專利名稱:Hcv復合多表位轉基因植物口服疫苗的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于分子生物學領域,涉及到利用植物制備的可食性轉基因疫苗,特別是涉及一種預防人丙型肝炎病毒感染的轉基因可食性疫苗;這種重組蛋白的氨基酸序列;編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有時也稱為“基因”);含有該核苷酸序列的表達載體;含有該表達載體的宿主細胞。
背景技術:
丙型肝炎是一種嚴重影響人類健康的傳染病,極易轉化為肝硬化和肝細胞癌,目前尚無理想的防治手段,是危害人類健康重要的病源之一。全世界約有1.7億HCV的感染者,我國估計占4000萬以上所以,研制有效的丙型肝炎疫苗極為重要。
采用有效的疫苗控制和治療丙型肝炎病毒感染是預防和治療丙型肝炎病毒感染的理想途徑,在這方面,科學家一直在進行不懈的探索。迄今為止,在世界上尚未研制出有效的丙型肝炎病毒疫苗。
HCV是單股正鏈RNA病毒,其基因組大約由9400個核苷酸組成,只有一個ORF,編碼一個約3010aa的蛋白前體,從5′端起依次為核心蛋白C,包膜蛋白E1和E2,以及非結構蛋白NS2,NS3,NS4a,NS4b,NS5a,NS5b。HCV的一個主要特點及發(fā)展疫苗的一個首要考慮的因素就是它的高度變異性,深入的系統(tǒng)進化分析可將HCV分成至少6個主要的基因型和至少70個不同的亞型。不僅不同國家或地區(qū)報道的HCV序列差異很大,而且同一病例分離的HCV,由于時間不同其基因組核苷酸序列也不完全一致。各國科學家對研制有效的丙肝病毒疫苗做了很多有益的嘗試,采取了如重組病毒疫苗、DNA疫苗、融合蛋白疫苗、口服疫苗等策略以及新興的RNA干擾技術,研究的熱點從核心蛋白、包膜蛋白到現在的非結構蛋白NS3和NS5。但目前HCV疫苗還沒有研制成功的報道。HCV的快速變異、缺乏穩(wěn)定的HCV體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及理想的小動物模型等問題,都是丙肝疫苗未能開發(fā)成功的主要原因。
復合多肽疫苗有著傳統(tǒng)疫苗無法比擬的極好靶位點攻擊特異性,因此可能更易激起機體的免疫反應,而且安全、價廉、多價及易于儲存,被認為是疫苗市場上的新生力量。
針對HCV的高度變異性,黃建生等在HCV基因表達產物中優(yōu)選了5個高度保守的T/B細胞表位,分別來自核心蛋白(1~16,132~141),E1(317~326),NS3(1445~1453)及NS5(2781~2788),并加入了破傷風毒素的一個T細胞激活位點,組合成一個復合多表位抗原基因(黃建生等.丙型肝炎病毒多表位抗原在小鼠與家兔中的免疫應答??茖W通報,1999;44(23)2519-2524)。然而,此復合多表位基因中沒有E2表位,特別是,他們的表達系統(tǒng)不是可食性植物。
王麗穎等(中國專利申請?zhí)?2122116.2),提供了一種重組蛋白疫苗,它是由卡介苗熱休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白。然而,他們的表達的宿主細胞,為原核細胞,真核細胞或哺乳動物細胞,而不是可食性植物。
李琦涵等(中國專利申請?zhí)?1108683.1),提供了丙型肝炎多表位抗原復合體多肽疫苗及其制備方法和應用。針對危害嚴重的HCV病毒,提供一種具有免疫原性的丙型肝炎疫苗。他們的表達系統(tǒng),也不是可食性植物。
