專利名稱：一組具有抑制hiv－1/hbv病毒復(fù)制活性的替諾福韋單酯化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組替諾福韋(Tenofovir，PMPA)單酯化合物和上述單酯化合物與堿/酸的復(fù)合物；本發(fā)明還涉及所說化合物的合成方法以及在抗病毒方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
替諾福韋是非環(huán)核苷類抗病毒化合物，對逆轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)抑制作用，且與臨床上使用的其它核苷類藥物沒有交叉耐藥性。但是，強(qiáng)親水性的替諾福韋生物利用度差，影響其作為臨床藥物的開發(fā)。為提高其生物利用度，通常將它們制成酯類前藥。替諾福韋的異丙氧羰氧甲基酯的富馬酸復(fù)合物替諾福韋DF(WO99/05150)，作為HIV感染的治療藥物于2001年被FDA批準(zhǔn)上市，是迄今為止抗病毒活性最強(qiáng)、腎毒性又較低的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類AIDS治療藥物。替諾福韋DF口服生物利用度得到明顯改善，但吸收進(jìn)入體內(nèi)的替諾福韋DF，只有水解游離出活性結(jié)構(gòu)替諾福韋后才能發(fā)揮作用。
為了合成篩選既能改善脂溶性又保留原化合物活性的新型替諾福韋衍生物，本發(fā)明進(jìn)行了替諾福韋的磷酸單酯化合物合成與抗病毒活性研究，以期篩選得到新型抗病毒化合物。
有機(jī)堿性或酸性化合物成鹽后往往會改變其結(jié)晶性、溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)，成鹽后也會更便于制備制劑或給藥。為此，本發(fā)明進(jìn)行了替諾福韋的磷酸單酯化合物與堿/酸的鹽性復(fù)合物的制備以及抗病毒活性研究。
本發(fā)明所提供的替諾福韋磷酸單酯化合物及其與堿/酸的鹽性復(fù)合物，是迄今均未見有相關(guān)報道的新化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以替諾福韋為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行了磷酸長鏈單酯化合物的合成與抗病毒活性研究；還進(jìn)行了替諾福韋的磷酸長鏈單酯化合物與堿或酸的復(fù)合物(1∶1)的制備與抗病毒活性研究。體外試驗研究結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物均表現(xiàn)出抑制HIV-1病毒復(fù)制和抑制HBV病毒復(fù)制的活性，為今后深入研究與開發(fā)所說化合物的抗病毒應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供的一組具有抑制HIV-1/HBV病毒復(fù)制活性的替諾福韋單酯化合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示 其中，x＝0-8，y＝1-20。
本發(fā)明提供了替諾福韋單酯化合物藥學(xué)上可接受的鹽，如式(II)所示 其中，x＝0-8，y＝1-20，Base包括可與磷酸基酸根部分成鹽的氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和其他常見無機(jī)堿或有機(jī)胺；Acid包括可與嘌呤氨基堿基部分成鹽的鹽酸、硫酸、磷酸等常用無機(jī)酸，或富馬酸、乳酸、枸櫞酸等藥學(xué)上常用有機(jī)酸。
本發(fā)明提供了上述替諾福韋單酯化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其反應(yīng)式如下
其中x、y、Acid和Base同上；M為鹵素、甲烷磺酸基、對甲苯磺酸基。
該制備方法包括的步驟如下用替諾福韋為原料，在堿性試劑(如碳酸鈉、氫化鈣、三乙胺、吡啶或4-N，N-二甲基吡啶)作用下，與鹵代或磺酸氧基代側(cè)鏈縮合，得到替諾福韋單酯化合物(I)，再與酸或堿反應(yīng)，得到替諾福韋單酯化合物的鹽(II)。
其中，起始原料替諾福韋參照文獻(xiàn)(Antonin Holy，Collect.Czech.Chem.Commun.，1197-1211，1995)合成得到；側(cè)鏈MCH2(CH2)xCH2OCH2(CH2)yCH3參照文獻(xiàn)(Susumu Tsushima，Chem.Pharm.Bull.30(9)32603270，1982)合成得到。
本發(fā)明提供的上述化合物的藥物組合物，可以含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明提供了所說化合物和藥物組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的上述藥物組合物的各種劑型，可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明提供上述藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-99.5％的活性成分。
發(fā)明效果按照以上所說路線和方法，能夠穩(wěn)定、可重復(fù)性地合成得到本發(fā)明化合物。
本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)法測定了本發(fā)明化合物的體外抗病毒活性和抗病毒譜，結(jié)果表明，本發(fā)明化合物對逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-1和HBV的抑制作用較強(qiáng)，各化合物的活性測定結(jié)果如表1所示。其中，16烷氧基乙基/丙基酯和18烷氧基乙基/丙基酯的抗HIV-1和抗HBV活性均強(qiáng)于前體物替諾福韋，14烷氧基乙基/丙基酯的抗HIV-1活性較替諾福韋強(qiáng)，但抗HBV活性弱于或相當(dāng)于替諾福韋。
表1發(fā)明化合物的抗病毒活性


具體實施例方式以下實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。所有化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H NMR或MS所確定。
