì)菌蛋白質(zhì)合成提供氨。宿主組織可直接受到尿素酶介導(dǎo)的氨產(chǎn)生的損傷，或間接受到尿素酶誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的刺激作用的損傷。阻斷尿素酶的作用將抑制幽門螺桿菌在宿主內(nèi)的定居、減少細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并降低與幽門螺桿菌相關(guān)的炎性反應(yīng)。
有人發(fā)現(xiàn)，口服接種幽門螺桿菌尿素酶或重組尿素酶B亞單位(rUreB)可保護(hù)小鼠免受幽門螺桿菌的感染(預(yù)防性疫苗)并可消除已存在的感染(治療性疫苗)(Michetti et al.，1994；Corthesy-Theulaz et al.，Gastroenterol.，)。Hirota等人(Hirota K，Nagata K，Norose Y，et al.InfectImmun.2001，69(11)6597-603)的研究發(fā)現(xiàn)，抗尿素酶B亞單位單克隆抗體可有效地阻斷尿素酶活性，并因此確定尿素酶分子中第321～339位氨基酸序列與酶活性相關(guān)。
口服接種的關(guān)鍵性因素是使用粘膜佐劑(例如霍亂毒素)，疫苗接種后，佐劑有助于將全身性抗體的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化成分泌性抗體的產(chǎn)生。
本發(fā)明的疫苗是采用DNA重組技術(shù)制備的。由于表達(dá)效率高，而且產(chǎn)物易于分離和純化，所以可以以高產(chǎn)率獲得高純度的疫苗產(chǎn)物。
可以將本發(fā)明的重組疫苗蛋白與佐劑(LTB、氫氧化鋁等)組合，制成帶有不同的分子外或分子內(nèi)佐劑的疫苗，以適用于不同免疫接種方法和途徑的需要。同時(shí)，本發(fā)明還選用了Hp的粘附素HpaA和尿素酶B亞單位的模擬活性片段(UreB414)，與NapA結(jié)合構(gòu)建成融合蛋白抗原，以增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)效力。
由于UreB分子量較大(66KD)，故存在蛋白表達(dá)效率低和純化難度大等困難。因此我們嘗試選擇分子的功能性片段替代全長(zhǎng)蛋白分子，既可有效地誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答，而且更便于DNA操作。為此，我們借助單克隆抗體篩選出尿素酶活性相關(guān)的功能片段(UreB414)并以其替代完整的尿素酶分子。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，作為本發(fā)明疫苗的主要活性成分，可以基因重組技術(shù)生產(chǎn)的幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA，或由幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA與尿素酶B亞單位活性功能片段UreB414、粘附素HpaA以任何次序串聯(lián)結(jié)合形成的融合蛋白質(zhì)。
例如，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)(例如參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，1989)完成已知核苷酸序列的切接、重組載體的構(gòu)建、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定等操作，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA，或包括串聯(lián)結(jié)合的幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA與尿素酶B亞單位活性片段UreB414、粘附素HpaA和分子內(nèi)佐劑(LTB或CTB)組成的融合蛋白質(zhì)的重組制備。
簡(jiǎn)單地說，使用常規(guī)的DNA重組技術(shù)，分別制備中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA及其與尿素酶B亞單位活性片段UreB414、粘附素HpaA的融合蛋白。然后，再將如此得到的單一重組蛋白(例如NapA)和融合重組蛋白(例如NapA-HpaA-UreB414)與佐劑成分，如大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、霍亂毒素CT或其B亞單位CTB等，以不同組合方式(蛋白質(zhì)物理性混合或基因融合)制備得到不同類型(分子外佐劑或分子內(nèi)佐劑)的DNA重組疫苗。
該方法包括以下步驟(1)分別提供編碼中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA、粘附素HpaA和尿素酶B亞單位活性片段的核苷酸序列，(2)在DNA連接酶的存在下，按適當(dāng)次序連接步驟(1)的核苷酸序列，得到融合基因序列，(3)用步驟(2)的融合基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在適于表達(dá)所述融合基因的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，(4)回收并純化步驟(3)的融合蛋白質(zhì)，
(5)加入一種或多種載體或賦形劑，得到所需的重組疫苗組合物。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如可以從幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中分離并擴(kuò)增得到編碼幽門螺桿菌NapA、UreB414和HpaA抗原或毒力因子的DNA片段。然后將這些DNA片段按照適當(dāng)順序連接到用同樣酶切的表達(dá)載體例如上，得到用作攜帶上述片段的重組DNA。用所說的重組DNA轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，在適于表達(dá)所需蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)基中分離并純化所需的蛋白質(zhì)。
分析結(jié)果顯示，本發(fā)明的重組蛋白的表達(dá)具有如下基本特征①本發(fā)明中所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒均可在原核表達(dá)系統(tǒng)—大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。；②重組蛋白NapA的表達(dá)率約為50％；重組融合蛋白NapA-LTB表達(dá)率約30％；重組融合蛋白NapA-HpaA-UreB414-LTB表達(dá)率約20％；重組融合蛋白NapA-CTB表達(dá)率約25％；重組融合蛋白NapA-HpaA-UreB414-CTB表達(dá)率約23％；③被表達(dá)的各重組蛋白均以可溶形式或包涵體形式存在，純化后產(chǎn)物的純度在90％以上；④各重組蛋白均能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以針對(duì)Hp保護(hù)性抗原成分中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA進(jìn)行單基因克隆，獲得單個(gè)重組蛋白，再以不同的組合方式與佐劑成分如大腸桿菌不耐熱腸毒素LT或其B亞單位LTB、霍亂毒素CT或其B亞單位CTB及鋁鹽佐劑等，以適當(dāng)比例進(jìn)行物理混合或吸收，以制備Hp多價(jià)組合疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以將中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA、尿素酶B亞單位活性片段UreB414和粘附素HpaA進(jìn)行基因水平連接，構(gòu)建表達(dá)重組融合蛋白，并在此基礎(chǔ)上再與大腸桿菌不耐熱腸毒素LT或其B亞單位LTB、霍亂毒素CT或其B亞單位CTB等佐劑成分按照適當(dāng)比例物理混合或吸收，制得具有不同分子外佐劑的重組多價(jià)融合蛋白疫苗組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以將中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA與尿素酶B亞單位活性片段UreB414和粘附素HpaA的基因與佐劑成分例如大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)或霍亂毒素B亞單位CTB的核苷酸編碼序列融合，得到重組的、含有分子內(nèi)佐劑的多價(jià)融合蛋白疫苗組合物。
