專利名稱：一種預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗。
背景技術(shù)：
隨著人類對癌癥和免疫系統(tǒng)的進(jìn)一步的深入研究和了解，用癌癥抗原對癌癥進(jìn)行整體的免疫治療已形成了癌癥治療領(lǐng)域的一個新的發(fā)展方向。許多癌癥特異性的抗原已經(jīng)被研發(fā)出來。比如乳腺癌的Her2/neu，前列腺癌的PSA，宮頸癌的HPV-16 E7等。復(fù)雜的癌癥潛發(fā)期造成了自身免疫系統(tǒng)對癌癥特異性抗原的自我耐受(self tolerance)，進(jìn)而對癌癥的形成和發(fā)展失去了監(jiān)控作用。最新研究發(fā)現(xiàn)采用基因技術(shù)，導(dǎo)入外來癌癥特異性抗原可以激活和提高自身免疫系統(tǒng)對癌癥特異性抗原的識別并進(jìn)而達(dá)到殺死癌癥細(xì)胞的目的。
重組人腺病毒可以高效的感染許多種細(xì)胞。用重組人腺病毒導(dǎo)入癌癥特異性抗原基因到體內(nèi)可以達(dá)到對癌癥的免疫治療。為了避免重組人腺病毒在體內(nèi)所引起的免疫反應(yīng)，載有人p53基因的重組人腺病毒被用來在體外感染Dendriticcells(DC)，感染和擴(kuò)增后的DC再回輸?shù)襟w內(nèi)，與傳統(tǒng)的化療結(jié)合用于晚期肺癌病人的臨床治療并取得了初步的臨床效果(Antonia，S.J.et al.Combination ofp53 cancer vaccine with chemotherapy in patients with extensive stage smallcell lung cancer.Clin.Cancer Res.12(3)，878-887，2006)。DC是人免疫系統(tǒng)中最有效的抗原提呈細(xì)胞，它可以有效的引發(fā)初級和次級免疫反應(yīng)。另外，重組人腺病毒感染DC的同時，還可以激活和成熟DC。只有成熟的DC可以引發(fā)有效的免疫反應(yīng)。遺憾的是體外感染DC是一個很復(fù)雜很昂貴的治療方法，而且DC產(chǎn)品的質(zhì)量難得到保證。治療方法很難推廣。
基因疫苗技術(shù)與基因治療技術(shù)有很大的不同。基因治療技術(shù)用于導(dǎo)入外來具有治療作用的基因到體內(nèi)實現(xiàn)基因的表達(dá)以達(dá)到治療疾病的效果?；蛑委煵幌Ｍl(fā)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)會對基因治療效果帶來不利的副作用。與此相反，基因疫苗導(dǎo)入的是抗原基因，目的是引發(fā)全身性的免疫反應(yīng)來達(dá)到對疾病的防預(yù)和治療。由于重組腺病毒基因疫苗引發(fā)的是全身性的免疫反應(yīng)，其療效要比局部用藥的重組腺病毒基因治療會更高。
脂質(zhì)體是一種廣泛的用于基因?qū)氲姆遣《据d體。此外，脂質(zhì)體本身還具有疫苗助劑的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗。
本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗，由用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體和含有癌癥特異性抗原基因的重組腺病毒組成。
所述用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體可從商業(yè)途徑得到，也可按照現(xiàn)有的方法進(jìn)行制備。
所述癌癥特異性抗原可以是任何的癌癥特異性抗原，包括乳腺癌的Her2/neu，前列腺癌的PSA，宮頸癌的HPV-16 E7，Ras，hTERT(human telomerase reversetranscriptase)，CEA等。
含有癌癥特異性抗原基因的重組腺病毒可按照現(xiàn)有的方法進(jìn)行構(gòu)建。
所述癌癥特異性抗原基因是通過對野生型癌癥特異性抗原基因進(jìn)行突變得到的致癌性降低的基因。
所述癌癥特異性抗原基因可為具有序列表中序列1的核苷酸序列的宮頸癌的HPV-16 E7基因。
所述含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒為Ad-E7；所述Ad-E7可按照下述方法構(gòu)建首先將序列表中序列1的HPV-16E7抗原基因克隆到Clontech的Adeno-X Expression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-E7 vector；然后將pDNR-CMV-E7 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector重組產(chǎn)生重組人腺病毒HPV-16E7 vector；用PacI酶切重組人腺病毒HPV-16E7 vector后感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒Ad-E7。
