專(zhuān)利名稱(chēng)：尼泊爾鳶尾異黃酮的提取方法、其衍生物和以該衍生物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的尼泊爾鳶尾異黃酮的提取方法，尼泊爾鳶尾異黃酮衍生物，以該衍生物為活性成分的藥物組合物，以及它們?cè)谥委熜?、腦血管病、骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葛花(Flos Puerariae)，又名葛條花，為豆科(Leguminosae)植物野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)的干燥花蕾。性涼，味甘，入歸陽(yáng)明經(jīng)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等記載其具有解酒醒脾之功效，主治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔逆吐酸、吐血、腸風(fēng)下血等癥。
葛花在我國(guó)分布廣泛，植物資源豐富，其中黃酮、皂苷等有效成分，有很強(qiáng)的藥理活性。但國(guó)內(nèi)對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用的研究還不夠深入，目前在我國(guó)主要有葛花解醒湯用于臨床，葛花茶、葛花露等保健品上市。主要局限于解酒、保肝藥等。
在公開(kāi)號(hào)為CN1723988A的專(zhuān)利文獻(xiàn)中，公開(kāi)了葛花苷的藥物組合物及其應(yīng)用。其中有關(guān)于葛花苷(葛花中主要活性成分之一kakkalide，5，7-dihydroxy-6，4′-dimethoxyisoflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside)抗心腦缺血性疾病的藥理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明，葛花苷對(duì)心腦血管缺血性疾病有一定療效，但是其溶解性問(wèn)題限制了其制劑的發(fā)展，為解決溶解性該專(zhuān)利使用了羥乙基-β-環(huán)糊精等存在爭(zhēng)議的輔料，對(duì)于今后的臨床用藥留下了安全隱患。
為了克服葛花苷及其苷元(尼泊爾鳶尾異黃酮)水溶性差的不足，在公開(kāi)號(hào)為CN 1594307A的專(zhuān)利文獻(xiàn)中，公開(kāi)了野葛花中尼泊爾鳶尾異黃酮的提取分離及其磺化物制備方法和藥物用途。利用磺化反應(yīng)制得水溶性較好，且具一定藥用價(jià)值的尼泊爾鳶尾異黃酮-3`-磺酸鈉。但是，在經(jīng)過(guò)大量藥理實(shí)驗(yàn)得出，尼泊爾鳶尾異黃酮-3`-磺酸鈉對(duì)心、腦血管病的治療效果并不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是，提供一種從葛花中提取尼泊爾鳶尾異黃酮的提取方法。
本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)任務(wù)，是根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有良好的藥用價(jià)值，高水溶性尼泊爾鳶尾異黃酮衍生物。
本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)任務(wù)是提供一種治療心、腦血管病及骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物。
本發(fā)明另一技術(shù)任務(wù)是提供上述衍生物在制備治療心、腦血管病及骨質(zhì)疏松癥的藥物方面的用途。
從葛花中提取分離下述式(I)尼泊爾鳶尾異黃酮的方法 該提取方法包括以下步驟a、將干燥后的葛花用30％～95％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾并收集濾液；b、回收濾液中的乙醇至無(wú)醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置過(guò)夜；d、取上清液，過(guò)大孔樹(shù)脂，用乙醇水溶液洗脫；e、回收洗脫液，放置析出結(jié)晶；f、晶體過(guò)濾、干燥后，用丙酮或醇水重結(jié)晶，固體物用10-50倍固體物量的乙醇或甲醇酸水溶液水解；g、冷卻過(guò)濾水解產(chǎn)物，水洗至中性即得到所需產(chǎn)物。
優(yōu)選的提取方法包括以下步驟a、將干燥后的葛花用80％-95％乙醇加熱回流提取1-3次，每次1-4小時(shí)，過(guò)濾并收集濾液；b、回收濾液中的乙醇至無(wú)醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置過(guò)夜；d、取上清液，過(guò)101大孔樹(shù)脂，用40-70％乙醇洗脫；e、回收洗脫液，放置析出結(jié)晶；f、晶體過(guò)濾、干燥后，用丙酮重結(jié)晶，固體物用10-50倍固體物量的60％～80％乙醇或甲醇水溶液水解，在乙醇或甲醇水溶液中含有質(zhì)量百分比為3％～6％的酸，酸可以是HCl或H2SO4；g、冷卻過(guò)濾水解產(chǎn)物，水洗至中性即得到所需產(chǎn)物。
由下述通式(II)表示的尼泊爾鳶尾異黃酮的衍生物或其藥用鹽 其中式中的R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、C1-8烷基、C2-8鏈烯基、C2-8鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；以及，NR4R5為
R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-8烷基、C2-8鏈烯基、C2-8鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5；R4為H時(shí)，R5不可選用-CH3；R5為H時(shí)，R4不可選用-CH3。
本發(fā)明所說(shuō)的尼泊爾鳶尾異黃酮衍生物的藥用鹽是指藥學(xué)上可接受的鹽，例如與鹽酸、硫酸、磷酸、亞磷酸等無(wú)機(jī)酸形成的鹽，或是與門(mén)冬氨酸、檸檬酸、琥珀酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸等有機(jī)酸形成的鹽，或非天然氨基酸鹽等。
C1-8烷基是指具有1-8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
C2-8鏈烯基是指具有2-8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的鏈烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、1-庚烯基、1-辛烯基等。