李軼女等進行丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE對番茄的遺傳轉化(丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE對番茄的遺傳轉化,作物學報,2003,29(3)60-3)。盡管,他們的表達系統(tǒng)是可食性植物,但是,他們沒有采用復合多表位基因,降低了產品的免疫性。
目前,還未見將HCV復合多表位抗原基因在可食性植物中表達。轉基因植物基因工程疫苗,以其獨具的可食性特色,展示了其誘人的研究與開發(fā)價值和廣闊的應用前景。目前,轉基因植物疫苗的研究報道主要集中在少數植物上,由于煙草含有毒的生物堿,馬鈴薯不適合人類生食,因此,開發(fā)和利用人類喜歡的可生食的植物種如胡蘿卜、白蘿卜、紅薯、涼薯、香蕉、西紅柿等轉化體系,成為研制人用轉基因植物疫苗的一個熱點。
Mason 1992年(Mason H S,M an2Kit L am D,A rntzen C J.Exp ression of hepatitis B surfaceantigen in transgenic p lants [J].P roc N atl A cad Sci U S A,1992,89(24)11745-11749.)提出了利用轉基因植物生產可食用疫苗的概念。在短短10年左右的時間里,已經有十幾種病毒或細菌的抗原基因在轉基因植物中獲得表達,且基本保留了其天然免疫原性,植物口服疫苗已經蓬勃發(fā)展。與傳統(tǒng)的疫苗表達系統(tǒng)(如細菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)和哺乳動物細胞系統(tǒng))相比,轉基因植物生產基因工程疫苗具有以下優(yōu)點1成本低植物生產疫苗簡單、方便、成本低。轉基因植物生產的基因工程疫苗不需嚴格的純化程序,故成本較其他疫苗低得多。在獲得穩(wěn)定遺傳的轉基因植物后,擴大耕種面積就能提高疫苗的產量,它的上游生產成本較低,而能直接食用的植物疫苗不需特殊貯存條件,同時還可省去下游的加工開支。
2植物細胞具有一套完整的真核表達系統(tǒng),能進行正確的翻譯后加工,表達的產物可進行糖基化、酰胺化、磷酸化、亞基正確裝配等,使其表達產物與高等動物細胞表達的產物具有一致的免疫原性和生物學活性,保持了自然狀態(tài)的免疫原性。
3植物基因工程疫苗的安全性 動物細胞在生產基因工程疫苗生產過程中可能污染動物病毒,另外這些病毒對人類具有潛在的危害;而轉基因植物生產的疫苗中不含有病原物,或潛在的病原物 故表達產物安全可靠,無毒性和副作用,無殘存DNA污染和潛在致病、致癌性。而且植物不是人類病原體的宿主,利用重組植物生產的生物藥不論提純與否,都不存在潛在的人類病原,因而是相當安全。
5有效性。粘膜免疫是病毒性腹瀉的免疫保護機制,轉基因植物細胞是啟動粘膜免疫的有效途徑,其機制可能是植物細胞壁給抗原提供了一種生物微囊,后者可保護抗原不被消化道酶所降解[3]。
6便于儲藏運輸。可以簡單地方便地生產、貯藏和發(fā)放疫苗。
盡管E2糖蛋白在序列上不是很保守,但在制備疫苗時是個不能忽視的區(qū)段。具體闡述如下(1)E2糖蛋白的結合中和性抗體。(2)E2糖蛋白的潛在中和表位。(3)E2糖蛋白的高度可變區(qū)(HVR1)區(qū)存在有較保守的共同序列。E2蛋白中的高度可變區(qū)被普遍認為是抗體結合的靶位點。所以,應該考慮E2表位。
發(fā)明內容
本發(fā)明針對丙型肝炎疫苗研制中的技術難題,提出一種復合多表位抗原基因表達的HCV轉基因可食性植物疫苗。
