專利名稱：建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種建立抗丙型肝炎病毒藥物篩選的方法及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
背景技術(shù)：
全球約有1.7億人感染了丙型肝炎病毒(HCV)(Alter M，1997)。在發(fā)達(dá)國家的感染率近2％，我國的HCV自然感染率約為2-3％，屬HCV高感染區(qū)(聞?dòng)衩罚?999)。急性丙型肝炎患者70-80會(huì)發(fā)展成慢性肝炎，其中5-10會(huì)發(fā)展成肝硬化和肝癌(金奇，2001)。自從1989年Choo等克隆分離HCV成功以來，對(duì)HCV的分子生物學(xué)研究已取得了較大進(jìn)展。迄今已知HCV有6個(gè)基因型，30多種亞型。但是由于HCV的細(xì)胞受體還未完全確定、缺乏高效率的細(xì)胞培養(yǎng)體系，沒有合適的HCV感染的動(dòng)物模型，嚴(yán)重阻礙了我們對(duì)病毒生活史的認(rèn)識(shí)，使HCV的疫苗研究和特異性抗病毒藥物的研究步履艱難。到目前為止黑猩猩是感染HCV的最理想動(dòng)物模型，其感染HCV的方式、發(fā)病類型、病理損害和免疫學(xué)改變均與人類十分相似。但由于黑猩猩屬于瀕臨滅絕的動(dòng)物、體形大、實(shí)驗(yàn)和維護(hù)費(fèi)用十分昂貴，限制了它在HCV研究中的應(yīng)用。
樹鼩(tree shrew)(Tupaia belangeri)是一種體形小、繁殖快、易于飼養(yǎng)、廣泛分布于我國西南部及東南亞一帶、在分類學(xué)上介于食蟲目和靈長(zhǎng)目之間的哺乳動(dòng)物。已有報(bào)道樹對(duì)多種醫(yī)學(xué)病毒易感，如甲肝病毒(詹美云等，1981年)、乙肝病毒(嚴(yán)瑞琪等，1984年；Eike Walter et al，1996年)、丁肝病毒(李奇芬等，1995年，1996年)、輪狀病毒(萬新邦等，1982年，1985年)、皰疹病毒和基孔肯亞病毒(張海林等，1992年，1997年；Daral C，et al，1980年)等。國內(nèi)曾有樹鼩能感染HCV的報(bào)道(王海平等，1997；劉志等，1998；Xie(謝志春)et al，1998；Zhao et al，2002)。但是，由于研究用病毒來源于病人血清，病毒濃度不高，再者無有效可行的病毒濃宿方法和技術(shù)，建立的模型成功率低，基因型簡(jiǎn)單，無法滿足抗病毒藥物篩選對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托枰?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的篩選抗丙型肝炎病毒藥物的方法，建立丙型肝炎自然感染模型。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述方法建立的動(dòng)物模型進(jìn)行抗丙型肝炎病毒藥物的篩選。
本發(fā)明涉及一種篩選抗丙型肝炎病毒藥物的方法，其包括如下步驟(1)體外檢測(cè)丙型肝炎病毒感染陽性的、使用了安慰劑的丙型肝炎病毒病毒載量在105c-109c的血清中的HCV病毒載量；(2)體外檢測(cè)丙型肝炎病毒感染陽性的、使用了被篩選藥物的樹鼩的血清中的HCV病毒載量；(3)比較步驟(1)和(2)中HCV病毒載量的變化。
上述方法中，丙型肝炎病毒感染陽性的樹鼩優(yōu)選是被人工合成的丙型肝炎病毒感染的。且更優(yōu)選所述人工合成丙型肝炎病毒包括基因型1a或1b。
上述方法中，所述丙型肝炎病毒感染陽性的樹鼩病毒載量大于105c，并優(yōu)選病毒載量105c-109c。
更具體地講，本發(fā)明涉及一種篩選抗丙型肝炎病毒藥物的方法，其特征是，將人工合成的丙型肝炎病毒注射入丙肝病毒陰性的樹鼩體內(nèi)，建立樹鼩丙型肝炎自然感染模型，通過以下四個(gè)步驟來篩選抗丙型肝炎病毒藥物(1).工合成丙型肝炎病毒；(2).將人工合成的丙型肝炎病毒注射入正常樹鼩體內(nèi)，每只動(dòng)物體內(nèi)病毒載量大于105c；
(3).確認(rèn)丙型肝炎病毒自然感染陽性樹鼩模型；(4).通過丙型肝炎病毒陽性樹鼩模型篩選抗篩選抗丙型肝炎病毒藥物。