C2-8鏈炔基是指具有2-8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的鏈炔基，例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、1-庚炔基、1-辛炔基等。
優(yōu)選為R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；以及，NR4R5為 及其衍生物。
R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5。
最佳為R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；
以及，NR4R5為 R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-2烷基。
本發(fā)明的最佳化合物為R1、R3為H，R2為-CH2NR4R5，R4、R5為-CH3，其結(jié)構(gòu)如式(III)所示 R1、R3為H，R2為-CH2NR4R5，NR4R5為 其結(jié)構(gòu)如式(IV)所示 R1、R3為-CH2CH2OH，R2為H，其結(jié)構(gòu)如式(V)所示
本發(fā)明所述的通式(II)結(jié)構(gòu)的化合物中，對(duì)于其具體取代集團(tuán)，根據(jù)其取代位置的不同，均可由式(I)結(jié)構(gòu)的尼泊爾鳶尾異黃酮為原料，根據(jù)對(duì)制備同類(lèi)取代化合物的已知制備方法和原則，采用相應(yīng)的方法制備得到。
例如，制備上述式(IV)所示的8-亞甲基-哌啶基-尼泊爾鳶尾異黃酮的方法為以式(I)結(jié)構(gòu)的尼泊爾鳶尾異黃酮為原料，甲醛或多聚甲醛、哌啶與甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)中的一種或幾種的混合物混合，加熱至50-70℃反應(yīng)，反應(yīng)后冷卻，過(guò)濾得到化合物(IV)。反應(yīng)方程式為 制備上述式(III)所示的8-亞甲基-二甲氨基-尼泊爾鳶尾異黃酮對(duì)應(yīng)的鹽酸鹽的方法為以式(I)結(jié)構(gòu)的尼泊爾鳶尾異黃酮為原料，甲醛或多聚甲醛、二甲胺的鹽酸鹽與甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)中的一種或幾種的混合物混合，控溫50～70℃反應(yīng)，反應(yīng)后冷卻，過(guò)濾得到化合物(III)，并且可以繼續(xù)和HCl反應(yīng)制備式(III)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的鹽酸鹽化合物(VI)。反應(yīng)方程式為 制備上述式(V)所示的5，7-二羥乙基-6，4′-二甲氧基尼泊爾鳶尾異黃酮的合成方法為以式(I)結(jié)構(gòu)的尼泊爾鳶尾異黃酮為原料，氯乙醇或環(huán)氧乙烷與水混合，在堿性環(huán)境中控溫50～90℃反應(yīng)后冷卻，過(guò)濾得到化合物(V)。反應(yīng)方程式為
本發(fā)明的尼泊爾鳶尾異黃酮的衍生物或其藥用鹽可經(jīng)口或不經(jīng)過(guò)口給藥，給藥量因藥物不同而各有不同，對(duì)成人來(lái)說(shuō)，每天100mg-300mg比較合適。
經(jīng)口服給藥時(shí)，使該化合物與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、抗氧化劑、包衣劑、芳香劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式給藥；非經(jīng)口給藥時(shí)可以注射液、輸液劑等形式給藥。制備上述制劑時(shí)，均可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。
經(jīng)大量藥理試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)可得，本發(fā)明的尼泊爾鳶尾異黃酮的衍生物或其藥用鹽具有很好的水溶性，對(duì)改善和治療心、腦血管病及骨質(zhì)疏松癥有明顯效果。
實(shí)施方式下面的實(shí)施例、制劑實(shí)施例可更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
〔實(shí)施例1〕5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(尼泊爾鳶尾異黃酮)的提取分離。
a、將10kg干葛花粉碎，用90％乙醇水溶液加熱回流提取2次，每次3小時(shí)，過(guò)濾并收集濾液；b、減壓回收溶劑，至無(wú)醇味；c、加溶液6倍量水約30L，放置過(guò)夜；d、取上清液，過(guò)101大孔樹(shù)脂，用60％乙醇水溶液洗脫；e、洗脫液回收，放置10小時(shí)析出結(jié)晶；f、晶體過(guò)濾、干燥后，用丙酮重結(jié)晶，固體物用固體物30倍量的70％乙醇水解，(乙醇中含5％的HCl)；
g、冷卻過(guò)濾水解產(chǎn)物，水洗至中性即得到所需產(chǎn)物為淡黃色針狀結(jié)晶。熔點(diǎn)(m.p.)189～190℃，提取率1％。UVλmax(MeOH)266，335nm；λmax(MeOH+AlCl3)275，315，375nm；λmax(MeOH+AlCl3+HCl)277，312，374nm；λmax(MeOH+NaOAc)271，335nm。IR(KBr)cm-13450(OH)，3067，2960，1658(C＝O)，1660，1624，1576，1515，1460，1371，1294，1231。紫外測(cè)定中加入NaOAc紅移5nm，示有7-OH。AlCl3/HCl譜和AlCl3譜一致，示無(wú)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)。且較MeOH譜有變化，示有3-及/或5-OH。13CNMR(DMSO-d6，150MHz，δ，ppm)180.6(C-4)，159.3(C-4′)，157.7(C-7)，154.5(C-2)，153.4(C-5)，152.9(C-9)，131.6(C-6)，130.3(C-2′，C-6′)，123.1(C-3)，121.6(C-1′)，113.9(C-3′，C-5′)，105.0(C-10)，94.1(C-8)，60.1(6-OCH3)，55.3(4′-OCH3)。1HNMR(DMSO-d6，600MHz，δ，ppm)13.05(1H，s，5-OH)，7.90(1H，s，2-H)，7.45(2H，d，J＝8.8Hz，2′-H，6′-H)，7.05(2H，d，J＝8.8Hz，3′-H，5′-H)，6.60(1H，s，7-OH)，6.55(1H，s，8-H)，3.91(3H，s，6-OCH3)，3.78(3H，s，4′-OCH3)。光譜數(shù)據(jù)與尼泊爾鳶尾素文獻(xiàn)報(bào)道一致。
表1.本發(fā)明實(shí)施例的尼泊爾鳶尾異黃酮的衍生物及其藥用鹽