實施例1(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(5)的制備將(R)-9-[2-(磷酸甲氧)丙基]腺嘌呤1.44g(PMPA 5.0mmol)、DMF20ml、1-溴-3-十六烷氧丙烷1.82g(5.0mol)、三乙胺0.61g(6.0mmol)混合，加熱至80℃攪拌反應(yīng)6h，旋干后得黃色油狀物，加入二氯甲烷和甲醇為1∶1的混合溶劑100ml充分溶解后過濾，濾液旋干，殘余物硅膠柱層析分離后得到淺黃色固體2.04(71.5％)。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.838(3H，t，CH3)，0.919-0.933(3H，d，CH3)，1.134-1.225(26H，m，13×CH2)，1.414-1.475(2H，m，CH2)，1.606-1.638(2H，m，CH2)，3.128-3.416(6H，m，3×OCH2)，3.642(2H，s，OCH2P)，3.837-3.850(1H，m，CH)，4.084-4.269(2H，m，NCH2)，7.109(2H，s，NH2)，8.098、8.345(2H，s，分別為嘌呤環(huán)上的H)。
實施例2(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富馬酸鹽(6)的制備將等量的(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤和富馬酸溶于熱的異丙醇攪拌0.5h，室溫下冷卻析晶，濾出析出的固體并用乙醚洗滌得白色固體。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.833(3H，t，CH3)，0.910-0.926(3H，d，CH3)，1.136-1.219(26H，m，13×CH2)，1.428-1.476(2H，m，CH2)，1.601-1.630(2H，m，CH2)，3.127-3.419(6H，m，3×OCH2)，3.642(2H，s，OCH2P)，3.835-3.853(1H，m，CH)，4.096-4.267(2H，m，NCH2)，6.63(2H，s，富馬酸雙鍵上的H)，6.998(2H，s，NH2)，8.103、8.339(2H，s，分別為嘌呤環(huán)上的H)。
實施例3(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽(7)的制備將等量的(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤和NaOH溶于水?dāng)嚢?.5h，冷凍干燥得白色絮狀固體。
實施例4(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤組氨酸鹽(8)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤組氨酸鹽。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.833(3H，t，CH3)，0.910-0.926(3H，d，CH3)，1.136-1.219(26H，m，13×CH2)，1.428-1.476(2H，m，CH2)，1.601-1.630(2H，m，CH2)，2.961-3.086(2H，m，組氨酸上CH2)，3.127-3.419(6H，m，3×OCH2)，3.642(2H，s，OCH2P)，3.835-3.853(1H，m，CH)，3.880(1H，t，組氨酸上CH)，4.096-4.267(2H，m，NCH2)，6.998(2H，s，NH2)，7.665、8.477(2H，s，組氨酸五元環(huán)上CH)，8.103、8.339(2H，s，分別為嘌呤環(huán)上的H)。
實施例5(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(1)的制備以實施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.838(3H，t，CH3)，0.944-0.955(3H，d，CH3)，1.151-1.227(22H，m，11×CH2)，1.379-1.394(2H，m，CH2)，1.637(2H，m，CH2)，3.196-3.416(6H，m，3×OCH2)，3.709(2H，s，OCH2P)，3.843-3.856(1H，m，CH)，4.138-4.209(2H，m，NCH2)，7.122(2H，s，NH2)，8.098(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例6(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鹽酸鹽(2)的制備以實施例2類似方法合成得到R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鹽酸鹽。
實施例7(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽(3)的制備以實施例3類似方法合成得到R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽。
實施例8(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤賴氨酸鹽(4)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十四烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤賴氨酸鹽。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.838(3H，t，CH3)，0.944-0.956(3H，d，CH3)，1.151-1.227(24H，m，12×CH2)，1.379-1.394(4H，m，2×CH2)，1.637(4H，m，2×CH2)，2.011(2H，t，賴氨酸上NH2)，2.570(2H，t，賴氨酸上NCH2)，3.196-3.416(6H，m，3×OCH2)，3.709(2H，s，OCH2P)，3.767(2H，t，賴氨酸上CH)，3.843-3.856(1H，m，CH)，4.138-4.209(2H，m，NCH2)，7.122(2H，s，NH2)，8.098(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例9(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(9)的制備以實施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.842(3H，t，CH3)，0.915(3H，d，CH3)，1.091-1.220(30H，m，15×CH2)，1.418-1.475(2H，m，CH2)，1.652(2H，m，CH2)，3.153-3.472(6H，m，3×OCH2)3.650(2H，s，OCH2P)，3.783(1H，m，CH)，4.338(2H，m，NCH2)，7.111(2H，s，NH2)，8.100、8.238(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例10(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽(10)的制備以實施例2類似方法合成得到R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽。