基本上按照本領(lǐng)域已知的相似方法，制備下列有不同組合的基于幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA的重組體融合蛋白質(zhì)疫苗組合物NapA-LTB(SEQ ID NO16)、NapA-CTB(SEQ ID NO17)、NapA-HpaA-UreB414-LTB(SEQ ID NO18)、NapA-HpaA-UreB414-CTB(SEQ ID NO19)、NapA-HpaA-UreB414(SEQ ID NO20)(參見實(shí)施例2-6)。
動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的疫苗組合物具有良好的抗幽門螺桿菌感染活性，即具有顯著地免疫預(yù)防效果和清除Hp感染的能力。
可按照制藥工業(yè)中已知的方法(如參見Remington’s Pharmaceutical Science.15th ed.，MackPublishing Company，1980)將本發(fā)明的疫苗與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑按適當(dāng)?shù)谋壤旌希匆阎椒ǔ笾瞥杀景l(fā)明的疫苗組合物。
根據(jù)給藥途徑的不同，可將本發(fā)明的疫苗組合物配制成適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、體腔內(nèi)、組織內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥的可注射的溶液劑或分散劑；或適于口服給藥的粉末劑、片劑、顆粒劑、丸劑、乳劑、懸浮劑或膠囊劑。
為了制備適于胃腸道外途徑給藥的可注射溶液劑，例如可以使用無菌蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉或葡萄糖溶液，或低濃度(如1-100mM)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液態(tài)聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)作為載體或稀釋劑。在任何情況下，所說的可注射制劑均應(yīng)是無菌和可流動(dòng)并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下，所說的制劑還必須是穩(wěn)定的，并能夠?qū)辜?xì)菌和真菌等微生物的污染。必要時(shí)，可加入抗氧化劑(如抗壞鹽酸)、抗生素(如青霉素和鏈霉或其他抗真菌劑)及防腐劑(如苯甲酸鈉、三氯叔丁醇、度米酚、山梨酸等)，以及增溶劑和用于維持分散劑中所需顆粒大小的表面活性劑。
為了制備適于口服給藥的片劑、粉末劑、膠囊劑、顆粒劑或乳劑，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖等二糖，或甘露醇、山梨醇等六碳多羥基醇，以及玉米淀粉、明膠、脂質(zhì)、微晶纖維素等作為載體或賦形劑。必要時(shí)，也可在這些口服制劑中加入崩解劑、潤(rùn)滑劑、緩沖鹽、著色劑、甜味劑、香料、分散劑及表面活性劑。
另外，也可使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成份，將本發(fā)明的疫苗組合物制成微膠囊劑或脂質(zhì)體包裹劑。為此，可使用甘油、硬脂酸鎂、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、膽固醇、卵磷脂、甲基纖維素或羧甲基纖維素、滑石粉、乳糖、葡聚糖、淀粉等作為基質(zhì)或賦形劑。
本發(fā)明的包括幽門螺桿菌的多個(gè)保護(hù)性抗原成分的重組疫苗，是以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的。在完成了本發(fā)明多價(jià)重組疫苗的實(shí)驗(yàn)室水平制備的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步實(shí)踐并摸索了用于本發(fā)明疫苗的中試和工業(yè)規(guī)模放大生產(chǎn)。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在添加有酵母浸出液和微量元素的改良M9-CAA培養(yǎng)基內(nèi)，10L發(fā)酵菌液可以收獲細(xì)菌生物量約600克(濕重)。經(jīng)分離和純化后，得到純度約為95％的最終表達(dá)產(chǎn)物大約為1.2-2克的(NapA-LTB)、NapA-CTB(NapA-HpaA-UreB414-LTB)、(NapA-HpaA-UreB414-CTB)NapA-HpaA-UreB414。
我們的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的重組疫苗在免疫接種后，可在受體動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)顯著的抗幽門螺桿菌抗體反應(yīng)，均具有一定的抗幽門螺桿菌感染活性。其中rNapA-HpaA-UreB414-LTB的保護(hù)率最高可達(dá)到96.7％，具有較好的抗幽門螺桿菌感染的活性，是理想的幽門螺桿菌多亞單位基因工程疫苗。


圖1是重疊延伸方法得到的NapA-HpaA-UreB414-LTB融合基因泳道1為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為融合基因NapA-HpaA-UreB414-LTB重組質(zhì)粒NdeI/XhoI雙酶切產(chǎn)物(5300bp，1590bp)；泳道3為融合基因NapA-HpaA-UreB414-LTB的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1590bp)；泳道4為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)圖2為融合蛋白NapA-HpaA-UreB414-LTB純化效果PAGE電泳圖泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2為目的蛋白洗脫峰樣品。
結(jié)果顯示經(jīng)過純化步驟，收獲的目的蛋白峰經(jīng)UVP掃描分析純度達(dá)到95％以上。
圖3為不同抗原免疫組小鼠產(chǎn)生的血清IgG水平圖4為不同抗原免疫組小鼠產(chǎn)生的血清IgA水平圖5為不同抗原免疫組小鼠產(chǎn)生的腸粘液sIgA水平圖6為不同抗原免疫組小鼠產(chǎn)生的胃粘液sIgA水平具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述實(shí)施例1 幽門螺桿菌的HpaA，UreB414，NapA編碼基因的克隆1.幽門螺桿菌購自ATCC，本室保種，菌株為Helicobacter pylori 26695(ATCC Number700392)2.液氮罐中取出保存的Hp菌株涂布于Hp專用固體培養(yǎng)基上，于37℃，含5％O2，85％N2，10％CO2條件下培養(yǎng)72h。基因組抽提試劑盒抽提Hp基因組。
3.采用PCR方法自Hp基因組分別擴(kuò)增NapA，HpaA和UreB414的編碼基因。
1)引物設(shè)計(jì)合成如下(下劃線示酶切位點(diǎn)及l(fā)inker堿基序列)根據(jù)GenBank公布的基因序列及引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，引入酶切位點(diǎn)。在中間引入設(shè)計(jì)linker的堿基序列。
HpaA P1 5’-CCCTGCTGTACCACCACCTAATTACCATCCA-3’linkerP3 5’-CAGGTGGAGGTACTGCAGGAACCTTAATAAACCCAG-3’linkerUreB414P4 5’-TCCTGCAGTACCTCCACCTGACACTTTGAATGAA-3’linkerP5 5’-CTCGAGAAATTCTTTTTG-3’XhoI