在本發(fā)明中，人工合成的丙型肝炎病毒包括包括6個(gè)基因型，如1a，1b。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了人工合成的丙型肝炎病毒是通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將全長(zhǎng)的pHCV轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，加入含T7啟動(dòng)子的痘病毒，35-37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，離心收集上清獲得。人工合成丙型肝炎病毒的方法在授權(quán)專利01114678.8中已有詳細(xì)描述和介紹。人工合成的病毒載量大于109c，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于病毒血清提取量104c。
本發(fā)明中將人工合成的丙型肝炎病毒按不同濃度注射入樹鼩體內(nèi)的，每只動(dòng)物的丙型肺炎病毒含量在105c至109c之間，優(yōu)先105c至108c，最優(yōu)先106c至107c之間。
本發(fā)明建立的丙型肝炎動(dòng)物模型，可以通過模擬人丙型肝炎病毒感染的自然過程，在用于研究丙型肝炎病毒的自然感染過程中的應(yīng)用。也可應(yīng)用在篩選抗丙型肝炎藥物中。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)1，丙型肝炎病毒模型成功率高。因?yàn)楹侠淼牟《窘臃N量，模型成功率達(dá)90％以上。
2，可以建立有針對(duì)性的基因型動(dòng)物模型，如丙肝病毒1a基因型，或丙肝病毒混合基因型動(dòng)物模型。
3，3動(dòng)物體形小，且易于獲得，實(shí)驗(yàn)和維護(hù)費(fèi)用降低，擴(kuò)大它在HCV研究中的應(yīng)用。


附圖1是本發(fā)明接種病毒體后ALT變化曲線圖；附圖2是肝臟HCV-RNA RT-PCR檢測(cè)圖；附圖3是免疫組化以core為一抗，core，×400結(jié)果圖；附圖4是免疫組化以NS5A為一抗，NS5A，×400結(jié)果圖；
附圖5是免疫組化以NS3-NS4為一抗，NS3-NS4，×400結(jié)果圖；附圖6是免疫組化以E2為一抗，E2，×400結(jié)果圖。
具體實(shí)施例下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、丙型肝炎病毒的人工合成和定量①丙型肝炎病毒的合成將專利200311111111獲得的載體pHCV-2(CCTCC M201013)，取1μg ScaI酶切過pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘混勻，將載體與LF2000混勻，轉(zhuǎn)染105個(gè)Hela細(xì)胞，并設(shè)無載體和無LF2000兩個(gè)對(duì)照組，經(jīng)過6個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vTF7-3(ATCC N0 VR-2153)重組痘病毒，并加入利福平10毫克/每毫升。經(jīng)2小時(shí)的接種后，除去接種物，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)48-72小時(shí)的溫育后，收集含有丙肝病毒體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
②用RT-PCR測(cè)定擴(kuò)增病毒的滴度在24孔板中加入Huh 7細(xì)胞，每孔106個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后，去上清，加入實(shí)施例⑤獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物上清夜，此上清液10倍稀釋，每孔加入1ml的稀釋后的上清液。24小時(shí)后，除去接種物，并用含10％胎牛血清的1ml新鮮DDMEM取代之。培養(yǎng)2天之后，收集細(xì)胞，并從細(xì)胞中提取全部的RNA。用RT-PCR檢測(cè)丙肝病毒的電泳帶，PCR引物序列為RT-PCR引物為SEQ ID NO14，PCR引物為SEQ ID NO15和SEQ ID NO116。