所述癌癥特異性抗原基因還可為具有序列表中序列2的核苷酸序列的乳腺癌的Her2/neu基因。
所述含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒為Ad-Her2；所述Ad-Her2按照下述方法構(gòu)建首先將序列表中序列2的HER2/neu基因克隆到Clontech的Adeno-XExpression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-HER2 vector；然后將pDNR-CMV-HER2 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector重組產(chǎn)生重組人腺病毒HER2vector；用PacI酶切重組人腺病毒HER2 vector后感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒Ad-HER2。
本發(fā)明的預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗(脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物基因疫苗)可用直接注射的方法，注射到病人的皮內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)，來最大限度的實現(xiàn)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明采納脂質(zhì)體和重組人腺病毒各自的優(yōu)點，用脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物直接將癌癥特異性抗原基因?qū)氲桨┌Y病人體內(nèi)，實現(xiàn)對癌癥的免疫治療。脂質(zhì)體是一個有效的疫苗助劑(Adjuvant)能有效地感染DC并促使DC對抗原的提呈，本發(fā)明的預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗，用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒來減輕重組人腺病毒本身的免疫性，從而實現(xiàn)基因疫苗的可重復(fù)使用，達(dá)到癌癥抗原的高導(dǎo)入效果；用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒來拓寬可感染細(xì)胞的范圍，提高癌癥基因疫苗的適用范圍；用基因工程方法處理野生型癌癥抗原，減輕抗原的致癌性并最大限度的提高抗原的免疫能力。
為了提高治療效果，本發(fā)明的預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗要聯(lián)合傳統(tǒng)的手術(shù)治療，化療和放療。癌癥病人應(yīng)首先接受傳統(tǒng)的手術(shù)治療，化療和放療來減輕癌癥腫瘤的負(fù)擔(dān)。在此之后，對病人進(jìn)行基因疫苗治療。如果需要，病人可以在基因疫苗治療療程后一到兩個星期，再接受傳統(tǒng)的化療和放療。傳統(tǒng)的化療和放療會進(jìn)一步殺死殘留癌細(xì)胞，釋放出新的癌細(xì)胞抗原，進(jìn)而達(dá)到對基因疫苗治療的”Boosting”的效果。


圖1為Lipo-Ad-GFP的電鏡檢測結(jié)果圖2為Lipo-Ad-GFP感染CAR陽性的293和CAR陰性的CHO細(xì)胞的實驗結(jié)果圖3為在存在中和抗體的條件下Lipo-Ad-GFP感染細(xì)胞實驗結(jié)果圖4為注射Lipo-Ad-GFP的小鼠血清中IL-6的濃度變化結(jié)果圖5為Lipo-Ad-E7免疫小鼠實驗結(jié)果圖6為Lipo-Ad-E7免疫小鼠實驗結(jié)果圖7為用Lipo-Ad-HER2預(yù)防乳腺癌實驗結(jié)果圖8為用Lipo-Ad-HER2治療乳腺癌實驗結(jié)果具體實施方式
按照本發(fā)明，所有的癌癥特異性抗原都可以用來開發(fā)用于癌癥預(yù)防和治療的基因疫苗。在此，宮頸癌的HPV-16 E7和乳腺癌HER2/neu抗原基因僅作為本發(fā)明的兩個例子。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物的制備1、脂質(zhì)體的生產(chǎn)用DOTAP和膽固醇(Cholesterol)生產(chǎn)脂質(zhì)體。具體方法如下1)在1升的圓底瓶內(nèi)，將420mg DOTAP(MW 698.5)和232mg Cholesterol(MW 386.7)(DOTAP和Cholesterol各20mM)溶解在30mL的氯仿中。
2)用Buchi滾動式蒸發(fā)器，在30℃下蒸發(fā)30min，形成薄膜。
3)用30mL的5g/100ml的葡萄糖水溶液(D5W)重新水化薄膜。用Parafilm封住瓶口，旋轉(zhuǎn)瓶子來水化薄膜。然后在Parafilm封口上打幾個小孔。
