專利名稱：靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶pkr的寡核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療慢性粒細(xì)胞白血病的核苷酸序列，特別涉及一種靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸及其在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的發(fā)生是由于t(9；22)(q34；q11)所致的BCR-ABL融合基因編碼產(chǎn)生了具有強(qiáng)烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，該融合蛋白激活PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activatorof transcription)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。目前治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物主要有各種化療藥，這些藥物對(duì)全身各個(gè)系統(tǒng)的毒副作用較大，病人難以堅(jiān)持。針對(duì)BCR-ABL融合蛋白的治療取得了一些進(jìn)展，尤其以STI571(商品名Glivec)的作用最為顯著。然而，隨著STI571的使用，臨床出現(xiàn)耐藥和對(duì)其先天不敏感的病人，為此，本發(fā)明立足對(duì)CML治療現(xiàn)狀研究，開發(fā)了新的治療手段。
雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent proteinkinase，PKR)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)、雙鏈RNA調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白激酶。它是細(xì)胞被某些病毒感染后反應(yīng)性防御機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵性成分，在正常細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等生理、病理過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。它能被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)而被雙鏈RNA所激活，激活過程包括雙鏈RNA分子對(duì)PKR單體的募集及結(jié)合、兩分子PKR單體同源二聚化及相互使對(duì)方磷酸化等一系列反應(yīng)。PKR一經(jīng)激活便具有很強(qiáng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成啟動(dòng)因子eIF2的α亞單位上加上磷酸基團(tuán)，并導(dǎo)致GDP-GTP交換因子eIF2B的隱蔽，從而抑制細(xì)胞內(nèi)總體蛋白合成的啟動(dòng)。同時(shí)，活性PKR還激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應(yīng)共同作用導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。有資料表明，激活的PKR可誘導(dǎo)某些病毒感染細(xì)胞凋亡和多種正常細(xì)胞及病理細(xì)胞的凋亡，而被認(rèn)為是一種抑癌蛋白。在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)PKR的表達(dá)及活性增高是目前腫瘤生物治療研究領(lǐng)域的新動(dòng)向，目前還沒有通過激活PKR誘導(dǎo)急變期CML癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療目的基因的報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及攜帶有該寡核苷酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體，本發(fā)明的目的還在于提供該寡核苷酸序列在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
具體技術(shù)方案如下一種靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。
一種載體，其特征是攜帶有如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，并引入了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因其轉(zhuǎn)染效率高而最常使用，也可使用其他的載體，如質(zhì)粒、腺病毒等。
本發(fā)明的核心是通過設(shè)定的寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，利用載體攜帶該寡核苷酸序列，為了能測(cè)定該序列、便于追蹤觀察，便于觀察實(shí)驗(yàn)過程中病毒載體的感染效率，載體上還引入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)，達(dá)到雙表達(dá)的效果。向急變期慢粒白血病K562細(xì)胞株轉(zhuǎn)入這種特殊設(shè)計(jì)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以在K562細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并與BCR-ABLmRNA雜交形成足夠長(zhǎng)度的雙鏈RNA，特異性激活PKR，PKR一經(jīng)激活便具有很強(qiáng)的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，高效地在蛋白合成啟動(dòng)因子eIF2的α亞單位上加上磷酸基團(tuán)，并導(dǎo)致GDP-GTP交換因子eIF2B的隱蔽，從而抑制細(xì)胞內(nèi)總體蛋白合成的啟動(dòng)。同時(shí)，活性PKR還激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應(yīng)共同作用導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，而對(duì)機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞沒有任何影響。最重要的是在設(shè)計(jì)寡核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO2時(shí)，為了為防止轉(zhuǎn)錄過早終止，其中一對(duì)核苷酸T-A(斜體下劃線標(biāo)記)被更換為C-g，實(shí)驗(yàn)證明單個(gè)堿基對(duì)的誤配不會(huì)影響雙鏈RNA對(duì)蛋白激酶PKR的激活，相反，如不誤配，轉(zhuǎn)錄會(huì)過早終止，無法進(jìn)行下一步的制備。同時(shí)SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的長(zhǎng)短也必須限制，過長(zhǎng)過短都將影響PKR的激活。