注集團(tuán)a為

集團(tuán)b為

集團(tuán)C為

〔實(shí)施例2〕8-亞甲基-二甲氨基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物1，結(jié)構(gòu)式III)攪拌下將實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于乙醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.3g化合物1。m.p.185～193℃。
〔實(shí)施例3〕用二甲胺的鹽酸鹽代替實(shí)施例2中的二甲胺，即可得到8-亞甲基-二甲氨基-尼泊爾鳶尾異黃酮鹽酸鹽(化合物2)。m.p.206～212℃。
〔實(shí)施例4〕用哌啶代替實(shí)施例2中的二甲胺，即可得到8-亞甲基-哌啶基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物3，結(jié)構(gòu)式IV)。m.p.190～193℃。
〔實(shí)施例5〕化合物3與門(mén)冬氨酸在水中酸堿成鹽反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)減壓干燥得到8-亞甲基-哌啶基-尼泊爾鳶尾異黃酮門(mén)冬氨酸鹽(化合物4)。m.p.200～206℃。
〔實(shí)施例6〕5，7-二羥乙基尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物5，結(jié)構(gòu)式V)將實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、環(huán)氧乙烷50ml，水中，堿性環(huán)境下，在70℃下控溫反應(yīng)8小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.21g化合物5。m.p.172～176℃。
〔實(shí)施例7〕8-亞甲基-二乙胺基-尼泊爾鳶尾異黃酮鹽酸鹽(化合物6)用二乙胺鹽酸鹽代替實(shí)施例2中的二甲胺，即可得到8-亞甲基-二乙胺基-尼泊爾鳶尾異黃酮鹽酸鹽(化合物6)。m.p.216～219℃。
〔實(shí)施例8〕7-二甲胺基甲?；?尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物7)攪拌下將實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、丙酮30ml、二甲胺基甲酰氯1ml，碳酸鉀2g，在70℃下控溫反應(yīng)24小時(shí)，冷卻，過(guò)濾，回收溶劑，得到1.4g淡黃固體，化合物7。
〔實(shí)施例9〕8-亞甲基-乙烯胺基-5，7-二羥乙基尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物8)用實(shí)施例6得到的化合物5與甲醛1ml、乙烯胺0.8ml溶解于乙醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.1g化合物8。m.p.174～179℃。
〔實(shí)施例10〕8-亞甲基-苯胺基-5，7-二羥乙基尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物9)用實(shí)施例6得到的化合物5與甲醛1ml、苯胺1ml溶解于乙醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.5g化合物9。m.p.184～189℃。
〔實(shí)施例11〕8-亞甲基-二乙胺基-5，7-二丙基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物10)實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、丙醇50ml、濃硫酸3ml，在80℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.1g化合物10。m.p.157～159℃。
〔實(shí)施例12〕8-亞甲基-二甲氨基-5-芐基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物11)實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、丙酮50ml、碳酸鉀1.5g，氯芐2g在60℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾蒸除溶劑得到1.9g化合物，甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于甲醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.9g化合物11。m.p.219～221℃。
〔實(shí)施例13〕8-亞甲基-二甲氨基-5，7-二苯基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物12)實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、丙酮50ml、碳酸鉀5g，氯代苯2g在60℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾蒸除溶劑得到1.8g化合物，甲醛1ml、二甲胺2ml溶解于甲醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.9g化合物12。m.p.211～214℃。
〔實(shí)施例14〕8-亞甲基-己烯基-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物13)攪拌下將實(shí)施例1得到的5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基異黃酮(1g)、甲醛1ml、己烯胺1.9ml溶解于乙醇，在70℃下控溫反應(yīng)4小時(shí)，冷卻，過(guò)濾得到1.6g化合物13。m.p.201～203℃。
〔實(shí)施例15〕8-亞甲基-哌嗪-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物14)用哌嗪代替實(shí)施例2中的二甲胺，即可得到8-亞甲基-哌嗪-尼泊爾鳶尾異黃酮(化合物14)。m.p.192～194℃。
通過(guò)下面的試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的化合物在改善和治療心、腦血管病及骨質(zhì)疏松癥的有明顯效果。