每孔加800微升Trizol Reagent，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，并于室溫放置5分鐘；加160微升氯仿，搖動(dòng)EP管15秒，室溫放置2-3分鐘；于4℃，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清；加入400微升異丙醇，室溫放置10分鐘，于4℃12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清；加入75％乙醇800微升沉淀RNA，并于4℃，7500轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，沉集的RNA空氣干燥，加20-40μl無菌水溶解RNA備用。RNA逆轉(zhuǎn)錄總體積30μl，反應(yīng)體系如下RNA 15微升，引物1微升，75℃變性分鐘，置-3℃，3分鐘；加入5x buffer 6微升，dNTP 6微升，Rnasin 1微升，總體積29微升，在42℃停留2分鐘，加入MMLVRTase，1微升，37℃停留50分鐘，70℃15分鐘滅活得到丙肝病毒cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為Buffer 5微升，cDNA 2微升，MgCl24微升，dNTP 4微升，上下游引物各1微升，Taq酶0.5微升，雙蒸水36.5微升；PCR反應(yīng)條件為95℃1分鐘，95℃30秒-56℃30秒-72℃40秒-72℃5分鐘，Tn32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃貯存。
電泳條件2％瓊脂糖，18V/厘米電壓，電泳10-15分鐘，可見300bp帶，即為丙肝病毒電泳帶。
③用RT-PCRR熒光定量檢測(cè)擴(kuò)增病毒的滴度根據(jù)深圳達(dá)爾安生物工程有限公司產(chǎn)品丙肝病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果判定計(jì)算Ax＝A1-A0(A0為反應(yīng)前值，A1為反應(yīng)后值)；實(shí)驗(yàn)有效性判別將陰性對(duì)照管的Ax稱為N，監(jiān)界陽性標(biāo)準(zhǔn)品的Ax值稱為P1，強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)值A(chǔ)x稱為P2，若此3值滿足P2＞P1＞N，則本次實(shí)驗(yàn)有效。否則，實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)檢查試劑、儀器、反應(yīng)條件等方面的誤差。結(jié)果判定，在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，樣品Ax＞N+0.6×(P1-N)判定陽性；如果N+0.6×(P1-N)＞Ax＞N+0.4×(P1-N)則屬于實(shí)驗(yàn)灰度區(qū)，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，若重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ax值＞N+0.4×(P1-N)判為陽性，否則判為陽性；如果Ax值＜N+0.4×(P1-N)判為陰性。
RT-PCR熒光定量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例2、動(dòng)物模型的建立及確認(rèn)抽取動(dòng)物血液，PCR方法檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)丙型肝炎病毒，篩查動(dòng)物的丙型肝炎。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在接種人工合成的丙型肝炎病毒前，PCR檢測(cè)呈陰性。人工合成的病毒從尾靜脈接種0.8ml，第二天第三天分別再腹腔注射0.6ml，接種量為2ml，每只動(dòng)物的病毒載量為105c以上，共分7組。病毒載量不同，接種后陽性模型的成功率不同，每只動(dòng)物接種病毒載量在104c包括104c，建立丙型肝炎病毒動(dòng)物模型的成功率在34％以下。每只動(dòng)物接種病毒載量在109c包括109c，建立丙型肝炎病毒動(dòng)物模型的成功率在86％以上，但動(dòng)物的死亡率也高，達(dá)15％以上。優(yōu)先105c至108c，最優(yōu)先106c至107c之間。