應(yīng)用該策略治療腫瘤有兩個(gè)前提條件①靶細(xì)胞需有PKR蛋白的表達(dá)。②需要有效的手段激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)PKR，而正常組織細(xì)胞內(nèi)PKR不受影響。首先，CML細(xì)胞中BCR-ABL融合基因的形成及繼發(fā)性遺傳學(xué)改變并沒有影響PKR的生成。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，無論是慢性期還是急變期的CML細(xì)胞都表達(dá)PKR。其次，由于PKR能被雙鏈RNA分子所激活，而雙鏈RNA分子的長(zhǎng)度決定了其對(duì)PKR的激活能力(要求30-85bp)，太短不能有效結(jié)合兩分子PKR，太長(zhǎng)也會(huì)由于形成空間結(jié)構(gòu)等原因影響對(duì)PKR的激活。由于CML細(xì)胞內(nèi)有獨(dú)特的BCR-ABL融合基因，會(huì)轉(zhuǎn)錄出BCR-ABL mRNA，因此我們針對(duì)此融合部位設(shè)計(jì)一段SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(其中20nt針對(duì)BCR區(qū)，20nt針對(duì)ABL區(qū))，在CML細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的反義RNA短片段將可以與BCR-ABLmRNA雜交形成40bp的雙鏈RNA，進(jìn)而特異性激活PKR；但在正常細(xì)胞內(nèi)只能形成20bp(BCR區(qū)或ABL區(qū))的雙鏈RNA，長(zhǎng)度不足以激活PKR，故對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。
本發(fā)明以慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑧?yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)血液學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等方法，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明了靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用。包含特定長(zhǎng)度的基因序列，靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和病毒包裝和K562細(xì)胞感染。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因其轉(zhuǎn)染效率高而最常使用，也可以選擇其他的載體，如質(zhì)粒、腺病毒等。
構(gòu)建該寡核苷酸及載體所用的pMSCV-neo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體購于美國BD公司，IRES2-EGFP質(zhì)粒載體購于美國BD公司，pSilencer3.1-H1載體購自美國Ambion公司。根據(jù)BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號(hào)AJ131466)融合位點(diǎn)左右各20bp序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。序列兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，為防止轉(zhuǎn)錄過早終止，其中一對(duì)核苷酸T-A(斜體下劃線標(biāo)記)被更換為C-g(單個(gè)堿基對(duì)的誤配不會(huì)影響雙鏈RNA對(duì)蛋白激酶PKR的激活)。該寡核苷酸均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司人工合成，溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 具體來講，制成攜帶特定序列、特定長(zhǎng)度寡核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體大致可包括以下步驟 1)pH1-BCR-ABL40as重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 2)pMSCVeGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定 3)pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重組逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 4)病毒包裝及滴度測(cè)定 通過以上步驟制得病毒毒液命名為RV-GFP(pMSCVeGFP經(jīng)過細(xì)胞包裝獲得的含有熒光蛋白基因的病毒液)、RV-40AS(pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經(jīng)過細(xì)胞包裝獲得的含有熒光蛋白基因和本發(fā)明核苷酸序列的病毒液)。