P6 5’-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAAATTCTTTTTTG-3’linkerNapA P7 5’-GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA-3’NdeIP8’ 5′-CGCGGATCCTTAAGCTAAATGGGC-3′BamHI2)目的基因的PCR擴(kuò)增以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，以P1和P3，P4和P5，P7和P8’分別擴(kuò)增HpaA、UreB414和NapA基因，采用如下PCR體系和程序在一個(gè)200μl微量離心管中加入下列試劑模板DNA 2μl10×PCR緩沖液(含氯化鎂) 5μldNTPs(10mmol/L) 4μl上、下游引物(0.025mmol/L)各 1μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)1μl加去離子水至終體積 50μl混勻后加入礦物油3滴反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘后，94℃，90s；60℃，60s；72℃，90s，35個(gè)循環(huán)周期，然后72℃延伸10min。
1.PCR產(chǎn)物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物，方法見文獻(xiàn)(于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測(cè)序，介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法，中國(guó)免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)。
2.PCR產(chǎn)物的序列分析將TA克隆轉(zhuǎn)化菌株送至公司，按常規(guī)方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989聚丙烯酰胺凝膠電泳1.21-1.32)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。
實(shí)施例2 融合基因NapA-LTB的獲得1.NapA及LTB基因擴(kuò)增1)引物設(shè)計(jì)與合成NapA P7 5’-GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA-3’NdeIP8 5’-CGGAGGATCCTGCGGAGCTAAATGGGC-3’linkerLTB P9 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTAT-3
linkerP9’ 5’-CCGCAGGATCCTCCGGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP10 5’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoI分別以幽門螺桿菌SS1、野生型產(chǎn)毒大腸桿菌H44815基因組DNA為模板，用P7和P8、P9’和P10擴(kuò)增NapA、LTB基因，細(xì)菌基因組抽提按天為時(shí)代離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒I進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(25mmol/L each)8μL，上下游引物各2μL，上述NapA或LTB基因組各1μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)1μL，加滅菌水至100μL。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
以回收的NapA和LTB基因?yàn)槟０?，P7和P10為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L each)4μL，上下游引物(P7和P10)各1μL，上述NapA和LTB基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)0.5μL，加滅菌水至50μL。
重疊延伸PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。
實(shí)施例3 融合基因NapA-CTB的獲得1.NapA及CTB基因擴(kuò)增1)引物設(shè)計(jì)與合成NapA P7 5’-GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA-3’NdeIP8 5’-CGGAGGATCCTGCGGAGCTAAATGGGC-3’linkerCTB P11’ 5’-CCGCAGGATCCTCCGATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP125’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI用P7和P8、P11’和P12擴(kuò)增NapA、CTB基因，細(xì)菌基因組抽提按天為時(shí)代離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒I進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(25mmol/L each)8μL，上下游引物各2μL，上述NapA或CTB基因組各1μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)1μL，加滅菌水至100μL。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
以回收的NapA和CTB基因?yàn)槟０澹琍7和P12為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L each)4μL，上下游引物(P7和P12)各1μL，上述NapA和CTB基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)0.5μL，加滅菌水至50μL。
重疊延伸PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。
實(shí)施例4 融合基因NapA-HpaA-UreB414-LTB的獲得引物設(shè)計(jì)與合成NapA P7 5’-GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA-3’NdeIP8 5’-CGGAGGATCCTGCGGAGCTAAATGGGC-3’linkerHpaA/UreB414/ P2 5’-CCGCAGGATCCTCCGAATTACCACCC-3’LTB linkerP105’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoI1)以實(shí)施例1回收的HpaA和UreB414基因?yàn)槟０?，以P1和P5為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L each)4μL，上下游引物各1μL，上述HpaA和UreB414基因各2μL，Ex-TaqDNA聚合酶(5單位/μL)0.5μL，加滅菌水至50μL。
重疊延伸PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
2)以上述回收的HU基因和E.coli H44815基因組DNA為模板，分別以P1和P6、P9和P10為引物克隆HU和LTB基因，以回收的HU和LTB基因?yàn)槟０?，P1和P10為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
3)以上述回收的HUL基因和實(shí)施例2回收的NapA基因?yàn)槟０?，分別以P7和P8、P2和P10為引物克隆NapA和HUL基因，以回收的NapA和HUL基因?yàn)槟０?，P7和P10為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。融合基因核苷酸序列見附圖3。
PCR擴(kuò)增效果如附圖1所示。
實(shí)施例5 融合基因NapA-HpaA-UreB414-CTB的獲得引物設(shè)計(jì)與合成NapA P7 5’-GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA-3’NdeIP8 5’-CGGAGGATCCTGCGGAGCTAAATGGGC-3’linkerCTB P115’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerHpaA/UreB414/P2 5’-CCGCAGGATCCTCCGAATTACCACCC-3’CTB linkerP125’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI1)以實(shí)施例4回收的HpaA/UreB414基因和霍亂桿菌基因組為模板，以P1和P6、P11和P12為引物克隆HU和CTB基因。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L each)4μL，上下游引物各1μL，上述模板基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)0.5μL，加滅菌水至50μL。