〔試驗(yàn)實(shí)施例1〕靜脈滴注給藥對(duì)麻醉犬急性心肌缺血的影響試驗(yàn)樣品將表1中的化合物6溶于蒸餾水中，濃度為80.0mg/kg(試驗(yàn)組)。
對(duì)照樣品葛根素注射液，100mg/kg(陽(yáng)性對(duì)照組)；尼泊爾鳶尾異黃酮-3’-磺酸鈉(簡(jiǎn)稱(chēng)磺酸鈉對(duì)照)溶于蒸餾水中，濃度為80.0mg/kg。
生理鹽水(心肌缺血模型組)。
動(dòng)物雜種犬20只，體重12.0～16.5kg，雌雄兼有，購(gòu)自濟(jì)南郊區(qū)。實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)1周，擇其正常、健康、雌性無(wú)孕者供試驗(yàn)用。
儀器BioPAC多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)，美國(guó)BioPAC公司。KNOEPRO型全自動(dòng)生化分析儀，芬蘭康藝儀器公司。XD-2型心外膜電極，北京中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院。Q811型求積儀，浙江新安江科學(xué)儀器廠(chǎng)。
方法正常健康犬20只，體重12.0～16.5kg，雌雄兼有，隨機(jī)分為4組，即試驗(yàn)組80.0mg/kg，磺酸鈉對(duì)照組80.0mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥葛根素注射液組100mg/kg及心肌缺血模型組。動(dòng)物經(jīng)2.5％戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈麻醉，分離氣管并插管，備接電動(dòng)呼吸器行人工呼吸。分離股靜脈備用(供取血用)。犬右側(cè)臥位，于左側(cè)第四肋間隙開(kāi)胸，做心包床，分離冠狀動(dòng)脈左前降支近1/2處，引線(xiàn)備結(jié)扎用。將心外膜電極縫于心外膜上，經(jīng)波段開(kāi)關(guān)與BioPAC多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)相連記錄心外膜電圖。術(shù)后緩慢恒速靜脈滴注生理鹽水，以補(bǔ)充體液。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后30min記錄心外膜電圖，計(jì)算30個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段移位的總值(∑-ST)及ST段移位超過(guò)2mv的導(dǎo)聯(lián)數(shù)(N-ST)作為藥前值。靜脈滴注給藥，滴速40滴/min。給藥體積為10.0ml/kg，心肌缺血模型組給予等體積的生理鹽水。分別記錄給藥開(kāi)始后15min、30min、60min、90min、120min、180min及240min的心外膜電圖，計(jì)算∑-ST、N-ST及其變化率。同時(shí)分別于給藥前和給藥后2h、4h由犬股靜脈取血檢測(cè)CK-MB、CK、AST、LDH。給藥后4h，經(jīng)左心耳根部向左房注入碳素墨水1.0ml/kg，20-30秒內(nèi)注完，迅速取下心臟，去除脂肪、心房及右室肌，于-20℃下冰凍30-40min，稱(chēng)重。在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎點(diǎn)下平行冠狀溝將左心室切成等厚的5片，分別稱(chēng)重，用求積儀測(cè)量每片心肌兩面碳素墨水染色區(qū)(非缺血區(qū))及未染色區(qū)(缺血區(qū))面積，計(jì)算缺血區(qū)占左心室肌重量的百分率。然后將5片心肌置于37℃N-BT染液中，振搖染色15min取出，如上測(cè)出梗塞區(qū)(淺紅色)及非梗塞區(qū)(暗紅色)面積，計(jì)算梗塞區(qū)占左心室肌重量的百分率，并計(jì)算出梗塞區(qū)占缺血區(qū)心肌重量的百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別與心肌缺血模型組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。
結(jié)果
(1)試驗(yàn)組對(duì)麻醉犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的影響試驗(yàn)組給藥后240min可以明顯減輕麻醉犬急性心肌缺血程度(∑-ST)，與心肌缺血模型組比較均有明顯差異(P＜0.05)。葛根素注射液給藥后240min明顯減輕麻醉犬急性心肌缺血程度(P＜0.05)?；撬徕c對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)果詳見(jiàn)表2。
(2)試驗(yàn)組對(duì)麻醉犬急性心肌缺血范圍(N-ST)的影響試驗(yàn)組給藥后240min明顯縮小麻醉犬急性心肌缺血范圍(N-ST)，與心肌缺血模型組比較有明顯差異(P＜0.05)。葛根素注射液給藥后240min明顯縮小麻醉犬急性心肌缺血范圍(P＜0.05)，180min有降低趨勢(shì)。磺酸鈉對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)果詳見(jiàn)表3。
(3)試驗(yàn)組對(duì)麻醉犬急性心肌缺血心肌梗塞面積的影響用N-BT染色顯示的心肌梗塞面積與心外膜電圖所測(cè)定的結(jié)果大致一致。試驗(yàn)組大劑量組具有明顯減輕心肌缺血的損傷性作用，使麻醉犬急性心肌梗塞面積明顯縮小，與心肌缺血模型組比較均有明顯差異(P＜0.05)。葛根素注射液與試驗(yàn)組作用相當(dāng)。磺酸鈉對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)果詳見(jiàn)表4。
(4)試驗(yàn)組對(duì)麻醉犬急性心肌缺血心肌酶譜的影響試驗(yàn)組和葛根素注射液分別于給藥后4h明顯降低血清CK-MB，與心肌缺血模型組比較均有明顯差異(P＜0.05)，但對(duì)CK、AST、LDH無(wú)明顯影響?；撬徕c對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)果詳見(jiàn)表5、表6、表7、表8。
表2.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的影響(n＝5，X±SD)