本發(fā)明的有益效果是攜帶特定序列、特定長(zhǎng)度寡核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將外源性基因?qū)肼粤＜?xì)胞白血病K562細(xì)胞，通過靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞蛋白激酶PKR，抑制細(xì)胞內(nèi)總體蛋白合成并能激活促凋亡因子NF-κB、Caspase8等，兩種效應(yīng)共同作用導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，而對(duì)機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞沒有任何影響。將上述有效活性成分制成臨床上所需的藥物，能有效的治療慢性粒細(xì)胞白血病，填補(bǔ)了慢性粒細(xì)胞白血病治療上的又一空白。
為了證實(shí)攜帶有該核苷酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組試驗(yàn)分為RV-GFP、RV-40AS(本發(fā)明組)、RV-40AS+2AP(2AP二氨基嘌呤，是PKR的抑制劑)、polyIC(聚肌苷酸-聚胞啶酸一種RNA雙鏈的類似物，作為PKR非特異性激活組)和未處理組。所做實(shí)驗(yàn)方法如下 1、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染實(shí)驗(yàn) 收集RV-GFP和RV-40AS病毒上清，經(jīng)0.45μm醋酸纖維素膜過濾后，分別以兩種上清重懸提前離心收集的K562細(xì)胞，以6×105/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)加polybrene(聚凝胺，其帶正電可和帶負(fù)電的DNA分子結(jié)合，使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面，終濃度為4μg/mL)，37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫孵箱中培養(yǎng)；ECV304細(xì)胞提前24h接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×105/孔，以病毒濾液替換板孔中培養(yǎng)基，同時(shí)加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，轉(zhuǎn)移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫孵箱中培養(yǎng)。感染12h后開始用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，確定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染了K562細(xì)胞。
2、polyIC的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 參照DMRIE-C試劑說明書RNA轉(zhuǎn)染步驟，分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞。polyIC的轉(zhuǎn)染濃度為0.5~25μg/ml。
1)polyIC轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞 在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加無血清RPMI 1640 400μl/孔，吸取混勻的脂質(zhì)體DMRIE-C 0.5~5.0μl加入各孔，迅速輕輕的搖蕩，混勻；再吸取一定量poly IC加入各孔，使其終濃度為0.5~20μg/ml，迅速輕輕的搖蕩，使液體混勻；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞數(shù)量達(dá)到6×105/孔，800rmp/min×10min離心，棄上清，用無血清RPMI 1640洗滌細(xì)胞兩次，棄上清；用上述DMRIE-C/poly IC混和液輕輕重懸K562細(xì)胞，并將該細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，加入15％FCS RPMI 1640 800μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。
2)polyIC轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞 提前24小時(shí)在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種1.5×105個(gè)ECV304細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，加入無血清RPMI 1640，沖洗細(xì)胞兩次。配制轉(zhuǎn)染混合液400μl無血清RPMI 1640中加入混勻的脂質(zhì)體DMRIE-C 0.5~5.0μl，迅速輕輕的搖蕩，混勻；吸取一定量polyIC加入各孔，使其終濃度為0.5~20μg/ml，迅速輕輕的搖蕩，使液體充分混勻；將轉(zhuǎn)染混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移入37℃，5％CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，加入15％FCS RPMI 1640800μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。
從以下各個(gè)指標(biāo)來觀察、檢測(cè)，證實(shí)感染了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的K562細(xì)胞的抑制和凋亡 1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) 用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。取潔凈載玻片及有孔濾紙，置于離心杯中。將離心杯置于離心機(jī)上，加50~100μL細(xì)胞懸液于離心杯中。離心，1000~1500rpm 2min，取出玻片。滴加等量的瑞氏染液和PBS，室溫染色10~15min，流水沖洗。晾干，顯微鏡觀察并照相。
附圖6.逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響瑞氏染色48h后用光學(xué)顯微鏡觀察，RV-40AS和polyIC處理組細(xì)胞表現(xiàn)明顯的細(xì)胞胞體縮小，胞膜皺縮，泡狀突起及不規(guī)則凹陷，核固縮，染色質(zhì)濃聚，成塊并分布于核膜周邊，如附圖6所示AUntreated group.BpolyIC treated group.CRV-40AStreated group.DRV-GFP treated group.ERV-40AS+2AP treated group.。