4)把瓶子放在50℃的水浴中45min，不停的滾動瓶子。然后再放在35℃的水浴中10min。
5)用Parafilm再次封住瓶口。在室溫下過夜(15-24小時)。
6)在50℃的超聲波水浴中震蕩5-10min。
7)逐次使用1.0，0.45，0.2，和0.1um針筒過濾器(filters)(Whatman)，過濾脂質(zhì)體。
8)在4℃下存放脂質(zhì)體。
2.脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物的生產(chǎn)在注射前，用700μl的D5W或PBS稀釋200μl步驟1制備的脂質(zhì)體。充分混合。然后加入100μl的Ad-GFP重組人腺病毒(1×1012vp/mL，購自VectorDevelopment Lab，Baylor College of Medicine，US)。充分混合，在室溫下培養(yǎng)20-30分鐘即得到脂質(zhì)體和重組人腺病毒Ad-GFP復(fù)合物(Lipo-Ad-GFP)，Lipo-Ad-GFP可注射使用。電鏡檢測脂質(zhì)體和重組人腺病毒復(fù)合物證實脂質(zhì)體是包裹在重組人腺病毒的外圍。圖1是Lipo-Ad-GFP的電鏡檢測結(jié)果，A脂質(zhì)體和重組人腺病毒復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP；B重組人腺病毒Ad-GFP。
2.脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)實驗(1)感染CAR陰性的細(xì)胞實驗腺病毒是通過其特異性的細(xì)胞受體(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)來感染細(xì)胞的。對CAR不表達(dá)或表達(dá)低的細(xì)胞的感染率很低。相反，脂質(zhì)體感染細(xì)胞不需要特異性受體，對任何細(xì)胞都可以感染。因此，脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物可以拓寬可感染細(xì)胞的種類。用脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP感染CAR陽性的293和CAR陰性的CHO細(xì)胞的實驗結(jié)果如圖2所示，表明脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP可以實現(xiàn)在原本不受腺病毒感染的CHO細(xì)胞中高效的基因表達(dá)。拓寬了可感染細(xì)胞的種類。與此同時，脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP也提高了在原本可受腺病毒感染的293細(xì)胞中的基因表達(dá)?？傊?，用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒所形成的復(fù)合物可以提高在許多細(xì)胞種類內(nèi)的基因表達(dá)。
(2)在存在中和抗體的條件下感染細(xì)胞實驗由于大多數(shù)人從小就感染過腺病毒，并產(chǎn)生了對腺病毒有中和(neutralizing)作用的抗體。中和抗體的存在會大大降低重組人腺病毒在體內(nèi)的感染效率。用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒可以提高在中和抗體存在下的基因?qū)胄?。用脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP和Ad-GFP在有和沒有人中和血清(人中和血清Cat#5102-8，Diagnostic Automation，Inc.US)存在下來感染培養(yǎng)在六孔板內(nèi)的H460細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞，ATCC HTB-177)。具體方法如下提前一天接種H460細(xì)胞到兩個六孔板內(nèi)，1×106細(xì)胞/孔，培養(yǎng)液DMEM+10％FBS(Gibco)2mL/孔。在CO2孵箱培養(yǎng)過夜。第二天，去掉六孔板內(nèi)的舊培養(yǎng)液，并換成新鮮的DMEM+2％ FBS培養(yǎng)液。一個六孔板不加人中和血清，另外一個加10％的人中和血清(10mL人中和血清/90mL培養(yǎng)基)。向每個六孔板的三個孔中加入Lipo-Ad-GFP，向每個六孔板的另外三個孔中加入Ad-GFP。感染劑量為感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI(病毒感染單位數(shù)/細(xì)胞數(shù))50vp/細(xì)胞。48小時后，在螢光顯微鏡(Nikon)下，觀察GFP的表達(dá)并照像。GFP的表達(dá)情況如圖3所示，表明在10％的人中和抗體的存在下，Ad-GFP在H460細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)降低了很多。相反，10％的人中和抗體的存在對脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP在H460細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)沒產(chǎn)生任何的影響。實驗結(jié)果證實用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒可以減輕人中和抗體對重組人腺病毒基因?qū)氲挠绊憽Ｒ虼?，脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物可以有效的將癌癥抗原基因?qū)氲较俨《局泻涂贵w陽性的病人中。