重疊延伸PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
2)以上述回收的HUC基因和實(shí)施例2回收的NapA基因?yàn)槟０?，分別以P7和P8、P2和P12為引物克隆NapA和HUC基因，以回收的NapA和HUC基因?yàn)槟０澹琍7和P12為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。
實(shí)施例6 融合基因NapA-HpaA-UreB414的獲得以實(shí)施例5回收的NapA-HpaA-UreB414-CTB基因?yàn)槟０?，以P7和P6為引物克隆NHU基因。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L each)4μL，上下游引物各1μL，上述模板基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μL)0.5μL，加滅菌水至50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。
實(shí)施例7 重組基因表達(dá)質(zhì)粒及高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建及篩選
1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建將各個(gè)融合基因擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳、膠回收純化后與載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，分別用NcoI/XhoI或NdeI/XhoI雙酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
將含目的基因的pMD-18T載體及表達(dá)載體pET-28a(+)或pET-22b(購自美國(guó)Novagen公司，本室保存)雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳、目的片段膠回收純化后，用連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，雙酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
有關(guān)操作具體步驟如下1)質(zhì)粒DNA抽提(使用Omega公司質(zhì)粒抽提試劑盒)[1]挑取平板上分隔良好的菌落轉(zhuǎn)種于帶相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。
取菌液分裝于1.5mL離心管中，12000g離心3min，留取沉淀。
每管加100μL Solution I懸浮，充分振蕩混勻。
加入100μL Solution II，輕柔混勻，冰水浴5min。
加入250μL SolutionIII，輕振混勻，室溫放置10min。
4℃、12000g離心10min，將上清移至分離管中。
12000g離心1min，傾倒收集管中的廢液。
加入500μL washing buffer于分離管中，同上離心并棄去收集管中的廢液。重復(fù)洗滌一次。
12000g離心1min，使乙醇完全揮發(fā)。
將分離管置于另一干凈EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g離心1min。
取一定量洗脫液進(jìn)行電泳，其余置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)瓊脂糖凝膠電泳1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。
50×TAE儲(chǔ)存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸調(diào)節(jié)pH8.3。
3)質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)1μg 質(zhì)粒DNA1μl 10×緩沖液(見上海生工公司產(chǎn)品說明書)1μl 限制性內(nèi)切酶NcoI/ XhoI或NdeI/XhoI (10u/μl)用雙蒸水補(bǔ)齊至10μl
混合后37℃溫育1-2小時(shí)。
4)瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5mL EP管。
加入Omega公司膠回收試劑盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。
加入配套的Washing buffer，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。重復(fù)洗滌1次。
12000g離心1min，分離管移置另一干凈1.5mL EP管，加入一定體積的TE buffer，65℃孵育10min，12000g離心1min，取一定量電泳，UVP紫外掃描儀檢測(cè)回收純化效果。
5)連接反應(yīng)(使用上海生工公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)目的DNA片段和載體片段的濃度，根據(jù)外源片段與載體摩爾數(shù)比一般為1∶2～10的原則，設(shè)計(jì)連接反應(yīng)體系如下目的DNA 1μL質(zhì)粒載體 1～2μLligation solution5μLddH2O 2～3μLTotal volume 10μL22℃連接12-16h。
6)感受態(tài)菌的制備(CaCl2法)(1)無菌接種環(huán)蘸取-70℃凍存的細(xì)菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)。
(2)挑取單個(gè)菌落接種于2mL LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)12～16h。
(3)將過夜培養(yǎng)的DH5a按1％比例轉(zhuǎn)種至LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.2～0.4時(shí)，8000g離心5min收集細(xì)菌。
(4)加入1mL預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴3h。4℃8000g離心5min，棄上清。加入100μL預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1h，備用。
7)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(1)取感受態(tài)菌液100μL，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物；冰水浴60min，42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
(2)加100μL LB培養(yǎng)液，37℃搖床培養(yǎng)1h。
(3)以8000g離心10min，吸棄100μL上清后混勻沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
1.高效表達(dá)融合蛋白工程菌的構(gòu)建及篩選將含目的融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并提取質(zhì)粒酶切鑒定?；蚬こ檀竽c桿菌BL21的感受態(tài)菌制備、轉(zhuǎn)化及重組菌的質(zhì)粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3mL含Kan或Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL含Kan或Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)2.5小時(shí)，以IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式和表達(dá)量，篩選高效表達(dá)菌株。