注與缺血模型組比較*P＜0.05表中變化率為每只動(dòng)物藥后不同時(shí)間點(diǎn)變化率之和的均值。(下同)
表3.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血范圍(N-ST)的影響(n＝5，X±SD)


注與缺血模型組比較*P＜0.05
表4.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血面積及梗塞面積的影響(n＝5，X±SD)

注與缺血模型組比較*P＜0.05
表5.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血心肌酶譜CK-MB(u/L)的影響(n＝5，X±SD)

注與缺血模型組比較*P＜0.05表6.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血心肌酶譜CK(u/L)的影響(n＝5，X±SD)

注與缺血模型組比較P＞0.05
表7.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血心肌酶譜AST(u/L)的影響(n＝5，X±SD)

注與缺血模型組比較P＞0.05表8.試驗(yàn)組對(duì)犬急性心肌缺血心肌酶譜LDH(u/L)的影響(n＝5，X±SD)

注與缺血模型組比較P＞0.05
〔試驗(yàn)實(shí)施例2〕對(duì)大鼠腦損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)樣品將表1中的化合物5溶于蒸餾水中，濃度為100mg/kg(大劑量組)、50mg/kg(中劑量組)及25mg/kg(小劑量組)。
對(duì)照樣品鹽酸川芎嗪注射液，7.2mg/kg(陽(yáng)性對(duì)照組)；生理鹽水(假手術(shù)組、腦缺血模型組)。
動(dòng)物Wistar大鼠，體重160-180g，由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供，許可證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200001001。
試驗(yàn)方法(1)試驗(yàn)組對(duì)大鼠急性腦缺血的保護(hù)作用Wistar大鼠90只，雌雄兼用，體重160-180g。隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、腦缺血模型組、試驗(yàn)組大劑量組100mg/kg、中劑量組50mg/kg、小劑量組25mg/kg、陽(yáng)性對(duì)照藥鹽酸川芎嗪注射液組7.2mg/kg。每組15只。尾靜脈注射給藥。給藥體積為1.0ml/200g。給藥時(shí)間為阻斷腦血流前20min。假手術(shù)組和腦缺血模型組均給予等體積的生理鹽水。大鼠經(jīng)25％烏拉坦(1g/kg)腹腔麻醉，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，雙重結(jié)扎(假手術(shù)組僅穿雙線(xiàn)但不結(jié)扎)，造成急性實(shí)驗(yàn)性不完全性腦缺血。結(jié)扎后3h快速斷頭取腦，裝入稱(chēng)量瓶稱(chēng)腦濕重，計(jì)算腦指數(shù)，然后置于110℃烤箱中烘至恒重，稱(chēng)腦干重，計(jì)算腦含水量。其中各組均有5只大鼠實(shí)驗(yàn)完畢，迅速取出腦組織，經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)切片，染色，以檢測(cè)腦組織形態(tài)學(xué)變化。
(2)試驗(yàn)組對(duì)大鼠腦組織毛細(xì)血管通透性的影響Wistar大鼠60只，體重160-180g，雌雄各半。隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、腦缺血模型組、試驗(yàn)組大劑量組100mg/kg、中劑量組50mg/kg、小劑量組25mg/kg、陽(yáng)性對(duì)照藥鹽酸川芎嗪注射液組7.2mg/kg。尾靜脈注射給藥。給藥體積為1.0ml/200g。給藥時(shí)間為阻斷腦血流前20min。假手術(shù)組和腦缺血模型組給予等體積的生理鹽水。動(dòng)物用25％烏拉坦(1g/kg)腹腔麻醉。頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線(xiàn)備用。缺血模型組及各藥物實(shí)驗(yàn)組則在結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈前5min由尾靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg。假手術(shù)組與模型組和各實(shí)驗(yàn)組注射伊文思藍(lán)的時(shí)間、劑量相同，但不結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈。結(jié)扎3h后，斷頭取腦稱(chēng)重，并分別浸泡于甲酰胺溶液(4ml/腦)中，在45℃恒溫箱中溫育72h，待腦組織中伊文思藍(lán)色素全部浸出，取含伊文思藍(lán)色素液用722型光柵分光光度計(jì)620nm處進(jìn)行比色，測(cè)定OD值。
結(jié)果(1)對(duì)腦指數(shù)和腦含水量的影響結(jié)果表明，腦缺血模型組的腦指數(shù)和腦含水量明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明腦缺血模型是成功的。試驗(yàn)組大、中兩個(gè)劑量組均明顯降低急性不完全性腦缺血大鼠的腦指數(shù)升高和腦含水量增加，表明試驗(yàn)組可明顯減輕大鼠急性不完全性腦缺血所引起的腦水腫。結(jié)果詳見(jiàn)表9。
表9.試驗(yàn)組對(duì)急性不完全性腦缺血大鼠腦指數(shù)、腦含水量的影響(X±s，n＝10)