3、脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物的動物實驗用脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP作動物實驗，以監(jiān)測脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒對腺病毒在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的改變。限制重組人腺病毒廣泛應(yīng)用的一個主要因素是腺病毒在體內(nèi)會引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)不但限制了基因的表達(dá)，也大大的抑制了重組人腺病毒重復(fù)注射的可能性。用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒有可能會減輕腺病毒引發(fā)的免疫反應(yīng)。
經(jīng)小鼠尾靜脈注射3×1010病毒顆粒(VP，viral particle)Ad-GFP或脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物L(fēng)ipo-Ad-GFP到C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射體積100μl。一個月后，再同樣地注射一次。以未免疫小鼠為陰性對照。在第二次注射后的8和24小時，收集小鼠的血清用于檢測血清中IL-6的濃度。血清中IL-6的濃度是一個很好的免疫反應(yīng)的指標(biāo)。IL-6的濃度是用ELISA kit(Cell Sciences，Inc.，Norwood，MA，USA，#850.035.096)來測量的。結(jié)果如圖4所示，表明靜脈注射脂質(zhì)體Ad-GFP復(fù)合物大大地減輕了重組人腺病毒所引起的體內(nèi)免疫反應(yīng)。
實施例2、預(yù)防和/或治療宮頸癌的基因疫苗宮頸癌是一個主要的婦女疾病。全球每年約有30到40萬人死于此疾病?；旧纤械膶m頸癌是與長期的HPV感染有關(guān)的。其中50-60％的宮頸癌是由于HPV-16病毒的感染所引發(fā)的。HPV-16 E7是一個主要的致癌因子。宮頸癌細(xì)胞基本上都表達(dá)E7蛋白質(zhì)。因此，E7蛋白質(zhì)可以用來作為宮頸癌的特異性抗原，用于宮頸癌的免疫治療。為了減輕用于基因疫苗的E7蛋白質(zhì)的致癌性，本發(fā)明對野生型E7基因進(jìn)行了基因突變。突變后的E7蛋白質(zhì)不具有致癌性。由于突變的E7蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)入體內(nèi)后會更加引發(fā)免疫反應(yīng)。
1、宮頸癌HPV-16E7抗原基因的合成宮頸癌細(xì)胞基本上都表達(dá)HPV-16E7蛋白質(zhì)。E7基因的cDNA有297個堿基對，其蛋白質(zhì)是一個98氨基酸的磷蛋白質(zhì)。分子中有兩個結(jié)合Zn的CysXXCys區(qū)域。這兩個區(qū)域是E7蛋白質(zhì)致癌性的重要組成部分。通過基因定點突變將Cys變成Gly可以大大的減輕E7蛋白質(zhì)的致癌性，由于突變后的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，從而具有更高的免疫能力。突變點在172位點t→g和271位點t→g。突變后的HPV-16E7抗原基因序列如序列表中序列1所示。
突變后的HPV-16E7抗原基因是由美國的InvitroGenomics公司通過基因合成的方法制備的。