實施例11(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鉀鹽(11)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鉀鹽。
實施例12(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤賴氨酸鹽(12)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤賴氨酸鹽。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.841(3H，t，CH3)，0.947-0.958(3H，d，CH3)，1.149-1.228(32H，m，16×CH2)，1.381-1.396(4H，m，2×CH2)，1.638-1.960(4H，m，2×CH2)，2.013(2H，t，賴氨酸上NH2)，2.565(2H，t，賴氨酸上NCH2)，3.203-3.409(6H，m，3×OCH2)，3.707(2H，s，OCH2P)，3.758(2H，t，賴氨酸上CH)，3.839-3.849(1H，m，CH)，4.142-4.211(2H，m，NCH2)，7.119(2H，s，NH2)，8.081(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例13(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(13)的制備以實施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.823(3H，t，CH3)，0.943-0.946(3H，d，CH3)，1.087-1.216(22H，m，11×CH2)，1.420-1.455(2H，m，CH2)，3.147-3.465(6H，m，3×OCH2)，3.639(2H，s，OCH2P)，3.778(1H，m，CH)，4.327(2H，m，NCH2)，7.108(2H，s，NH2)，8.096、8.211(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例14(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽(14)的制備以實施例2類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸鹽。
實施例15(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽(15)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十四烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽。
實施例16(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(16)的制備以實施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.822(3H，t，CH3)，0.920-0.934(3H，d，CH3)，1.136-1.223(26H，m，13×CH2)，1.416-1.472(2H，m，CH2)，3.028-3.409(6H，m，3×OCH2)，3.645(2H，s，OCH2P)，3.836-3.852(1H，m，CH)，4.079-4.262(2H，m，NCH2)，7.102(2H，s，NH2)，8.097、8.333(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例17(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鉀鹽(17)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鉀鹽。
實施例18(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽(18)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十六烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤單鈉鹽。
實施例19(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(19)的制備以實施例1類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.828(3H，t，CH3)，0.918-0.930(3H，d，CH3)，1.091-1.220(30H，m，15×CH2)，1.420-1.466(2H，m，CH2)，3.039-3.411(6H，m，3×OCH2)，3.663(2H，s，OCH2P)，3.822-3.842(1H，m，CH)，4.068-4.257(2H，m，NCH2)，7.101(2H，s，NH2)，8.088、8.229(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例20(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽(20)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤鈉鹽。