2、生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組RV-GFP、RV-40AS、RV-40AS+2AP、polyIC處理組和未處理組；同時(shí)以ECV304細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞株。每組做3個(gè)平行孔。K562細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于24孔板，ECV304細(xì)胞鋪板2×103/孔。然后分別加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染細(xì)胞，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定使其終濃度為5×105CFU/mL。同時(shí)加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，此外，PKR抑制劑處理組(RV-40AS+2AP組)還需加入PKR抑制劑2AP(終濃度5mmol/L)；polyIC處理組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定終濃度為15μg/mL，接種后常規(guī)培養(yǎng)，3~5天后給沒計(jì)數(shù)的孔離心換液，連續(xù)7天以臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，每次計(jì)數(shù)重復(fù)3次，以平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
附圖7、8.生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)通過生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)polyIC對(duì)K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)都具有抑制作用，病毒RV-40AS僅對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有特異的抑制效應(yīng)，而2AP能阻斷RV-40AS對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。RV-GFP既不能抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)也不能抑制ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖7、8和表1、2所示。
表1不同因素處理后不同時(shí)間的K562細(xì)胞數(shù)(×104) 表2不同因素處理后不同時(shí)間的ECV304細(xì)胞數(shù)(×103) 3、MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板(2×104/孔)，ECV304細(xì)胞頭天鋪板4×103/孔。實(shí)驗(yàn)分組同上，每組做3個(gè)平行孔。然后分別加入病毒上清RV-40AS、RV-GFP感染細(xì)胞，使其終濃度為5×105CFU/mL。同時(shí)加入polybrene(終濃度為4μg/mL)，此外，PKR抑制劑處理組(RV-40AS+2AP組)還需加入PKR抑制劑2AP(終濃度5mmol/L)；polyIC處理組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，終濃度為15μg/mL。每孔總體積200μL，試劑空白以RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足。置37℃，含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，在每孔中加入20μL四甲基偶氮唑鹽(MTT，濃度5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，K562細(xì)胞1000g離心10min，小心棄去上清，ECV304細(xì)胞，直接傾去上清，加入二甲基亞砜150μL，振蕩5min，用酶標(biāo)儀在570nm處讀取吸光度值(A值)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率
MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到不同濃度RV-40AS對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率不同，如附圖5所示，可以看出病毒上清RV-40AS感染細(xì)胞的終濃度為5×105CFU/mL。
附圖9.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)polyIC對(duì)K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞的增殖都具有明顯的抑制作用，增殖抑制率分別為59.1％和56.3％，病毒RV-40AS感染K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其僅對(duì)K562細(xì)胞的增殖具有特異的抑制效應(yīng)，增殖抑制率為73.4％。而2AP能阻斷RV-40AS對(duì)K562細(xì)胞的抑制效應(yīng)。RV-GFP對(duì)K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞的增殖都沒有明顯的抑制效應(yīng)。如表3和圖9所示 表3不同因素處理后對(duì)K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)(抑制率％) 4、克隆形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同上，每組做3個(gè)平行孔。將經(jīng)過病毒上清(終濃度為5×105CFU/mL)處理、polyIC(終濃度為15μg/mL)轉(zhuǎn)染6h的K562細(xì)胞以及空白對(duì)照K562細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用20％的RPMI-1640培養(yǎng)液逐步稀釋成1×103/ml，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，加0.4ml細(xì)胞懸液，于24孔板，然后加0.3ml 2.7％甲基纖維素混勻。總體積為1ml，不足以20％的RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育10天，顯微鏡下計(jì)數(shù)，取直徑大于75um或細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的為一個(gè)集落，計(jì)算克隆抑制率