2.重組人腺病毒HPV-16E7(Ad-E7)的構(gòu)建首先將序列表中序列1的HPV-16E7抗原基因克隆到Clontech的Adeno-XExpression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-E7 vector(Cat#631524，Clontech，US)。將pDNR-CMV-E7 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector在CreRecombinase存在下重組15分鐘產(chǎn)生重組人腺病毒HPV-16E7質(zhì)粒。用產(chǎn)生的重組人腺病毒HPV-16E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli。接種在含有氯霉素和蔗糖的LB平板內(nèi)過夜篩選和擴(kuò)增。用PCR篩選正確的克隆。提取正確克隆的DNA。用PacI酶切提取的DNA后，感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒HPV-16E7病毒(Ad-E7)。經(jīng)兩次空斑(plaque)純化后，測序病毒中的HPV-16E7基因序列。測序證實HPV-16E7基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。采用HEK 293懸浮細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)Ad-E7，生產(chǎn)的Ad-E7再采用柱層析大規(guī)模純化。純化后的重組人腺病毒Ad-E7，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后用于動物實驗。主要的質(zhì)量檢測指標(biāo)如表1所示。
表1主要的質(zhì)量檢測指標(biāo)和合格參數(shù)

3.脂質(zhì)體+重組人腺病毒復(fù)合物的生產(chǎn)在注射前，用700μl的D5W或PBS稀釋200μl實施例1步驟1制備的脂質(zhì)體。充分混合。然后加入100μl的步驟2制備的重組人腺病毒Ad-E7，充分混合，在室溫下培養(yǎng)20-30分鐘即得到脂質(zhì)體和重組人腺病毒Ad-E7復(fù)合物(Lipo-Ad-E7)，Lipo-Ad-E7可注射使用。
4.脂質(zhì)體+重組人腺病毒HPV-16E7(Lipo-Ad-E7)動物實驗(1)Lipo-Ad-E7免疫小鼠實驗作為實驗組，十只C57BL/6小鼠皮下注射3×108vp Lipo-Ad-E7做免疫預(yù)防。作為對照組，另外十只C57BL/6小鼠皮下注射了3×108vp Lipo-Ad-GFP。兩個星期后，皮下注射2×105TC-1細(xì)胞(C57BL/6小鼠肺細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HPV-16E7蛋白質(zhì)，致癌細(xì)胞，ATCC CRL-2785)來挑戰(zhàn)小鼠。對小鼠腫瘤發(fā)生過程連續(xù)觀察了80天。結(jié)果如圖5所示，60％的Lipo-Ad-E7免疫后的小鼠沒有發(fā)生任何腫瘤，其他40％的免疫后小鼠的腫瘤發(fā)生得到大大的推遲。二十天后，所有對照組的小鼠都得了腫瘤。圖5中，Ad-E7表示Lipo-Ad-E7免疫小鼠。
(2)Lipo-Ad-E7免疫小鼠實驗將20只C57BL/6小鼠分為四組，每組五只，每只小鼠皮下注射3×108vpLipo-Ad-E7做免疫預(yù)防，作為實驗組。作為對照組，20只C57BL/6小鼠分為四組，每組五只，每只C57BL/6小鼠皮下注射了3×108vp Lipo-Ad-GFP。兩個星期后，實驗組和對照組的四組小鼠分別皮下注射2×105，6×105，1×106，2×106TC-1細(xì)胞(C57BL/6小鼠肺細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HPV-16E7蛋白質(zhì)，致癌細(xì)胞，ATCC CRL-2785)來挑戰(zhàn)小鼠。結(jié)果如圖6所示，在45天的觀察期內(nèi)，Lipo-Ad-E7疫苗完全保護(hù)了2×105，6×105，1×106挑戰(zhàn)的小鼠，沒有發(fā)生任何腫瘤；接受2×106挑戰(zhàn)的小鼠，80％沒有發(fā)生任何腫瘤。8到20天內(nèi)，所有的對照組的小鼠都得了腫瘤(最低的挑戰(zhàn)細(xì)胞量，2×105)。
(3)Lipo-Ad-E7免疫小鼠實驗作為實驗組，30只C57BL/6小鼠皮下注射6×108vp Lipo-Ad-E7做免疫預(yù)防。作為對照組，30只C57BL/6小鼠皮下注射了6×108vp Lipo-Ad-GFP。兩個星期后，實驗組和對照組小鼠均分為3組，每組10只，3組小鼠分別接受104，105，106TC-1細(xì)胞iv(靜脈內(nèi)注射)挑戰(zhàn)。兩個星期后，小鼠被處死。并檢查小鼠肺是否有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。結(jié)果如表2所示表2

表2表明Lipo-Ad-E7基因疫苗治療可以有效的防止肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。用Lipo-Ad-E7基因疫苗免疫預(yù)防小鼠，可以有效的防止TC-1癌細(xì)胞造成的癌形成。證明Lipo-Ad-E7基因疫苗對癌癥防御和治療是可行的。