動(dòng)物陽性通過以下方式確認(rèn)1.重組HCV病毒感染樹HCV RNA檢測(cè)情況

2.接種病毒體后ALT變化曲線，見附圖1。
3.肝臟HCV-RNA RT-PCR檢測(cè)，見附圖2。
HCV體外增殖體系病毒感染樹，肝臟HCV-RNA RT-PCR檢測(cè)結(jié)果1.100bp DNA Ladder Marker(TAKARA)；2.pHCV；3.S1；4.S2；5.S7；6.S8；7.S10；8.S13；9.S14；10.pHCV轉(zhuǎn)染Hela上清；11.D1(對(duì)照組動(dòng)物)；12.D2(對(duì)照組動(dòng)物)；13.空白對(duì)照(PCR反應(yīng)體系中加入擴(kuò)增引物，不加模板)；14.100bp DNA Ladder Marker(TAKARA)；S1，S2，S7，S8為pHCV轉(zhuǎn)染Hela上清感染組；S10為2次感染HCV(pHCV轉(zhuǎn)染Hela上清感染Huh-7)感染組；S13，S14HCV病人血漿感染組(陽性感染對(duì)照)。
4.免疫組化結(jié)果4.1以core為一抗，core，×400，見附圖3；4.2以NS5A為一抗，NS5A，×400，見附圖4；4.3以NS3-NS4為一抗，NS3-NS4，×400，見附圖5；4.4以E2為一抗，E2，×400，見附圖6；確認(rèn)丙型肝炎病毒自然感染陽性樹鼩模型。
實(shí)施例3、丙型肝炎病毒陽性樹鼩模型篩選抗篩選抗丙型肝炎病毒藥物。
挑選成功感染的動(dòng)物(RT-PCR，免疫組化陽性)40只隨機(jī)分成A、B二組，每組10只分別抽取血液檢測(cè)HCV病毒載量用安慰劑(生理鹽水)、PEG IFN-α-2a(Roche)、PEG IFN-α-2bRoche)、利巴韋林ribavirin，RBV Roche)給藥，劑量按PEG IFN-α-2a 1.5μg/kgSQ(皮下注射)每周一次PEG IFN-α-2bRoche)1.0μg/kg SQ(皮下注射)每周一次RBV，體重小于150g2mg每天2次口服，體重大于150g 3mg每天2次口服給藥后分別于1，2，4，8周抽取血液檢查HCV病毒載量。
A組10只動(dòng)物8周內(nèi)病毒載量變化

B組10動(dòng)物8周內(nèi)病毒載量變化

權(quán)利要求
1.一種篩選抗丙型肝炎病毒藥物的方法，其包括如下步驟(1)體外檢測(cè)丙型肝炎病毒感染陽性的、使用了安慰劑的丙型肝炎病毒病毒載量在105c-109c的血清中的HCV病毒載量；(2)體外檢測(cè)丙型肝炎病毒感染陽性的、使用了被篩選藥物的樹鼩的血清中的HCV病毒載量；(3)比較步驟(1)和(2)中HCV病毒載量的變化。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中丙型肝炎病毒感染陽性的樹鼩是被人工合成的丙型肝炎病毒感染的。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述人工合成丙型肝炎病毒包括基因型1a或1b。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述丙型肝炎病毒感染陽性的樹鼩的病毒載量大于105c-109c。
5.權(quán)利要求5的所述的方法，其中所述丙型肝炎病毒感染陽性的樹鼩的病毒載量為105c-109c。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選抗丙型肝炎病毒藥物的方法，是將人工合成的丙型肝炎病毒注射入丙肝病毒陰性的樹鼩體內(nèi)，建立樹鼩丙型肝炎自然感染模型，通過(1)人工合成丙型肝炎病毒；(2)將人工合成的丙型肝炎病毒注射入正常樹鼩體內(nèi)，每只動(dòng)物體內(nèi)病毒載量大于10
文檔編號(hào)A61K49/00GK1879894SQ200610076888
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者李衛(wèi)云, 陳震球, 李汝潤(rùn), 曲三莆, 陳韻, 陶劍 申請(qǐng)人:李衛(wèi)云