專利名稱：一種9－蒽酮內酯類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosis glaucus HB1-19)(保藏編號是CCTCC M206022)生產9-蒽酮內酯類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑、抑制內皮細胞增殖劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
有關9-蒽酮類化合物的文獻報道較多，但這種9-蒽酮內酯的衍生物未見有報道。本發(fā)明人研究得知，灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosis glaucus HB1-19)(保藏編號是CCTCC M206022)液體發(fā)酵產物經超聲破碎后的粗提物經化學TLC和HPLC指紋圖譜檢測，發(fā)現醌類和酮類化合物含量豐富，遂對其化學成分進行了研究。研究發(fā)現所示9-蒽酮內酯類化合物具有細胞增殖抑制活性和抑制內皮細胞增殖、遷移活性，目前尚未見對該化合物的化學結構、細胞增殖抑制及內皮細胞增殖和遷移抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種結構獨特的具有抑制腫瘤細胞增殖及抑制內皮細胞增殖和遷移作用，具有抗腫瘤活性的新化合物。其結構式式I 其結構特征是含不飽和內酯環(huán)的9-蒽酮內酯，其中R-R5為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
本發(fā)明優(yōu)選的式I化合物其中R-R4為羥基、R5為氫。
本發(fā)明的式I化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取含有9-蒽酮內酯類化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中采用硅膠柱層析、制備HPLC等方法分離純化得到。
本發(fā)明的下述實施例中列舉了利用灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosis glaucus HB1-19)(保藏編號是CCTCC M 206022)制備本發(fā)明式I化合物的實例。
具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物I的化學結構 化合物I實施例1 化合物I的發(fā)酵生產及分離精制1 發(fā)酵生產生產菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosisglaucus HB1-19)(保藏編號是CCTCC M 206022)適量，接種到查氏固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取斜面培養(yǎng)4天的灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosis glaucus HB1-19)適量，接種到裝有100mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL錐型瓶中，在28℃、160轉/分鐘條件下搖床培養(yǎng)7天，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
2 浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共82.0克。
3 化合物的分離精制浸膏(82.0克)用氯仿-甲醇混合溶劑溶解后，加600克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為7個流份。Fr-4(41.0g，氯仿-甲醇20∶1洗脫物)，先后以氯仿-甲醇(1∶1)和甲醇為溶劑進行LH20柱層析，再經加壓硅膠柱層析以氯仿-甲醇(15∶1)為溶劑得化合物I(20mg)。
化合物I 橘紅色無定形固體，分子式C25H16O9，HR-ESI-MS m/z459.0725[M-H]-，計算值459.0716.UVλmaxnm(logε)in MeOH203(4.25)，235(4.19)，307(3.90)，431(3.61)。IRvmaxcm-1(KBr)3443，2955，2925，2854，1649，1632，1622，1557，1540，1507，1457，1441，1417，1393，1260，1205，1164，1098，1028，961.1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)δ7.25(1H，s)，6.27(1H，s)，6.94(1H，s)，6.50(1H，s)，6.11(1H，s)，2.46(3H，s)，2.56(3H，s)，10.39(1H，s)，11.30(1H，s)，12.39(1H，s)，12.91(1H，s).13C-NMR(150MHz，DMSO-d6)δ187.7(s)，165.6(s)，164.8(s)，162.9(s)，159.0(s)，158.9(s)，142.6(s)，136.2(s)，133.9(s)，122.1(d)，115.9(s)，114.9(s)，112.0(d)，110.9(d)，108.0(s)，107.8(s)，105.4(d)，100.7(d)，16.0(q)，23.2(q).
X-射線衍射結果實施例2 體外抗腫瘤活性的測試細胞增殖抑制活性測試1 實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制 測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物I純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng) 采用人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞及小鼠白血病P388細胞等癌細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃(P388細胞)或在37℃(A549、HL60及BEL-7402細胞)于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法麗絲胺羅丹明B(SRB)法 取對數生長期的人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養(yǎng)24小時(A549或BEL-7402細胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，繼而在4℃、3000轉/分鐘離心3分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結合染料并利用MD公司產SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔空白對照和無細胞調零孔(如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零)。各孔OD值先做相應無細胞調零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照X100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
四氮唑鹽(MTT)法 取對數生長期的人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞，將細胞密度調至每毫升2×105個細胞，按每孔200微升接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃通入5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37℃、2000轉/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結晶完全溶解后，利用MD公司產SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三孔，另設三孔空白對照和無細胞調零孔(如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零)。各孔OD值先做相應無細胞調零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照X100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
促內皮細胞增殖活性的測試1 實驗樣品及實驗方法
(1)測定內皮細胞增殖抑制作用取對數生長期的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，計數后埋96孔板，濃度為5000個/孔。用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37℃，5％CO2孵育48h。換用含1％胎牛血清的1640培養(yǎng)基，加藥，37℃，5％CO2繼續(xù)孵育48h。然后每孔加入20μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液(5mg/ml)，孵育4h。吸出MTT，加入150μl DMSO充分溶解；酶標儀490nm處測定吸光度。根據活性結果，研究該類化合物的構效關系。
(2)測定內皮細胞的遷移抑制作用先用10ug/ml纖粘蛋白(FN))70ul鋪96孔板，4℃冰箱過夜后，用PBS緩沖液洗去未結合的FN。取對數生長期的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，計數后埋96孔板，濃度為20,000個/孔。用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37℃，5％CO2孵育，至細胞生長融合。用200ul槍頭劃痕，無血清1640培養(yǎng)液沖洗2次，加藥100μl(含1％胎牛血清的1640培養(yǎng)液配藥)，顯微鏡下觀察劃痕情況，拍照。6h、12h、24h后重復照相.比較劃痕前后不同時間細胞的遷移。根據活性結果，研究該類化合物的構效關系。
2.實驗結果細胞增殖抑制活性測試結果在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I對人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞的增殖抑制結果見表2。
表2 不同濃度的化合物I對癌細胞增殖的抑制率(％)

促內皮細胞增殖活性的測試結果化合物I在10-6M濃度下，對人臍靜脈內皮細胞具有明顯的增殖抑制作用和遷移抑制活性。
3 結論化合物I具有明顯的腫瘤細胞增殖抑制作用及內皮細胞增殖和遷移抑制活性，可作為細胞增殖抑制劑、血管生成劑或抗腫瘤劑用于抗腫瘤的研究。
權利要求
1.式I化合物 式I其中R-R5為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
2.權利要求1所述的式I化合物，其中R-R4為羥基、R5為氫。
3.權利要求1所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)灰綠曲霉HB1-19(Aspergillosis glaucus HB1-19)，獲取含有上述式I的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物。
4.權利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為7個流份。氯仿-甲醇(20∶1)洗脫部分，再經反復硅膠柱層析和Sephadex LH20凝膠柱層析分離純化得式I化合物。
5.權利要求1所述的式I化合物在制備細胞增殖抑制劑中的用途。
6.權利要求1所述的式I化合物在制備血管生成抑制劑中的用途。
7.權利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種9－蒽酮內酯類化合物的制備方法和用途。本發(fā)明用采自海洋樣品中的灰綠曲霉HB1－19(Aspergillosis glaucus HB1－19)生產出結構新穎的9－蒽酮內酯類化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑、血管生成抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號A61P9/14GK1830973SQ20061006562
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月21日 優(yōu)先權日2006年3月21日
發(fā)明者劉紅兵, 杜林 , 朱偉明, 顧謙群, 朱天驕, 方玉春, 劉培培 申請人:中國海洋大學