附圖10、11.克隆形成實(shí)驗(yàn)用RV-40AS(C組)、RV-GFP(D組)、RV-40AS+2AP(E組)、polyIC(B組)，處理K562細(xì)胞后，A組為未處理組其中只有PolyIC和RV-40AS處理組細(xì)胞克隆形成能力受到明顯抑制，抑制率分別為53.1％、75.3％。結(jié)果如表4、圖10，圖11所示。
表4不同因素處理后抑制K562細(xì)胞克隆的形成(抑制率％) 5、Annexin V-PE/7AAD雙染法檢測(cè)凋亡 離心收集1×106經(jīng)處理的K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞，冰冷PBS洗滌兩次后重懸于100μl反應(yīng)緩沖液中，加入5μl Annexin V-PE、10μl7AAD，輕輕混勻，避光保存20min，加入200μl緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如附圖12～14 AUntreated group.BRV-40AS treated group.CpolyIC treated group.DRV-40AS+2AP treated group.ERV-GFP treated group 附圖12所示實(shí)驗(yàn)各組K562細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)FL2代表PE標(biāo)記的Annexin-V熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表7AAD熒光強(qiáng)度。依據(jù)FL2及FL3將FCM分成4個(gè)區(qū)，LL代表活細(xì)胞，LR代表早期凋亡細(xì)胞，UR、ML分別代表晚期凋亡和死細(xì)胞。未處理組中的K562細(xì)胞大部分都是活細(xì)胞，24h早期凋亡細(xì)胞占3.24±0.66％，polyIC和RV-40AS處理后引起了K562細(xì)胞的凋亡，24h早期凋亡率分別為20.56±1.56％和22.70±1.42％，RV-40AS+2AP和RV-GFP處理基本未引起K562細(xì)胞凋亡，24h早期凋亡細(xì)胞分別為3.16±1.16％和2.98±0.92；而ECV304細(xì)胞組只有polyIC引起了凋亡，24h早期凋亡細(xì)胞占18.91±2.04％，如圖13所示。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)RV-40AS引起的凋亡效應(yīng)具有時(shí)間依賴性在12h、24h、36h和48h時(shí)早期凋亡率分別達(dá)到10.43±2.68％、22.70±1.42％、33.50±1.55％和39.51±1.72％，如圖14所示。結(jié)果表明polyIC可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞和ECV304細(xì)胞發(fā)生凋亡，RV-40AS處理后只引起了K562細(xì)胞的凋亡，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率逐漸升高，但RV-GFP感染對(duì)兩種K562和ECV304細(xì)胞都沒有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用；PKR抑制劑2AP可以有效抑制RV-40AS感染所致的K562細(xì)胞凋亡。
6、電鏡檢查細(xì)胞凋亡 分別收集1×106經(jīng)RV-40AS處理的K562細(xì)胞以及未處理K562細(xì)胞(對(duì)照組)，PBS洗滌兩次，轉(zhuǎn)入1.5mlEP管中，加4％戊二醛1ml，固定60min，1000rpm/min離心10min，PBS洗滌。1％鋨酸固定1h，系列丙酮脫水50％丙酮溶液1次，10min；70％丙酮溶液1次，10min；90％丙酮溶液2次，每次10min；100％丙酮溶液3次，每次10min。618環(huán)氧樹脂包埋，光鏡定位，超薄切片做成銅網(wǎng)；經(jīng)醋酸鈾，枸櫞酸鉛雙重電子染色；在Hitachi-600透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器及細(xì)胞核的變化并照相。
附圖15 K562細(xì)胞電鏡檢查結(jié)果見附圖15 未處理組(A)組K562細(xì)胞體積較大，核膜完整、核仁清楚、染色質(zhì)豐富，核漿比例大。RV-40AS處理后24h觀察到凋亡細(xì)胞，其體積縮小，細(xì)胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)明顯減少(如B圖)。胞漿電子密度增高，染色質(zhì)濃集，核固縮、核分裂等形態(tài)學(xué)改變(如C圖)。并可見凋亡小體(如D圖)。
7、細(xì)胞凋亡DNA梯帶的觀察 1)將5×105細(xì)胞移人無菌的1.5ml EP管中，4℃2000rpm/min離心5分鐘，棄上清。冰冷PBS洗滌細(xì)胞一次，離心，棄上清； 2)加入20μl消化緩沖液，用移液管尖混勻細(xì)胞沉淀，68℃水浴1h，4000rpm×5min，收集上清； 3)上清中加入RNA酶A(終濃度100μl/ml)輕彈管尖混勻，56℃水浴2h； 4)繼續(xù)加入1蛋白酶K(終濃度20mg/ml)，輕彈管尖混勻，37℃水浴2h； 5)DNA電泳配制1.5％瓊脂糖，加入EB(終濃度為0.5μg/ml)；取DNA樣品20μL加5μl 6×DNA加樣緩沖液(30％甘油，0.25％溴酚藍(lán))混勻，上樣；Marker為TIANGEN公司MD100-MarkerIII，3V/cm電泳3～4h后，凝膠成像儀觀察、照相分析。
附圖16 DNA ladder實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果顯示polyIC(3)及RV-40AS(2)處理48小時(shí)后出現(xiàn)典型的“梯狀”條帶，而未處理組(1)、RV-40AS+2AP(4)處理組和RV-GFP(5)處理組細(xì)胞DNA電泳相應(yīng)位置未見條帶出現(xiàn)。