本發(fā)明根據HCV疫苗及HCV表位、決定簇的有關知識,充分考慮了HCV疫苗研究所存在的問題,特別是HCV的多變性,優(yōu)選了6個高度保守的T細胞及/或B細胞表位,同時加入HBsAg上的PreS的T細胞激活表位或者破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位,以增強復合抗原的免疫原性,并將其轉入可食性植物宿主系統(tǒng)中表達。構建了超強根部特異表達表達盒,從而大幅度提高在根部的表達量。
目的基因的選擇我們在pcx[核心蛋白(1~16aa,132~141aa)、E1(317~326aa)、NS3(1445~1453aa)、NS5(2781~2788aa)]的基礎上連接上包膜蛋白基因(E2),同時加入HBsAg上的PreS的T細胞激活表位或者破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位,這樣既克服了原有基因抗原性較弱的缺點,又能誘發(fā)交叉的免疫保護反應??赏T發(fā)良好的免疫應答。具體說明如下針對HCV的高度變異性,在HCV基因表達產物中優(yōu)選了5個具有良好免疫原性的高度保守表位,分別來自核心蛋白(1~16aa,132~141aa),E1(317~326aa),NS3(1445~1453aa)及NS5(2781~2788aa),這些表位在各型HCV中均高度保守,而且大都已被證實具有良好的T/B細胞激活能力,除了這些高度保守的表位序列,由于E2糖蛋白的高度可變區(qū)(HVR1)區(qū)存在有較保守的共同序列,且E2糖蛋白具有強免疫原性,能誘導結合中和性抗體。故在多表位抗原基因中添加E2(384~565aa)。
在上述多表位抗原基因中還加入HBsAg中PreS的T細胞激活表位或者破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位,這一激活表位一般具有免疫原性,用作B細胞表位的疫苗載體能增強免疫應答。因此該復合基因所表達的抗原可能對不同型、不同株的HCV提供保護作用,在理論上可能優(yōu)于通過HCVcDNA表達的抗原。
整個基因的設計充分考慮到HCV本身免疫的特點,特別強調HLA限制的CTL作用對HCV疫苗免疫應答的影響。一般認為,CTL是HCV感染的一種主要的防御機制,在HCV慢性感染過程中可識別肝細胞內表達的HCV抗原,有助于機體清除HCV感染的肝細胞。因此我們在HCV基因組中優(yōu)選了5個T細胞表位及一個乙型肝炎外源刺激表位,可被HLA-A2等限制的CTL所識別,為復合多肽疫苗激發(fā)有效免疫應答打下良好的基礎。
目的基因獲得包膜蛋白E2基因是預防性疫苗研究的靶抗原,具有高度可變區(qū)和強免疫原性,因此在復合抗原基因序列中增加E2基因。E2(384~565aa)與不同長度的E1相比,免疫原性最強,抗體水平可達105。同時在這一多表位抗原中加入HBsAg中PreS的T細胞激活表位或者破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位。這樣獲得的復合多表位抗原基因(命名為PCH),即可克服單純多表位抗原基因免疫原性弱的特點,增強復合抗原基因的免疫原性,又能誘發(fā)交叉的免疫保護反應。
植物表達載體的構建及農桿菌的轉化為了增強基因的表達,使用根部特異啟動子RB7序列控制目的抗原表達的位置和強度,并將其插入到表達載體pBI121中。然后將拼接好的HCV復合抗原基因PCH克隆至具有根部特異啟動子的表達載體中,使其在啟動子下啟動表達。植物轉基因技術采用農桿菌轉化技術,因為農桿菌轉化是一項成熟的植物轉化技術,轉化效率高于基因槍轉化技術和電擊法。以凍融法將構建好的載體轉入農桿菌LBA4404.