實(shí)施例8基因重組表達(dá)工程菌的發(fā)酵發(fā)酵工藝如下采用德國(guó)B.Bron 10L發(fā)酵罐，發(fā)酵過程中種子菌10％比例接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH7.0，在A600未達(dá)到2時(shí)不加補(bǔ)料，之后每0.5h流加補(bǔ)料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次補(bǔ)料后待葡萄糖濃度降為0.1％時(shí)加入IPTG 500μmol/L誘導(dǎo)4h收菌。
發(fā)酵過程在級(jí)聯(lián)溶氧控制的分批培養(yǎng)基礎(chǔ)上，流加補(bǔ)料。
發(fā)酵過程所用培養(yǎng)基為改良M9-CAA培養(yǎng)基，在M9-CAA的基礎(chǔ)上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
發(fā)酵后回收菌液，4℃離心(8000g)15分鐘。吸棄上清，收集細(xì)菌，稱重后凍存?zhèn)溆谩?br> 結(jié)果10L發(fā)酵菌液可以收獲細(xì)菌濕重600克左右。
實(shí)施例9 重組目的蛋白的純化及劑型制備1.可溶性上清和包涵體提取將高效表達(dá)的菌體200-500g以TE緩沖液1∶10(W/V)比例懸浮，4℃預(yù)冷后采用細(xì)胞勻漿機(jī)使其混合均勻。采用高壓均質(zhì)機(jī)在壓力為40-70Mpa的條件下進(jìn)行破菌(共破菌4～6次)，破菌完畢后，取少量菌液涂片染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞的完整性，確保細(xì)胞破碎完全，隨后以500g離心25min，棄沉淀，再以15,000g離心40min，留取上清即為可溶性上清，收集沉淀即為包涵體。可溶性上清直接用于純化。包涵體以1∶10(W/V)的比例分別用洗滌液A和B各洗滌2次。洗滌條件為4℃攪拌20min，15,000g離心40min，收集包涵體沉淀；最后將包涵體用包涵體溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃攪拌3h，15,000g離心45min，取上清作為下一步純化的原料。
包涵體提取所用緩沖液1)TE緩沖液20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH8.02)包涵體洗滌液A5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH8.03)包涵體洗滌液B20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH8.04)包涵體溶解液1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH8.0)
2.金屬離子螯合層析選擇親和層析柱Chelating Sepharose進(jìn)行純化，使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH7.0～9.0對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，采用咪唑梯度洗脫。
3.陰離子柱純化選擇陰離子柱HiTrap Q進(jìn)行純化，使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH7.0～9.0對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，采用NaCl梯度洗脫。
4.Superdex凝膠過濾層析脫鹽步驟3所獲目標(biāo)蛋白經(jīng)葡聚糖PEG透析袋內(nèi)濃縮或超濾濃縮后用凝膠過濾柱Superdex過濾脫鹽，脫尿素及咪唑。
5.純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢定其純度。Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。
其中，步驟2所述鎳離子親和純化填料為Chelating Sepharose HP、Chelating Sepharose FF之一；步驟3所述陰離子純化填料為Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一；步驟4所述凝膠過濾層析柱為Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一。
純化結(jié)果如附圖2所示。
上述方法獲得的重組蛋白分別被制備成液體劑型、冷凍干燥劑型或膠囊劑。其中液體劑型供口服、滴鼻或注射使用；冷凍干燥劑型加純化水或注射用水溶解后供口服、滴鼻或注射使用；膠囊劑型供口服使用。液體劑型制備方法為向純化所獲得的目的蛋白中加入適當(dāng)比例(0.1％～0.5％)的穩(wěn)定劑甘露醇，混勻，除菌過濾后分裝，其中用于滴鼻的液體劑型中還加入1％的卡泊波(carbopol)；冷凍干燥劑型制備方法為向純化所獲得的目的蛋白中加入適當(dāng)比例(5％～20％)的穩(wěn)定劑甘露醇(果糖或山梨醇)，混勻，除菌過濾分裝后冷凍干燥；膠囊劑型制備方法為首先向純化所獲得的目的蛋白中加入適當(dāng)比例(5％～20％)的穩(wěn)定劑甘露醇，混勻，除菌過濾分裝后冷凍干燥，再裝填入腸溶膠囊。
實(shí)施例10 分子外佐劑(LT、CT、CTB或氫氧化鋁)的幽門螺桿菌基因工程疫苗的制備1.粘膜佐劑—減毒LT突變體的制備采用基因工程重組技術(shù)克隆大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因，并進(jìn)行基因突變，構(gòu)建重組表達(dá)載體，在工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)出減毒LT突變體-rLTS63K(由本單位完成，詳見①馮強(qiáng)，鄒全明，蔡紹皙，等.LT質(zhì)粒的新法提取及無毒突變體LTS63K的構(gòu)建和序列分析.免疫學(xué)雜志.2002，18(5)385-388.②馮強(qiáng)，蔡紹皙，楊君，等.生物工程學(xué)報(bào).2003，19(5)532-537.)。采用半乳糖親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，獲得純度大于95％的減毒性LT突變體蛋白(rLTS63K)，并以此作為粘膜佐劑。
2.以rLTS63K為佐劑的幽門螺桿菌基因工程疫苗的制備純化的Hp重組抗原蛋白以不同組合形式與粘膜佐劑rLTS63K物理混合，制備出幽門螺桿菌基因工程疫苗。該疫苗以rLTS63K作為粘膜佐劑，適用于粘膜途徑(胃腸道、鼻粘膜等)的免疫接種。
3.以CT、CTB為佐劑的幽門螺桿菌基因工程疫苗的制備純化的Hp重組抗原蛋白以不同組合形式與粘膜佐劑CT或CTB物理混合，制備出幽門螺桿菌基因工程疫苗。該疫苗以CT或CTB作為粘膜佐劑，適用于粘膜途徑(胃腸道、鼻粘膜等)的免疫接種。
4.以氫氧化鋁為佐劑的幽門螺桿菌基因工程疫苗的制備將不同的Hp重組保護(hù)性抗原蛋白濃度調(diào)整為2mg/ml，與同樣濃度的氫氧化鋁以1∶1體積比混合均勻，4℃靜置5小時(shí)，8000×g離心20秒，棄上清，凝膠沉淀即為幽門螺桿菌基因工程疫苗。該疫苗以氫氧化鋁為佐劑，適用于非粘膜途徑(肌肉等)的注射免疫接種。
5.劑型制備同實(shí)施例9。
實(shí)施例11動(dòng)物實(shí)驗(yàn)①BALB/c小鼠免疫后特異性免疫應(yīng)答基因工程疫苗口服免疫Balb/c小鼠，150μg/只，分別于在0，1，2，4周各免疫一次，于末次免疫后1周采集血液和胃腸道沖洗液，ELISA檢測(cè)血清及胃腸道沖洗液中特異性抗體IgG和sIgA產(chǎn)生。同時(shí)，設(shè)立PBS對(duì)照組。具體分組如下組號(hào) 免疫抗原 每組動(dòng)物數(shù)I rNapA15只/組IIrHpaA15只/組III rUreB414 15只/組IVrNapA+rLTB 15只/組V rHpaA+rLTB 15只/組VIrUreB414+rLTB15只/組VII rNapA-HpaA-UreB414 15只/組VIII (rNapA-HpaA-UreB414)+rLTB 15只/組IX rNapA-HpaA-UreB414-LTB15只/組XrNapA-HpaA-UreB414-CTB15只/組XIPBS 15只/組(注“+”表示抗原是物理混合，“-”表示抗原是在基因水平連接)抗體水平檢測(cè)結(jié)果如圖3～6所示。如圖示結(jié)果可知，幽門螺桿菌多亞單位基因工程疫苗實(shí)驗(yàn)組小鼠特異性抗體水平均有顯著提高，與PBS對(duì)照組、單一亞單位以及單一亞單位加佐劑實(shí)驗(yàn)組相比較均有顯著增高(P＜0.05)，并且顯著高于多亞單位無佐劑實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，提示口服免疫后激發(fā)小鼠產(chǎn)生粘膜局部免疫應(yīng)答和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。