8、細(xì)胞周期測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分組同上，用病毒上清或polyIC處理1×106個(gè)K562細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，PBS洗兩次后，70％乙醇中固定過夜，上機(jī)前洗去乙醇，加入PCB溶液低滲處理室溫30分鐘，離心去上清，加入50μg/ml RNAse A消化30分鐘，再加入終濃度為50μg/ml的PI染液室溫避光孵育25分鐘，用FCM檢測(cè)。
附圖17.逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)K562細(xì)胞周期的影響K562細(xì)胞的細(xì)胞周期分析結(jié)果如附圖17所示，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)代表PI強(qiáng)度，與細(xì)胞DNA含量成正比，依據(jù)PI熒光強(qiáng)度可以分為二倍體的G0/G1期，四倍體的G2/M期，及位于兩者之間的S期。各組處理細(xì)胞24h后，與未處理(A組)細(xì)胞相比，RV-40AS(B)組和polyIC(C)組G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果如表5所示。提示RV-40AS和polyIC處理后阻滯了細(xì)胞周期由G0/G1期向S期推進(jìn)。RV-GFP(D組)未明顯影響細(xì)胞周期進(jìn)程。2AP(E組)能逆轉(zhuǎn)RV-40AS對(duì)K562細(xì)胞周期的影響。
表5不同因素處理對(duì)K562細(xì)胞周期的影響(％) *P＜0.05，V.s untreated group；**P＜0.05，V.s RV-40AS group 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果用x±s表示，以SPSS10.0軟件分析，多組數(shù)據(jù)間用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。



附圖1 pH1-BCR-ABL40as測(cè)序結(jié)果圖 附圖2 pMSCVeGFP測(cè)序結(jié)果圖 附圖3 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS測(cè)序結(jié)果圖 附圖4 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經(jīng)過細(xì)胞包裝獲得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3細(xì)胞的效率分析結(jié)果圖(倒置熒光顯微鏡×200) 附圖5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度RV-40AS對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率 附圖6 實(shí)驗(yàn)各組對(duì)K562細(xì)胞影響的形態(tài)學(xué)觀察(普通顯微鏡×1000，瑞氏染色) 附圖7 K562細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖 附圖8 ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖 附圖9 MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)K562細(xì)胞各組和ECV304細(xì)胞增殖的抑制率 附圖10 不同因素對(duì)K562細(xì)胞克隆形成能力抑制的直方圖 附圖11 不同因素對(duì)K562細(xì)胞克隆形成能力抑制的細(xì)胞集落形態(tài)圖(倒置顯微鏡×100) 附圖12 實(shí)驗(yàn)各組K562細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果圖 附圖13 實(shí)驗(yàn)各組K562細(xì)胞凋亡的直方圖 附圖14 實(shí)驗(yàn)各組K562細(xì)胞凋亡效應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系圖 附圖15 RV-40AS引起K562細(xì)胞凋亡的電鏡檢查結(jié)果 附圖16.DNA ladder實(shí)驗(yàn) 附圖17.實(shí)驗(yàn)各組K562細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果圖 具體實(shí)施例(共5例) 實(shí)施例1 pH1-BCR-ABL40as重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 1.1 pH1-BCR-ABL40as插入片段的獲得 設(shè)計(jì)兩端分別含有限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII位點(diǎn)的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。將1OD的各片段溶解于50μL退火緩沖液(10mM Tris，pH7.5～pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)中，充分顛倒混勻后，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2各取10μL到40as管，放置于沸水中，自然冷卻退火成雙鏈，放4℃用于連接反應(yīng)。
1.2.酶切及回收 試劑盒提取質(zhì)粒pSilencer3.1-H1，按下表6加入試劑酶切質(zhì)粒。
將反應(yīng)物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
1.3.連接 通過SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)核酸含量為pSilencer3.1-H1質(zhì)粒純化產(chǎn)物110ng/μL。根據(jù)外源片段∶載體的摩爾比＝6∶1的原則，按以下公式計(jì)算連接反應(yīng)中外源片段與載體的含量
確定載體與插入片段的體積比為1∶5。按下表加入試劑，置PCR儀16℃連接過夜。
連接反應(yīng)體系(體積單位μL) 1.4.轉(zhuǎn)化 ●在無菌1.5mL EP管中加2μL質(zhì)粒、100μL E.coli DH5α感受態(tài)菌液，用吸頭輕輕混勻，冰上靜置30min。
●靜置37℃水浴，熱休克5min。
●立即放冰上靜置，1～2min后加800μL LB培養(yǎng)液。