植物的轉化及再生植物轉基因技術采用農桿菌轉化技術,農桿菌轉化是一項成熟的植物轉化技術,轉化效率及轉化后的表達效率高于基因槍轉化技術和電擊法。采用農桿菌菌液侵染植物表達宿主系統(tǒng)如胡蘿卜下胚軸,通過正交設計尋找最佳的轉化程序,和高效快速,繁殖效率高的再生體系。
轉基因植株的檢測首先進行轉基因植株的PCR鑒定,初步確定基因轉入與否及轉化率,然后進行Southern blot檢測PCR陽性植株的外源基因的整合情況,盡可能篩選出單拷貝的轉基因植株,因為多拷貝外源基因轉入的話容易引起基因沉默,最后采用Northern Blot在轉錄水平上檢測外源基因的表達情況。NorthernBlot檢測水平較高的植株,提取蛋白,檢測蛋白提取液中目的蛋白的含量。
重組HCV植物口服疫苗的免疫應答及安全性研究將表達HCV復合抗原基因的陽性植株免疫小鼠,檢測特異性體液免疫和細胞免疫水平,觀察免疫的安全性。找到最佳的免疫劑量,免疫次數。以轉基因植株的塊根,飼喂HALB/c小鼠,并檢驗不同飼喂量和飼喂次數的小鼠中的IgG應答。為HCV疫苗的研究提供了一定的理論及實驗依據。
本發(fā)明的制備方法主要通過以下步驟實現1.基因的拼接利用化學方法合成小片段,經分步退火將這些基因片段拼接成~HCV復合多價基因。
2.通過轉化、質粒抽提、酶切等方法篩選陽性重組克隆,并對基因進行序列分析鑒定。
3.表達載體的構建將拼接好的HCV復合抗原基因PCH克隆至帶有根部特異啟動子RB7的表達載體pBI121中構建成pBI121-PCH重組表達載體。具體做法是將復合基因插入帶有最佳增強子拷貝的超強根部特異表達盒的pBI121內部,插入位置在根部特異表達盒之后,使其在真核啟動子下啟動表達。
4.農桿菌的轉化以凍融法將構建好的載體轉入農桿菌LBA4404.
5.植株的轉化及再生采用農桿菌菌液侵染植物表達宿主如胡蘿卜下胚軸,通過正交設計尋找最佳的轉化程序,和高效快速,繁殖效率高的再生體系。Southern blot檢測PCR陽性植株中外源基因的整合情況。
上述方法均為現有技術中的方法,實施例中已詳細描述。
本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于;(1)構建HCV復合多表位抗原基因PCH,并將其轉入植物宿主系統(tǒng)如胡蘿卜中表達,從而發(fā)展一種高效價廉的針對不同型、不同HCV分離株都能提供交叉保護作用的有效HCV疫苗。
(2)在上述復合抗原基因中加入了乙型肝炎上的一個T細胞激活位點或者破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位,以增強復合抗原的免疫原性。
(3)構建超強根部特異表達表達盒,從而大幅度提高植物宿主如胡蘿卜中PCH的表達量。
本發(fā)明人工合成的復合多表位抗原基因,與單價多肽疫苗相比,可能具有更強的免疫原性,更易激起機體的免疫反應。而且本發(fā)明制備的是一種可食性轉基因植物疫苗有著傳統(tǒng)疫苗及其它非植物轉基因疫苗無法比擬的極好靶位點攻擊特異性,而且安全、價廉、多價及易于儲存,使用方便。該復合基因所表達的抗原可望能對不同型、不同株的HCV提供保護作用,應該優(yōu)于目前制備的HCV疫苗。
本發(fā)明更詳細的實施方法可參見實施例。
實施例下面結合附圖
及具體實施例對本發(fā)明的內容做詳細說明,但本發(fā)明的內容并不局限于此。
1.基因構建根據如上所述的序列設計其具體序列如下1)按照下列序列合成一段序列CH-1,它包含HCV高度保守序列核心蛋白(1~16aa,132~141aa),E1(317~326aa),NS3(1445~1453aa)及NS5(2781~2788aa)以及乙肝pre-S T細胞激活表位。將此序列插入克隆載體pUC 18,并將此載體命名為pCH1.