實施例3、預(yù)防和/或治療乳腺癌的基因疫苗1、乳腺癌HER2/neu抗原基因的合成30％到50％的惡性乳腺癌細(xì)胞和其他的惡性癌癥細(xì)胞，比如，卵巢癌和大腸癌等，都超量的表達(dá)HER2/neu基因。HER2/neu基因編碼的p185蛋白質(zhì)是表皮生長因子受體家族的一個成員，并具有酪氨酸激酶的活性。在正常的成人細(xì)胞內(nèi)，p185蛋白質(zhì)濃度是很低的。因此，選擇HER2/neu基因作為治療和預(yù)防惡性乳腺癌的抗原基因有潛在的臨床價值。HER2/neu抗原基因的cDNA序列如序列表中序列2所示。該HER2/neu抗原基因由美國的InvitroGenomics公司通過基因合成的方法制備。
2.重組人腺病毒HER2/neu(Ad-Her2)的構(gòu)建首先將合成的HER2/neu基因克隆到Clontech的Adeno-X Expression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-HER2 vector。將pDNR-CMV-HER2 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector在Cre Recombinase存在下重組15分鐘產(chǎn)生重組人腺病毒HER2質(zhì)粒。用重組人腺病毒HER2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli。接種在含有氯霉素和蔗糖的LB平板內(nèi)過夜篩選和擴(kuò)增。用PCR篩選正確的克隆。提取正確克隆的DNA。用PacI酶切提取的DNA后，感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒HER2病毒(Ad-HER2)。經(jīng)兩次空斑(plaque)純化后，測序病毒中的HER2/neu基因序列。測序證實HER2/neu基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。采用HEK 293懸浮細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)Ad-HER2，生產(chǎn)的Ad-HER2再采用柱層析大規(guī)模純化。純化后的重組人腺病毒HER2病毒，經(jīng)質(zhì)量檢測合格(主要的質(zhì)量檢測指標(biāo)如表1)后用于動物實驗。
3.脂質(zhì)體+重組人腺病毒HER2(Lipo-Ad-HER2)動物實驗(1)用Lipo-Ad-HER2預(yù)防乳腺癌實驗用五到六周的雌性BALB/c nude小鼠(購自Charles River Laboratories，USA)做動物實驗?？偣矁山M，每組十只小鼠。其中，十只小鼠皮下注射1×1010vpLipo-Ad-HER2做免疫預(yù)防。作為對照組，另外十只小鼠皮下注射了1×1010vpLipo-Ad-GFP。兩個星期后，在乳脂肪內(nèi)注射5×105SK-BR-3細(xì)胞(ATCC cat#HTB-30)(人乳腺癌細(xì)胞大量表達(dá)HER2/neu蛋白質(zhì)，致乳腺癌細(xì)胞)來挑戰(zhàn)小鼠。挑戰(zhàn)后40天，處死小鼠。檢查是否有腫瘤發(fā)生，如果有腫瘤發(fā)生檢測腫瘤的重量。結(jié)果如圖7所示，表明所有對照組的小鼠都得了腫瘤。Lipo-Ad-HER2治療組中只有一個小鼠有微小的腫瘤。結(jié)果證實Lipo-Ad-HER2可以有效的預(yù)防和抑制乳腺癌的發(fā)生。
(2)用Lipo-Ad-HER2治療乳腺癌實驗用高量表達(dá)HER2/neu致癌基因的轉(zhuǎn)基因的BALB/c小鼠(購自Charles RiverLaboratories，USA)做試驗。這種小鼠在三周時會逐漸產(chǎn)生包括乳腺的全身性腫瘤。在六和九周時(腫瘤已經(jīng)發(fā)生)，小鼠接受了兩次皮下注射1×109vp Lipo-Ad-HER2的治療。治療組有30只小鼠。作為對照組，15只小鼠皮下注射了1×109vpLipo-Ad-GFP。對小鼠腫瘤的發(fā)展進(jìn)行了長期的觀察。結(jié)果如圖8所示，表明在六和九周時(腫瘤已經(jīng)發(fā)生)兩次皮下注射Lipo-Ad-HER2可以有效的抑制乳腺癌的發(fā)展。如果在九周后追加注射Lipo-Ad-HER2有可能會進(jìn)一步控制乳腺癌的發(fā)展，達(dá)到更好的治療效果。
序列表<160>2<210>1<211>297<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt120ccagctggat aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt tggttgcaag180tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacatttg tactttggaa240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg ggccccatct gttctcagaa accataa 