●放37℃水浴，1h后12,000rpm瞬時(shí)離心30sec。
●棄去一半上清，將剩余的菌液混勻后，在含Amp(100μg/ml)的LB瓊脂平板上用無菌“L”玻棒將溶液均勻涂布于整個(gè)平板表面，37℃，2～3h，直至所有液體消失。
●隔夜或者12h后，接種環(huán)挑取陽性菌落，分區(qū)劃線分純陽性克隆菌，再挑取1～3個(gè)克隆LB AMP培養(yǎng)基中液體增菌。待提取質(zhì)粒鑒定后，菌液與50％甘油1∶1混和，-70℃保存，避免反復(fù)凍融。
1.5.鑒定 ●PCR鑒定 調(diào)取氨芐青霉素LB瓊脂平板上的可疑菌落作PCR鑒定。用無菌牙簽挑取部分菌體到含20μLLB的0.5ml無菌離心管中，再將離心管放入沸水5min后，轉(zhuǎn)置于冰上，以菌液為PCR模板進(jìn)行鑒定。以YP1為上游引物、SEQ ID 2為下游引物(表7)，PCR鑒定。 表7合成的寡核苷酸序列 ①PCR反應(yīng)體系 10×Buffer 3μL 2mM dNTP3μL 25mM MgCl2 1.8μL YP1(10pmol/μL) 3μL 40as2(10pmol/μL) 3μL 模板菌液1ul 1μL pfu Taq(5u/μL) 0.2μL Add ddH2O up to30μL 試劑全部加入到PCR管中，渦旋混勻后，12000rpm瞬時(shí)離心30sec，放入PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。
②PCR熱循環(huán)反應(yīng)條件 94℃ 5min 1cycle 94℃ 1min 54℃ 50sec 30cycles 72℃ 30sec 72℃ 5min 1cycle 熱循環(huán)完成后，12000rpm瞬時(shí)離心30sec，取4μL反應(yīng)產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。
●酶切鑒定 將可疑菌落細(xì)菌增菌后，試劑盒抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，方法同第2個(gè)步驟。酶切產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。
●測(cè)序鑒定 取陽性重組質(zhì)粒送上海Sangon公司作DNA測(cè)序鑒定。
pH1-BCR-ABL40as測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)分析完全正確，測(cè)序結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例2 pMSCVeGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定 2.1以引物Ec-GFP和Xh-GFP(表7)PCR擴(kuò)增IRES2-EGFP載體eGFP片段 ①PCR反應(yīng)體系 10×Buffer3μL 2mM dNTP 3μL 25mM MgCl2 1.8μL Ec-GFP(10pmol/μL)3μL Xh-GFP(10pmol/μL)3μL IRES2-EGFP0.2μL pfu Taq(5u/μL) 0.2μL Add ddH2O up to 30μL 試劑全部加入到100μLPCR管中，渦旋混勻后，12,000rpm瞬時(shí)離心30sec，放入PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。
②PCR熱循環(huán)反應(yīng)條件 94℃ 5min 1cycle 94℃ 1min 55℃ 50sec30cycles 72℃ 40sec 72℃ 5min 1cycle 熱循環(huán)完成后，12,000rpm瞬時(shí)離心30sec，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。
2.2 PCR純化產(chǎn)物(eGFP)及pMSCV-neo質(zhì)粒載體的酶切 按下表加入各反應(yīng)試劑。
將反應(yīng)物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
2.3連接 方法同1.3。
2.4轉(zhuǎn)化 按實(shí)驗(yàn)方法1.4進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
2.5鑒定 經(jīng)PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定，方法同前。pMSCVeGFP測(cè)序 結(jié)果經(jīng)過比對(duì)分析完全正確，測(cè)序結(jié)果見附圖2。
實(shí)施例3 pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS重組逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 3.1插入片段的獲取 由重組質(zhì)粒pH1-BCR-ABL40as PCR擴(kuò)增短片段RNA表達(dá)框H1-40as，引物sa和Hd見表7。
①PCR反應(yīng)體系 10×Buffer 3μL 2mM dNTP3μL 25mM MgCl2 1.8μL sa(10pmol/μL) 3μL Hd(10pmol/μL) 3μL 各質(zhì)粒模板 0.2μL Taq(5u/μL) 0.2μL 加ddH2O至 30μL 試劑全部加入到100μLPCR管中，渦旋混勻后，12,000rpm瞬時(shí)離心30sec，放入PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。
②PCR熱循環(huán)反應(yīng)條件 94℃ 5min1cycle 94℃ 1min 55℃ 50sec 30cycles 72℃ 40sec 72℃ 5min1cycle 熱循環(huán)完成后，12,000rpm瞬時(shí)離心30sec，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。
3.2pMSCVeGFP重組質(zhì)粒的酶切 按下表加入各反應(yīng)試劑。
將反應(yīng)物混合離心后置37℃水浴過夜。酶切完成后全部進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒膠回收。
3.3連接 方法同1.3。
3.4鑒定 經(jīng)PCR、酶切鑒定方法同前。
測(cè)序鑒定 因?yàn)镠140as片段插入位點(diǎn)在pMSCVneo載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)之外，無通用引物測(cè)序，所以我們另外設(shè)計(jì)測(cè)序引物YP2(表7)，送重慶醫(yī)科大學(xué)肝炎所測(cè)序中心測(cè)序。
pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS測(cè)序結(jié)果經(jīng)過比對(duì)分析完全正確，測(cè)序結(jié)果見附圖3。
實(shí)施例4 病毒包裝及滴度測(cè)定 按lipofectamin2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將各重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染48h后，培養(yǎng)基更換成含0.5mg/mL G418(GIBCO公司)的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每4d換液1次，篩選7～14d，挑取陽性細(xì)胞克隆PT67-MSCV/GFP和PT67-40as，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合時(shí)吸取培養(yǎng)基，離心取上清，各病毒毒液命名為RV-GFP、RV-40AS，以NIH3T3為靶細(xì)胞測(cè)定病毒滴度。倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)(綠色熒光)。病毒滴度(colony forming unit，CFU/mL)計(jì)算公式如下
將滴度大于5.0×105CFU/mL病毒上清保存于-80℃?zhèn)溆谩?br> pMSCVeGFP-H1-BCR-ABL40AS經(jīng)過細(xì)胞包裝獲得病毒液(RV-40AS)感染NIH3T3細(xì)胞的效率分析結(jié)果見附圖4(倒置熒光顯微鏡×200)。
實(shí)施例5 細(xì)胞的培養(yǎng) K562細(xì)胞系由本室常規(guī)凍存，復(fù)蘇后用含10％FCS的PRMI 1640液培養(yǎng)，培養(yǎng)于含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，常規(guī)換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)。
ECV304細(xì)胞系由本校超聲研究所馬芳博士惠贈(zèng)，復(fù)蘇后用含10％FCS的PRMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，隔日用0.25％胰酶消化換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24h接種細(xì)胞培養(yǎng)板。
序列表
<160>2
<210>1
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號(hào)AJ131466)融合位點(diǎn)左20bp序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，加下劃線的是誤配的堿基
<400>1
gatccactgg ccgctgaagg gcttctgaac tctgcttaaa tccttttttg gaaa 54
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)BCR-ABL b3a2型mRNA(GenBank登陸號(hào)
AJ131466)融合位點(diǎn)右20bp序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，加下劃線的是誤配的堿基
<400>2
agcttttcca aaaaaggatt taagcagagt tcagaagccc ttcagcggcc agtg 5權(quán)利要求
1.一種靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病蛋白激酶PKR的寡核苷酸，其序列是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。
2.一種載體，其特征是攜帶有如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸。
3如權(quán)利要求2所述的載體，其特征是引入了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征是用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體。
5.如權(quán)利要求2所述的載體在制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種靶向激活慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞蛋白激酶PKR的寡核苷酸序列及攜帶有該寡核苷酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體。根據(jù)BCR－ABL b3a2型mRNA融合位點(diǎn)左右各20bp序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列SEQ1和SEQ2，序列兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，為防止轉(zhuǎn)錄過早終止，其中一對(duì)核苷酸T－A被更換為C－g，向急變期慢粒白血病K562細(xì)胞株轉(zhuǎn)入這種特殊設(shè)計(jì)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以在K562細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并與BCR－ABL mRNA雜交形成足夠長(zhǎng)度的雙鏈RNA，靶向激活PKR，導(dǎo)致K562細(xì)胞的凋亡，而對(duì)機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞沒有任何影響。將有效成分核苷酸序列制成臨床所需的藥物，能有效的治療慢性粒細(xì)胞白血病，填補(bǔ)了醫(yī)學(xué)方面的又一個(gè)空白。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101054591SQ20061005459
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月13日
發(fā)明者馮文莉, 曾建明, 王小中 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)