②蒙古沙鼠口服免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)將不同劑型疫苗免疫(第0、1、2、4周各免疫1次)沙鼠，末次免疫后9天，以幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1株攻毒，攻毒后2周剖殺動(dòng)物，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和病理切片檢查。結(jié)果如下圖
組號(hào) 免疫抗原每組動(dòng)物數(shù)保護(hù)率IrNapA30只/組 20.0％II rHpaA30只/組 23.3％III rUreB414 30只/組 16.7％IV rNapA+rLTB 30只/組 43.3％VrHpaA+rLTB 30只/組 40.0％VI rUreB414+rLTB30只/組 36.7％VII rNapA-HpaA-UreB414 30只/組 33.3％VIII (rNapA-HpaA-UreB414)+rLTB30只/組 83.3％IX rNapA-HpaA-UreB414-LTB 30只/組 96.7％XrNapA-HpaA-UreB414-CTB 30只/組 90.0％XI PBS 30只/組 0％可見，rNapA-HpaA-UreB414-LTB實(shí)驗(yàn)組的攻毒保護(hù)率為96.7％，明顯高于PBS對(duì)照組、單一亞單位實(shí)驗(yàn)組、單一亞單位加佐劑實(shí)驗(yàn)組以及多亞單位無佐劑實(shí)驗(yàn)組。
③蒙古沙鼠口服免疫攻毒后存活時(shí)間實(shí)驗(yàn)沙鼠免疫攻毒和分組情況同上，只是攻毒2周后不再剖殺動(dòng)物，繼續(xù)飼養(yǎng)以觀察疫苗對(duì)沙鼠的毒副作用，同時(shí)設(shè)立正常沙鼠無免疫組，以排除環(huán)境等各方面對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。
組號(hào) 免疫抗原 每組動(dòng)物數(shù) 存活＞2個(gè)月動(dòng)物數(shù)IrNapA30只/組22只II rHpaA30只/組18只III rUreB414 30只/組21只IV rNapA+rLTB 30只/組16只VrHpaA+rLTB 30只/組16只VI rUreB414+rLTB30只/組19只VII rNapA-HpaA-UreB414 30只/組14只VIII (rNapA-HpaA-UreB414)+rLTB30只/組22只IX rNapA-HpaA-UreB414-LTB 30只/組29只XrNapA-HpaA-UreB414-CTB 30只/組20只XI PBS30只/組2只XIINone 30只/組30只結(jié)果分析從實(shí)驗(yàn)①可知，VIII、IX、X三組口服免疫后可激發(fā)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的粘膜局部免疫應(yīng)答和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答；從實(shí)驗(yàn)②可見，同樣是這三組的保護(hù)率較高，超過了80％，尤其是IX組達(dá)到了96.7％；從實(shí)驗(yàn)③得知，IX組的抗原對(duì)沙鼠影響最小，其存活率接近正常沙鼠無免疫組，而同樣的多亞單位抗原組VIII、X的沙鼠存活率則明顯低于IX組。由以上結(jié)果確定rNapA-HpaA-UreB414-LTB(IX組)是理想的幽門螺桿菌多亞單位基因工程疫苗。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>幽門螺桿菌抗原重組疫苗<141>
<160>20<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的帶有附加酶切位點(diǎn)的引物序列P1。
<400>1CCCTGCTGTACCACCACCTAATTACCATCCA<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P2。
<400>2CCGCAGGATCCTCCGAATTACCACCC<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的帶有附加酶切位點(diǎn)的引物序列P3。
<400>3
CAGGTGGAGGTACTGCAGGAACCTTAATAAACCCAG<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P4。
<400>4TCCTGCAGTACCTCCACCTGACACTTTGAATGAA<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P5。
<400>5CTCGAGAAATTCTTTTTTG<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P6。
<400>6GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAAATTCTTTTTTG<210>7<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P7。
<400>7GCGGGCATATGAAAACATTTGAAA<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P8。
<400>8CGGAGGATCCTGCGGAGCTAAATGGGC<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P9。
<400>9GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P10。
<400>10CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC
<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P11。
<400>11GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P12。
<400>12CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P8’。
<400>13CGCGGATCCTTAAGCTAAATGGGC<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物序列P9’。
<400>14CCGCAGGATCCTCCGGCTCCCCAGTCTATT<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P11’。
<400>15CCGCAGGATCCTCCGATTAAATTAAAATTTGGT<210>16<211>756<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NapA-LTB融合蛋白質(zhì)的DNA序列<400>16ATGAAAACAT TTGAAATTTT AAAACATTTG CAAGCGGATG CGATCGTGTT ATTTATGAAAGTGCATAACT TCCATTGGAA TGTGAAAGGC ACCGATTTTT TCAATGTGCA TAAAGCCACTGAAGAAATTT ATGAAGAATT TGCGGACATG TTTGATGATC TCGCTGAAAG AATCGCTCAATTAGGACACC ACCCCTTAGT CACTTTATCC GAAGCGCTCA AACTCACTCG TGTTAAAGAAGAAACTAAAA CGAGCTTCCA CTCTAAAGAC ATCTTTAAAG AAATTCTAGG CGATTACAAACACCTAGAAA AAGAATTTAA AGAGCTTTCT AACACCGCTG AAAAAGAAGG CGATAAAGTTACCGTAACTT ATGCGGACGA TCAATTGGCC AAGTTGCAAA AATCCATTTG GATGCTAGAAGCCCATTTAG CTCCGCAGGA TCCTCCGGCT CCCCAGTCTA TTACAGAACT ATGTTCGGAATATCGCAACA CACAAATATA TACGATAAAT GACAAGATAC TATCATATAC GGAATCGATGGCAGGTAAAA GAGAAATGGT TATCATTACA TTTAAGAGCG GCGCAACATT TCAGGTCGAAGTCCCGGGCA GTCAACATAT AGACTCCCAA AAAAAAGCCA TTGAAAGGAT GAAGGACACATTAAGAATCA CATATCTGAC CGAGACCAAA ATTGATAAAT TATGTGTATG GAATAATAAAACCCCCAATT CAATTGCGGC AATCAGTATG GAAAAC<210>17