297<210>2<211>3768<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag120acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg180gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg240cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg300attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga360gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg420cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag480ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct540ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag600ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt660gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt720
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗，由用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體和含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述癌癥特異性抗原包括乳腺癌的Her2/neu，前列腺癌的PSA，宮頸癌的HPV-16 E7、Ras、hTERT和CEA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述癌癥特異性抗原基因是通過對野生型癌癥特異性抗原基因進(jìn)行突變得到的致癌性降低的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述癌癥特異性抗原基因為具有序列表中序列1的核苷酸序列的宮頸癌的HPV-16 E7基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒為Ad-E7；所述Ad-E7按照下述方法構(gòu)建首先將序列表中序列1的HPV-16E7抗原基因克隆到Clontech的Adeno-X Expression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-E7 vector；然后將pDNR-CMV-E7 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector重組產(chǎn)生重組人腺病毒HPV-16E7vector；用PacI酶切重組人腺病毒HPV-16E7vector后感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒Ad-E7。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述癌癥特異性抗原基因為具有序列表中序列2的核苷酸序列的乳腺癌的Her2/neu基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒為Ad-Her2；所述Ad-Her2按照下述方法構(gòu)建首先將序列表中序列2的HER2/neu基因克隆到Clontech的Adeno-X Expression System2的pDNR-CMV vector產(chǎn)生pDNR-CMV-HER2 vector；然后將pDNR-CMV-HER2 vector和pLP-Adeno-X-CMV vector重組產(chǎn)生重組人腺病毒HER2 vector；用PacI酶切重組人腺病毒HER2 vector后感染HEK 293細(xì)胞產(chǎn)生重組人腺病毒Ad-HER2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗。該基因疫苗由用于基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體和含有癌癥特異性抗原基因的重組人腺病毒組成。本發(fā)明的預(yù)防和/或治療癌癥的基因疫苗，用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒來減輕重組人腺病毒本身的免疫性，從而實現(xiàn)基因疫苗的可重復(fù)使用，達(dá)到癌癥抗原的高導(dǎo)入效果；用脂質(zhì)體包裹重組人腺病毒來拓寬可感染細(xì)胞的范圍，提高癌癥基因疫苗的適用范圍；用基因工程方法處理野生型癌癥抗原，減輕抗原的致癌性并最大限度的提高抗原的免疫能力。
文檔編號A61P35/00GK1872340SQ20061007644
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者張書元 申請人:張書元