注與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與腦缺血模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01(2)腦組織病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果假手術(shù)組大腦皮層、小腦、海馬等組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)充血、水腫及腦軟化灶等改變。神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變。
腦缺血模型組腦組織充血、水腫，小血管擴(kuò)張。部分神經(jīng)元輕度腫脹，海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞明顯腫大，部分壞死。
試驗(yàn)組大劑量組腦組織輕度充血、小血管輕度擴(kuò)張。部分神經(jīng)元輕度腫脹，海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞腫大，少量壞死。缺血改變明顯輕于模型組。
試驗(yàn)組中劑量組腦組織輕度充血、小血管輕度擴(kuò)張。部分神經(jīng)元輕度腫脹，海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞腫大，少量壞死。缺血改變輕于模型組。
試驗(yàn)組小劑量組腦組織輕度充血、小血管輕度擴(kuò)張。部分神經(jīng)元輕度腫脹，海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞腫大，少量壞死。缺血改變輕于模型組。
鹽酸川芎嗪注射液組腦組織輕度充血、小血管輕度擴(kuò)張。部分神經(jīng)元輕度腫脹，海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞腫大，少量壞死。缺血改變輕于模型組。
(3)對(duì)腦缺血模型大鼠腦毛細(xì)血管通透性的影響結(jié)果表明，腦缺血模型組腦毛細(xì)血管通透性明顯高于假手術(shù)組。表現(xiàn)為單位腦組織伊文思藍(lán)含量顯著升高；鹽酸川芎嗪注射液組和試驗(yàn)組大、中劑量組伊文思藍(lán)含量均明顯減少，使單位組織伊文思藍(lán)含量恢復(fù)至正?；蚪咏?，與模型組比較有顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表10。
表10.試驗(yàn)組對(duì)大鼠腦組織毛細(xì)血管通透性的影響(X±s，n＝10)

注與假手術(shù)組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01結(jié)果表明，腦缺血模型組腦毛細(xì)血管通透性明顯高于假手術(shù)組。試驗(yàn)組大劑量組、中劑量組可以明顯降低腦缺血引起的毛細(xì)血管通透性。
本實(shí)驗(yàn)例表明，結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈形成急性不完全性腦缺血時(shí)，腦指數(shù)、腦含水量和毛細(xì)血管通透性均明顯增加，而試驗(yàn)組通過(guò)減少腦指數(shù)、減輕毛細(xì)血管通透性、緩解腦水腫，血腦屏障通透性改變，大腦局部血流量增加。可以改善腦微循環(huán)血液灌流，改善腦組織的缺血狀態(tài)，減輕腦組織的缺血性損傷，從而對(duì)大鼠缺血性腦損傷有很好的保護(hù)作用，有望成為治療缺血性腦血管病的良藥。
〔試驗(yàn)實(shí)施例3〕試驗(yàn)組的抗骨質(zhì)疏松作用試驗(yàn)樣品將表1中的化合物4溶于蒸餾水中，濃度為100mg/kg(大劑量組)、50mg/kg(中劑量組)及25mg/kg(小劑量組)。
對(duì)照樣品尼爾雌醇，150mg/kg(陽(yáng)性對(duì)照組)；生理鹽水(假手術(shù)組、模型組)。
動(dòng)物Wistar大鼠，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200001001。
方法對(duì)切除卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療作用取雌性大鼠60只，體重230-270g，除假手術(shù)組只開(kāi)腹分離雙測(cè)卵巢而不作切除外，其余各組大鼠在無(wú)菌條件下，腹腔注射1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，切除雙測(cè)卵巢建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，術(shù)后腹腔注射0.5ml慶大霉素預(yù)防感染。術(shù)后2周開(kāi)始給藥，將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、受試物大(100mg/kg)、中(50mg/kg)、小(25mg/kg)劑量組及陽(yáng)性對(duì)照尼爾雌醇組，每組10只，給藥體積1ml/200g，每天給藥1次，連續(xù)60天，假手術(shù)組及模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水。在給藥50天取靜脈血測(cè)血清鈣、磷、堿性磷酸酶及雌激素，給藥60天，將大鼠處死，解剖大鼠子宮肉眼觀(guān)察子宮發(fā)育情況并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，取雙測(cè)股骨，一側(cè)作骨鈣含量測(cè)定，一側(cè)作病理組織學(xué)檢查。
結(jié)果(1)對(duì)血清鈣、磷及堿性磷酸酶的影響，結(jié)果見(jiàn)表11。
表11.對(duì)血清鈣、磷及堿性磷酸酶的影響(n＝10.X±SD)