<211>819<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NapA-CTB融合蛋白質(zhì)的DNA序列<400>17ATGAAAACAT TTGAAATTTT AAAACATTTG CAAGCGGATG CGATCGTGTT ATTTATGAAAGTGCATAACT TCCATTGGAA TGTGAAAGGC ACCGATTTTT TCAATGTGCA TAAAGCCACTGAAGAAATTT ATGAAGAATT TGCGGACATG TTTGATGATC TCGCTGAAAG AATCGCTCAATTAGGACACC ACCCCTTAGT CACTTTATCC GAAGCGCTCA AACTCACTCG TGTTAAAGAAGAAACTAAAA GGAGCTTCCA CTCTAAAGAC ATCTTTAAAG AAATTCTAGG CGATTACAAACACCTAGAAA AAGAATTTAA AGAGCTTTCT AACACCGCTG AAAAAGAAGG CGATAAAGTTACCGTAACTT ATGCGGACGA TCAATTGGCC AAGTTGCAAA AATCCATTTG GATGCTAGAAGCCCATTTAG CTCCGCAGGA TCCTCCGATT AAATTAAAAT TTGGTGTTTT TTTTACAGTTTTACTATCTT CAGCATATGC ACATGGAACA CCTCAAAATA TTACTGATTT GTGTGCAGAATACCACAACA CACAAATATA TACGCTAAAT GATAAGATAT TTTCGTATAC AGAATCTCTAGCTGGAAAAA GAGAGATGGC TATCATTACT TTTAAGAATG GTGCAATTTT TCAAGTAGAAGTACCAGGTA GTCAACATAT AGATTCACAA AAAAAAGCGA TTGAAAGGAT GAAGGATACCCTGAGGATTG CATATCTTAC TGAAGCTAAA GTCGAAAAGT TATGTGTATG GAATAATAAAACGCCTCATG CGATTGCCGC AATTAGTATG GCAAATTAA<210>18<211>1584<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NapA-HpaA-UreB414-LTB 融合蛋白的DNA序列<400>18ATGAAAACAT TTGAAATTTT AAAACATTTG CAAGCGGATG CGATCGTGTT ATTTATGAAAGTGCATAACT TCCATTGGAA TGTGAAAGGC ACCGATTTTT TCAATGTGCA TAAAGCCACTGAAGAAATTT ATGAAGAATT TGCGGACATG TTTGATGATC TCGCTGAAAG AATCGCTCAATTAGGACACC ACCCCTTAGT CACTTTATCC GAAGCGCTCA AACTCACTCG TGTTAAAGAAGAAACTAAAA CGAGCTTCCA CTCTAAAGAC ATCTTTAAAG AAATTCTAGG CGATTACAAACACCTAGAAA AAGAATTTAA AGAGCTTTCT AACACCGCTG AAAAAGAAGG CGATAAAGTTACCGTAACTT ATGCGGACGA TCAATTGGCC AAGTTGCAAA AATCCATTTG GATGCTAGAAGCCCATTTAG CTCCGCAGGA TCCTCCGAAT TACCACCCAG CAAGCGAGAA AGTTCAAGCGTTAGATGAAA AGATTTTGCT TTTAAGGCCA GCTTTCCAAT ATAGCGATAA TATCGCTAAAGAGTATGAAA ACAAATTCAA GAATCAAACC GCGCTCAAGG TTGAACAGAT TTTGCAAAATCAAGGCTATA AGGTTATTAG CGTAGATAGC AGCGATAAAG ACGATTTTTC TTTTGCACAA
AAAAAAGAAG GGTATTTGGC GGTTGCTATG AATGGCGAAA TTGTTTCACG CCCCGATCCTAAAAGGACCA TACAGAAAAA ATCAGAACCC GGGTTATTAT TCTCCACCGG TTTGGACAAAATGGAAGGGG TTTTAATCCC GGCTGGGTTT ATTAAGGTTC CTGCAGTACC TCCACCTGACACTTTGAATG AAGCTGGTTG TGTAGAAGAC ACTATGGCAG CTATTGCTGG GCGCACTATGCACACTTTCC ACACTGAAGG CGCTGGCGGC GGACACGCTC CTGATATTAT TAAAGTGGCCGGCGAACACA ACATTCTACC CGCTTCCACT AACCCCACTA TCCCTTTCAC TGTGAATACAGAAGCAGAAC ACATGGACAT GCTTATGGTG TGCCACCACT TGGATAAAAG CATTAAAGAAGATGTTCAGT TCGCTGATTC AAGGATCCGC CCTCAAACCA TTGCGGCTGA AGACACTTTGCATGACATGG GGATTTTCTC AATCACCAGT TCTGACTCTC AAGCTATGGG TCGTGTGGGTGAAGTTATCA CTAGAACTTG GCAAACAGCT GACAAAAACA AAAAAGAATT TGGAGGCGGAAGTGGAGGAG GTAGTGCACC CCAGTCTATT ACAGAACTAT GTTCGGAATA TCGCAACACACAAATATATA CGATAAATGA CAAGATACTA TCATATACGG AATCGATGGC AGGTAAAAGAGAAATGGTTA TCATTACATT TAAGAGCGGC GCAACATTTC AGGTCGAAGT CCCGGGCAGTCAACATATAG ACTCCCAAAA AAAAGCCATT GAAAGGATGA AGGACACATT AAGAATCACATATCTGACCG AGACCAAAAT TGATAAATTA TGTGTATGGA ATAATAAAAC CCCCAATTCAATTGCGGCAA TCAGTATGGA TAAC<210>19<211>1647<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NapA-HpaA-UreB414-CTB融合蛋白質(zhì)的DNA序列<400>19ATGAAAACAT TTGAAATTTT AAAACATTTG CAAGCGGATG CGATCGTGTT ATTTATGAAAGTGCATAACT TCCATTGGAA TGTGAAAGGC ACCGATTTTT TCAATGTGCA TAAAGCCACTGAAGAAATTT ATGAAGAATT TGCGGACATG TTTGATGATC TCGCTGAAAG AATCGCTCAATTAGGACACC ACCCCTTAGT CACTTTATCC GAAGCGCTCA AACTCACTCG TGTTAAAGAAGAAACTAAAA CGAGCTTCCA CTCTAAAGAC ATCTTTAAAG AAATTCTAGG CGATTACAAACACCTAGAAA AAGAATTTAA AGAGCTTTCT AACACCGCTG AAAAAGAAGG CGATAAAGTTACCGTAACTT ATGCGGACGA TCAATTGGCC AAGTTGCAAA AATCCATTTG GATGCTAGAAGCCCATTTAG CTCCGCAGGA TCCTCCGAAT TACCACCCAG CAAGCGAGAA AGTTCAAGCGTTAGATGAAA AGATTTTGCT TTTAAGGCCA GCTTTCCAAT ATAGCGATAA TATCGCTAAAGAGTATGAAA ACAAATTCAA GAATCAAACC GCGCTCAAGG TTGAACAGAT TTTGCAAAATCAAGGCTATA AGGTTATTAG GGTAGATAGC AGCGATAAAG ACGATTTTTC TTTTGCACAAAAAAAAGAAG GGTATTTGGC GGTTGCTATG AATGGCGAAA TTGTTTCACG CCCCGATCCTAAAAGGACCA TACAGAAAAA ATCAGAACCC GGGTTATTAT TCTCCACCGG TTTGGACAAAATGGAAGGGG TTTTAATCCC GGCTGGGTTT ATTAAGGTTC CTGCAGTACC TCCACCTGACACTTTGAATG AAGCTGGTTG TGTAGAAGAC ACTATGGCAG CTATTGCTGG GCGCACTATGCACACTTTCC ACACTGAAGG CGCTGGCGGC GGACACGCTC CTGATATTAT TAAAGTGGCCGGCGAACACA ACATTCTACC CGCTTCCACT AACCCCACTA TCCCTTTCAC TGTGAATACA