M SP QA QG ML K T L PATG TCT CCA CAA GCT CAG GGA ATG TTG AAG ACT CTT CCAA DP P P A S T YR Q S GGCA GAT CCT CCA CCT GCT TCT ACA TAT AGA CAG TCA GGAR Qg p M T S T N P KPAGA CAA GGT CCT ATG ACA TCT ACA AAT CCA AAG CCAQ K T K R N T N gp DLCAA AAA ACT AAG AGA AAT ACA AAC GGA CCA GAT CTTM G YI P L V G g pATG GGA TAC ATT CCT TTG GTT GGC GGA CCAR MA W D M M M W g pAGG ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG TGG GGT CCTT G D F D S V I D g pACT GGA GAC TTT GAT TCT GTG ATC GAC GGA CCAE LI T S C S S g pGAA CTT ATT ACA TCA TGT TCT TCA GGA CCA2)合成擴增引物如下,兩端分別添加酶切位點xbaI和EcoRI用于片段的連接CH1xba5’-tctagaATG TCT CCA CAA GCT CAG GG-3’CHIEcoRI5’-gaattc TGG TCC TGA AGA ACA TGA TG-3’用上述引物擴增pCH1.獲得片段,,連入T克隆載體,轉化大腸桿菌,篩選陽性克隆,提取質粒,將質粒進行進行xbaI和EcoRI的雙酶切,酶切產物再次進行瓊脂糖電泳,并回收片斷。將此片斷命名為CH1.
3)RT-PCR方法擴增HCVE2(384~565aa)合成引物如下兩端分別添加酶切位點EcoRI和BaMHIE2-15′-gaattc gcc ggg gtg gac gcg gcg acc tc-3′E2-25′-ggatcc Cca cgt gca gcc aaa cc-3′
4)以丙肝病人陽性血清總RNA提取物為起始材料,采用一步法,添加上述引物進行RT-PCR,電泳并回收片斷,連入T克隆載體,轉化大腸桿菌,篩選陽性克隆,提取質粒,將質粒進行EcoRI和BamHI雙酶切。酶切產物再次進行瓊脂糖電泳,并回收片斷。將此片斷命名為E2。
5)片段CH1與片段E2等量混合,用T4-DNA連接酶連接過夜,次日電泳,回收大片斷(分子量約800bp)。將此大片斷命名為CH,,6)RB7啟動子序列插入Pbi121載體內部,RB7序列下游加入XbaI和BamHI酶切位點作為外源基因的克隆位點。將改造過的pBI121命名為pRB.
7)pRB用XbaI和BamHI進行雙酶切,電泳,回收大片段,然后回收片段與CH片段混合,用T4-DNA連接酶連接過夜,次日轉化大腸桿菌DH5α。進行陽性克隆的篩選,獲得到的陽性克隆命名為pCH.
8)將pCH菌株擴繁,提取質粒,然后將質粒pCH以凍融法轉入農桿菌LBA4404。
9)轉化植物的獲得胡蘿卜種子,于70%乙醇中浸泡1min,用30%“84”溶液消毒25min,再用無菌水漂洗4~5次后,播種于不含任何激素的MS0固體培養(yǎng)基上。取萌發(fā)7d苗齡的無菌苗下胚軸切段(5mm長)作為培養(yǎng)再生植株及遺傳轉化的起始材料。將7d苗齡的胡蘿卜無菌實生苗的下胚軸切段在愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MS+2,4D0.5mg·L-1和BA0.5mg·L-1)上預培養(yǎng)96h,浸入處于指數生長期的農桿菌LBA4404/pCH懸浮液中1~8min(菌液經過離心、收集和一定比例的稀釋,控制OD600值035~0.50),隨后用無菌濾紙吸去多余的菌液,在分別含有2,4D0.5mg·-1和BA0.5mg·L-1的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)72h,再轉到附加頭孢霉素(Cefalexin)500mgL-1及卡那霉素(Kanamycin)20mg·L-1的上述相同培養(yǎng)基上進行抑菌培養(yǎng)和抗性選擇。每隔20天換一次培養(yǎng)基,誘導分化愈傷組織。產生抗性愈傷后轉移到附加頭孢霉素500mg·L-1、卡那霉素(Kanamycin)75mg·L-1并添加0.2%酵母提取物的空白MS培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng),并誘導胚狀體的發(fā)生。
由下胚軸切段誘導分化出的胚狀體,長至兩片子葉展開時,轉移到MS空白培養(yǎng)基繼續(xù)生長,待長至7~8cm高時,取出經過2~3d煉苗后再將植株移栽于盛土壤的盆中,于室外自然條件下生長。
10)轉基因胡蘿卜的鑒定獲得的轉基因植物,提取葉片總DNA,采用CH1xba和引物E2-2引物擴增葉片總DNA,若能夠擴增到800bp的片斷,即初步斷定此為轉基因植物。
進一步采用Southern雜交鑒定那些PCR陽性植物內目的基因的拷貝數,采用pCH內的CH片段作為探針,與PCR陽性植物總DNA的pstI,HindIII,NotI(分別酶切)的酶切產物雜交。放射自顯影檢測目的基因拷貝數,選出單拷貝的植株。
11)重組HCV植物口服疫苗的免疫應答及安全性研究單拷貝插入的陽性植株,移植大田,收獲胡蘿卜,用胡蘿卜直根,檢測小鼠的特異性體液免疫和細胞免疫水平,觀察免疫的安全性。找到最佳的免疫劑量,免疫次數。以轉基因植株的塊根,飼喂BALB/c小鼠,并檢驗不同飼喂量和飼喂次數的小鼠中的IgG應答。