實施例21(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤精氨酸鹽(21)的制備以實施例3類似方法合成得到(R)-9-[2-[(十八烷氧乙基)磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤精氨酸鹽。1HNMR(DMSO)δ，(ppm)0.828(3H，t，CH3)，0.918-0.930(3H，d，CH3)，1.091-1.220(30H，m，15×CH2)，1.420-1.466(4H，m，2×CH2)，1.781-1.853(4H，m，精氨酸上的NCH2)，3.039-3.411(6H，m，3×OCH2)，3.492(1H，t，精氨酸上的NCH)，3.663(2H，s，OCH2P)，3.822-3.842(1H，m，CH)，4.068-4.257(2H，m，NCH2)，7.101(2H，s，NH2)，7.822(1H，s，精氨酸上的NH)，8.088、8.229(2H，s，嘌呤環(huán)上的H)。
實施例22抗HBV病毒活性的測定采用細(xì)胞培養(yǎng)法，測定了本發(fā)明化合物在體外對乙肝病毒和HIV病毒復(fù)制的影響?？挂腋尾《净钚匝芯恐?，樣品細(xì)胞毒性試驗方法為將試驗細(xì)胞配制成每毫升10萬個細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔板每孔100μl，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，細(xì)胞長成單層后進(jìn)行實驗。目標(biāo)化合物和對照藥用培養(yǎng)液配制成所需濃度后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度4孔，每4天換同濃度藥液一次，同時設(shè)無藥物細(xì)胞對照組。以觀察細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，8天顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度。樣品抑制肝炎病毒活性試驗方法為每毫升10萬個試驗細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，加入藥物，同時設(shè)細(xì)胞對照組，4天換原濃度藥液或?qū)φ张囵B(yǎng)液一次。細(xì)胞裂解后按分子克隆實驗技術(shù)方法提取HBV DNA。各樣品斑點雜交、放射自顯影、測量各雜交點的A值后，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算細(xì)胞對照及給藥組的HBV DNA含量后，計算半數(shù)有效濃度(IC50)(表1)。
實施例23藥物在HIV-1IIIB慢性感染的H9細(xì)胞培養(yǎng)中抑制HIV-1P24抗原的作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)中加入8個不同稀釋濃度的藥液和陽性對照藥液，每個稀釋度重復(fù)2孔，設(shè)細(xì)胞對照；再將2×105細(xì)胞/ml 100μl接種于含藥96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。置37℃、5％CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。按HIV-1P24抗原試劑盒提供的操作步驟，測定加藥后第4天(96小時)細(xì)胞培養(yǎng)上清HIV-1 P24抗原含量，計算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)(表1)。
權(quán)利要求
1.一組替諾福韋單酯化合物，它具有抑制HIV-1/HBV病毒復(fù)制的活性，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示 其中，x＝0-8，y＝1-20。
2.權(quán)利要求1所述替諾福韋單酯化合物藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)如式(II)所示 其中x＝0-8，y＝1-20，Base包括可與磷酸基酸根部分成鹽的氫氧化鈉、氫氧化鉀、賴氨酸、組氨酸、精氨酸等；Acid包括可與嘌呤氨基堿基部分成鹽的鹽酸、硫酸、富馬酸等。
3.一種制備權(quán)利要求1所述式(I)化合物的方法，其反應(yīng)式如下 其中x、y、Acid和Base同上；M為鹵素、甲烷磺酸基、對甲苯磺酸基；該制備方法包括如下步驟用替諾福韋為原料，在堿性試劑如碳酸氧基代側(cè)鏈縮合，得到替諾福韋單酯化合物(I)。
4.一種制備權(quán)利要求2所述式(II)鹽的方法，其反應(yīng)式如下 其中，x、y、Acid和Base同上；該制備方法步驟是將得到的替諾福韋單酯化合物(I)與酸或堿反應(yīng)，即得到替諾福韋單酯化合物的鹽(II)。
5.權(quán)利要求1所述化合物的藥物組合物，可以含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
6.權(quán)利要求1所述化合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4所述組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述藥物組合物的各種劑型，可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
9.權(quán)利要求4所述藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-99.5％的活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組替諾福韋(Tenofovir，PMPA)單酯化合物、所說化合物與堿/酸的復(fù)合物以及該化合物的合成方法和在抗病毒方面的應(yīng)用，體外試驗研究結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物具有抑制HIV－1病毒復(fù)制和抑制HBV病毒復(fù)制的活性，為今后深入研究與開發(fā)所說化合物的抗病毒應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/00GK1810816SQ20061005692
公開日2006年8月2日 申請日期2006年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月7日
發(fā)明者李卓榮, 蔡步林, 彭宗根, 李玉環(huán), 陶佩珍 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所