GAAGCAGAAC ACATGGACAT GCTTATGGTG TGCCACCACT TGGATAAAAG CATTAAAGAAGATGTTCAGT TCGCTGATTC AAGGATCCGC CCTCAAACCA TTGCGGCTGA AGACACTTTGCATGACATGG GGATTTTCTC AATCACCAGT TCTGACTCTC AAGCTATGGG TCGTGTGGGTGAAGTTATCA CTAGAACTTG GCAAACAGCT GACAAAAACA AAAAAGAATT TGGAGGCGGAAGTGGAGGAG GTAGTATTAA ATTAAAATTT GGTGTTTTTT TTACAGTTTT ACTATCTTCAGCATATGCAC ATGGAACACC TCAAAATATT ACTGATTTGT GTGCAGAATA CCACAACACACAAATATATA CGCTAAATGA TAAGATATTT TCGTATACAG AATCTCTAGC TGGAAAAAGAGAGATGGCTA TCATTACTTT TAAGAATGGT GCAATTTTTC AAGTAGAAGT ACCAGGTAGTCAACATATAG ATTCACAAAA AAAAGCGATT GAAAGGATGA AGGATACCCT GAGGATTGCATATCTTACTG AAGCTAAAGT CGAAAAGTTA TGTGTATGGA ATAATAAAAC GCCTCATGCGATTGCCGCAA TTAGTATGGC AAATTAA<210>20<211>1275<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NapA-HpaA-UreB414融合蛋白質(zhì)的DNA序列<400>20ATGAAAACAT TTGAAATTTT AAAACATTTG CAAGCGGATG CGATCGTGTT ATTTATGAAAGTGCATAACT TCCATTGGAA TGTGAAAGGC ACCGATTTTT TCAATGTGCA TAAAGCCACTGAAGAAATTT ATGAAGAATT TGCGGACATG TTTGATGATC TCGCTGAAAG AATCGCTCAATTAGGACACC ACCCCTTAGT CACTTTATCC GAAGCGCTCA AACTCACTCG TGTTAAAGAAGAAACTAAAA CGAGCTTCCA CTCTAAAGAC ATCTTTAAAG AAATTCTAGG CGATTACAAACACCTAGAAA AAGAATTTAA AGAGCTTTCT AACACCGCTG AAAAAGAAGG CGATAAAGTTACCGTAACTT ATGCGGACGA TCAATTGGCC AAGTTGCAAA AATCCATTTG GATGCTAGAAGCCCATTTAG CTCCGCAGGA TCCTCCGAAT TACCACCCAG CAAGCGAGAA AGTTCAAGCGTTAGATGAAA AGATTTTGCT TTTAAGGCCA GCTTTCCAAT ATAGCGATAA TATCGCTAAAGAGTATGAAA ACAAATTCAA GAATCAAACC GCGCTCAAGG TTGAACAGAT TTTGCAAAATCAAGGCTATA AGGTTATTAG CGTAGATAGC AGCGATAAAG ACGATTTTTC TTTTGCACAAAAAAAAGAAG GGTATTTGGC GGTTGCTATG AATGGCGAAA TTGTTTCACG CCCCGATCCTAAAAGGACCA TACAGAAAAA ATCAGAACCC GGGTTATTAT TCTCCACCGG TTTGGACAAAATGGAAGGGG TTTTAATCCC GGCTGGGTTT ATTAAGGTTC CTGCAGTACC TCCACCTGACACTTTGAATG AAGCTGGTTG TGTAGAAGAC ACTATGGCAG CTATTGCTGG GCGCACTATGCACACTTTCC ACACTGAAGG CGCTGGCGGC GGACACGCTC CTGATATTAT TAAAGTGGCCGGCGAACACA ACATTCTACC CGCTTCCACT AACCCCACTA TCCCTTTCAC TGTGAATACAGAAGCAGAAC ACATGGACAT GCTTATGGTG TGCCACCACT TGGATAAAAG CATTAAAGAAGATGTTCAGT TCGCTGATTC AAGGATCCGC CCTCAAACCA TTGCGGCTGA AGACACTTTGCATGACATGG GGATTTTCTC AATCACCAGT TCTGACTCTC AAGCTATGGG TCGTGTGGGTGAAGTTATCA CTAGAACTTG GCAAACAGCT GACAAAAACA AAAAAGAATT TGGAGGCGGAAGTGGAGGAG GTAGT
權(quán)利要求
1.由作為基本活性成分的單獨(dú)的幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)或幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)與粘附素HpaA、尿素酶B亞單位活性片段構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)，以及有一種或多種醫(yī)藥上可接受佐劑和賦形劑構(gòu)成的重組疫苗組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組疫苗組合物，其中所述的佐劑是分子內(nèi)佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組疫苗組合物，其中所述的佐劑選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、霍亂毒素CT或其B亞單位(CTB)。
4.制備權(quán)利要求1的重組疫苗組合物的方法，該方法包括以下步驟(1)分別提供編碼中性粒細(xì)胞激活蛋白NapA、粘附素HpaA和尿素酶B亞單位活性片段的核苷酸序列，(2)在DNA連接酶的存在下，按適當(dāng)次序連接步驟(1)的核苷酸序列，得到融合基因序列，(3)用步驟(2)的融合基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在適于表達(dá)所述融合基因的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，(4)回收并純化步驟(3)的融合蛋白質(zhì)，(5)加入一種或多種載體或賦形劑，得到所需的重組疫苗組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的重組疫苗組合物用于誘導(dǎo)抗幽門螺桿菌的特異性保護(hù)性免疫反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)抗原的重組疫苗、其制備方法及其誘導(dǎo)抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。該疫苗由作為基本活性成分的單獨(dú)的幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)，或幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)與粘附素HpaA、尿素酶B亞單位活性片段(UreB414)構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受佐劑和賦形劑組成。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1899610SQ200610054468
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者鄒全明, 高原, 楊珺, 張衛(wèi)軍, 毛旭虎, 郭剛, 吳超, 石云 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)