由表11可見(jiàn)，試驗(yàn)組大、中劑量組大鼠血清鈣、磷、血清堿性磷酸酶與模型組比較有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著差別。
(2)對(duì)血清雌激素、骨鈣的影響，結(jié)果見(jiàn)表12。
表12.對(duì)血清雌激素、骨鈣的影響(n＝10，X±SD)

由表12可見(jiàn)，受試物大、中劑量組骨鈣含量與模型組比較有升高趨勢(shì)，受試物大劑量使血清雌激素水平有明顯升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)子宮病理組織學(xué)檢查結(jié)果去勢(shì)模型組子宮內(nèi)膜上皮輕度萎縮，分泌不活躍；大部分腺體呈輕至中度萎縮，部分腺體反應(yīng)性擴(kuò)張但腺細(xì)胞無(wú)分泌功能，腔內(nèi)無(wú)分泌物；間質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，固有層內(nèi)血管明顯減少，肌層及外膜變薄。
假手術(shù)組子宮內(nèi)膜上皮及腺體正常，上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞分泌活躍；無(wú)間質(zhì)反應(yīng)性增生，固有層有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管正常，無(wú)明顯擴(kuò)張充血，肌層及外膜正常。
陽(yáng)對(duì)組子宮內(nèi)膜上皮正常，腺體欠發(fā)達(dá)，腺細(xì)胞分泌不活躍；固有層有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與去勢(shì)組比較，間質(zhì)疏松，無(wú)間質(zhì)細(xì)胞增生，有少量血管；肌層層次正常，但血管欠發(fā)達(dá)，外膜正常。
試驗(yàn)組小劑量組子宮內(nèi)膜上皮輕度萎縮，分泌不活躍；間質(zhì)細(xì)胞輕度反應(yīng)性增生，固有層腺體發(fā)達(dá)，腺細(xì)胞分泌活躍，血管較去勢(shì)模型組及陽(yáng)對(duì)組豐富；肌層及外膜正常。
試驗(yàn)組中劑量組子宮內(nèi)膜上皮趨于正常，分泌活躍；間質(zhì)正常，固有層腺體發(fā)達(dá)，腺細(xì)胞分泌活躍，血管更加豐富；肌層及外膜正常。
試驗(yàn)組大劑量組子宮內(nèi)膜上皮正常，分泌活躍；間質(zhì)正常，固有層腺體發(fā)達(dá)，腺細(xì)胞分泌活躍，與小、中劑量組比較無(wú)明顯差異；血管更加豐富、充盈；肌層及外膜正常。
(4)股骨病理組織學(xué)檢查結(jié)果假手術(shù)組骨小梁排列密集，互相連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，骨小梁厚度大，其間距小，骨細(xì)胞正常。
去勢(shì)模型組去除卵巢后骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔?，骨吸收陷凹增多，髓腔擴(kuò)大，皮質(zhì)骨變薄。與假手術(shù)組比較，同樣倍數(shù)下骨小梁的連接中斷點(diǎn)多，骨小梁明顯減少，髓腔間距增大，正常骨細(xì)胞減少，骨細(xì)胞空陷凹增多。
陽(yáng)對(duì)組與去勢(shì)組比較骨小梁規(guī)則，數(shù)目明顯增多，厚度增加，斷裂少，髓腔間隙變小。同樣倍數(shù)下正常骨細(xì)胞接近假手術(shù)組。
試驗(yàn)組小劑量組與去勢(shì)組比較，骨小梁數(shù)目輕度增多，厚度輕度增加，骨細(xì)胞空陷凹減少，但正常骨細(xì)胞仍較少。
試驗(yàn)組中劑量組骨小梁數(shù)目較試驗(yàn)組小劑量組增多，厚度增加，髓腔間隙變小，正常骨細(xì)胞增多，但仍低于陽(yáng)對(duì)組。
試驗(yàn)組大劑量組骨小梁數(shù)目明顯增多，厚度增加，斷裂少，髓腔間隙變小，同樣倍數(shù)下正常骨細(xì)胞數(shù)目接近陽(yáng)對(duì)組，骨組織學(xué)改變程度稍重于假手術(shù)組。
結(jié)論在本試驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi)，試驗(yàn)組能夠促進(jìn)骨鈣沉積，減輕切除卵巢大鼠骨皮質(zhì)變薄程度，增加骨小梁數(shù)量，減少破骨細(xì)胞數(shù)量；說(shuō)明試驗(yàn)組對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有明顯的預(yù)防和治療作用，且這種作用呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)性。
下面的實(shí)施例說(shuō)明包含由本發(fā)明提供的化合物的藥用制劑。
〔制劑實(shí)施例1〕片劑按照本領(lǐng)域已知的方法制備片劑，每片含有下述成份化合物1 60mg、乳糖 80mg、硬脂酸鎂 3mg、聚乙烯吡咯烷酮7mg。
〔制劑實(shí)施例2〕膠囊按照本領(lǐng)域已知的方法制備膠囊，每個(gè)膠囊中含有下述成份化合物2 60mg、乳糖 85mg、玉米淀粉 20mg硬脂酸鎂 1mg 聚乙烯吡咯烷酮 4mg。
〔制劑實(shí)施例3〕注射液按照本領(lǐng)域已知的方法制備注射液，每個(gè)注射液中含有下述成份化合物5 100mg、注射用水 10ml。
采用常規(guī)法注射劑的制備工藝制成，每瓶10ml，含化合物5(100mg)。用法葡萄糖注射液稀釋?zhuān)∪庾⑸?，一日二次，每?-2支；靜脈點(diǎn)滴，一日一次，每次2-3支。
〔制劑實(shí)施例4〕凍干制劑、無(wú)菌粉末按照本領(lǐng)域已知的方法制備凍干制劑、無(wú)菌粉末。每個(gè)凍干制劑、無(wú)菌粉末中含有下述成份化合物7 100mg、甘露醇 120mg。
采用常規(guī)法凍干制劑、無(wú)菌粉末的制備工藝制成，每瓶含化合物7(100mg)。用法葡萄糖注射液稀釋?zhuān)∪庾⑸?，一日二次，每?-2瓶；靜脈點(diǎn)滴，一日一次，每次2-3瓶。
權(quán)利要求
1.從葛花中提取分離下述式(I)尼泊爾鳶尾異黃酮的方法 該提取方法包括以下步驟a、將干燥后的葛花用30％～95％乙醇加熱回流提取，過(guò)濾并收集濾液；b、回收濾液中的乙醇至無(wú)醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置過(guò)夜；d、取上清液，過(guò)大孔樹(shù)脂，用乙醇水溶液洗脫；e、回收洗脫液，放置析出結(jié)晶；f、晶體過(guò)濾、干燥后，用丙酮或醇水重結(jié)晶，固體物用10-50倍固體物量的乙醇或甲醇的酸水溶液水解；g、冷卻過(guò)濾水解產(chǎn)物，水洗至中性即得到所需產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，該方法包括以下步驟a、將干燥后的葛花用80％-95％乙醇加熱回流提取1-3次，每次1-4小時(shí)，過(guò)濾并收集濾液；b、回收濾液中的乙醇至無(wú)醇味；c、加入4-8倍溶液量的水，放置過(guò)夜；d、取上清液，過(guò)101大孔樹(shù)脂，用40-70％乙醇洗脫；e、回收洗脫液，放置析出結(jié)晶；f、晶體過(guò)濾、干燥后，用丙酮重結(jié)晶，固體物用10-50倍固體物量的60％～80％乙醇或甲醇水溶液水解，在乙醇或甲醇水溶液中含有質(zhì)量百分比為3％～6％的酸，酸可以是HCl或H2SO4；g、冷卻過(guò)濾水解產(chǎn)物，水洗至中性即得到所需產(chǎn)物。
3.由下述通式(II)表示的尼泊爾鳶尾異黃酮的衍生物或其藥用鹽 其中R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、C1-8烷基、C2-8鏈烯基、C2-8鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；以及，NR4R5為 及各結(jié)構(gòu)衍生物；R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-8烷基、C2-8鏈烯基、C2-8鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5；R4為H時(shí)，R5不可選用-CH3；R5為H時(shí)，R4不可選用-CH3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物，其中，R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；以及，NR4R5為 R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4鏈炔基、-C6H5、-CH2C6H5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物，其中，R1，R3各自獨(dú)立地是H、-CH2CH2OH、 R2是H、-CH2NR4R5；R1、R3、R2不同時(shí)為H；以及，NR4R5為 R4、R5各自獨(dú)立地是H、C1-2烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物，其中，R1、R3為H，R2為-CH2NR4R5，R4、R5為-CH3，其結(jié)構(gòu)如式(III)所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物，其中，R1、R3為H，R2為-CH2NR4R5，NR4R5為 其結(jié)構(gòu)如式(IV)所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物，其中，R1、R3為-CH2CH2OH，R2為H，其結(jié)構(gòu)如式(V)所示。
9.用于改善或治療心、腦血管病，骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物，其中含有權(quán)利要求3的尼泊爾鳶尾異黃酮衍生物或其藥用鹽作為有效成分，并含有藥學(xué)上可以接受的載體。
10.權(quán)利要求3-8中任意一項(xiàng)的化合物在制備改善或治療心、腦血管病，骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從葛花中提取分離尼泊爾鳶尾異黃酮的方法，新穎的通式(II)的尼泊爾鳶尾異黃酮衍生物或其藥用鹽。本發(fā)明還涉及該衍生物的制備方法，以該衍生物為活性成份的藥物組合物，以及該衍生物和其藥用組合物在制備改善或治療心、腦血管疾病和抗骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1911924SQ20061006840
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者仲英, 王福文, 劉魯, 解硯英, 王菊, 牟艷玲, 左春旭, 胡志力, 王元書(shū), 周玲 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所