<110>青島科技大學<120>HCV復合多表位轉基因植物口服疫苗<160>20<210>1<211>181<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(114)...(121)<400>1Met Ala Gly Val Asp Ala Ala Thr Ser Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala1 5 10 15Ser Thr Thr Tyr Gly Leu Thr Ser Leu Phe Asn Pro Gly Ala Arg Gln20 25 30Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr35 40 45Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ser Leu50 55 60Phe Tyr Thr His Arg Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ser65 70 75 80Ala Cys Arg Lys Ile Glu Ala Phe Arg Ile Gly Trp Gly Thr Leu Gln85 90 95Tyr Glu Asp Asn Val Thr Asn Pro Glu Asp Met Arg Pro Tyr Cys Trp100 105 110His Tyr Pro Pro Lys Gln Cys Gly Ile Val Pro Ala Arg Pro Val Cys115 120 125Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr130 135 140Asp Arg Leu Gly VAl Pro Thr Tyr Thr Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp145 150 155 160Val Phe Leu Leu Asn Ser Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ser Trp Phe Gly165 170 175Cys Thr Trp Glu Phe180<210>2<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(7)...(22)<400>2Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys
1 5 10 15Thr Lys Arg Asn Thr Asn20<210>3<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(6)<400>3Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>DOMAIN<222>(1)...(15)<400>6Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro1 5 10 15<210>7
<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>DOMAIN<222>(1)...(9)<400>8Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp15<210>9<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(7)...(22)<400>9Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys15 10 15Thr Lys Arg Asn Thr Asn20<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<221>DOMAIN<222>(1)...(15)<400>12Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro15 10 15<210>13<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(10)<400>13Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp15<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(9)<400>14Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp15<210>15<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(7)...(22)
<400>15Met Leu Thr Leu Cys Val Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys15 10 15Thr Lys Arg Asn Thr Asn20<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(9)<400>16Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(8)<400>17Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser15<210>18<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(15)<400>18Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro15 10<210>19<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(10)<400>19Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp
15 10<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>DOMAIN<222>(1)...(9)<400>20Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp1權利要求
1.一種丙型肝炎病毒(HCV)復合多表位轉基因可食性植物疫苗,其特征是將一段HCV復合多價抗原基因在可食性植物宿主系統(tǒng)中表達得到的。
2.權利要求1所述的植物疫苗的表達宿主系統(tǒng)屬于以下所述植物中的一種胡蘿卜、白蘿卜、紅薯、涼薯、香蕉、西紅柿,優(yōu)選的是胡蘿卜和紅薯,其特征在于可生食。
3.權利要求1所述的HCV復合多表位抗原基因,是指從HCV基因組中優(yōu)選的6個高度保守的T細胞及/或B細胞表位與非HCV細胞表位組合成的復合多價抗原基因。這6個表位分別是核心蛋白(1~16,132~141)、E1(317~326)、E2(384-565)、NS3(1445~1453)及NS5(2781~2788)。
4.權利要求3中的非HCV細胞表位是指乙型肝炎表面抗原(HBsAg)外源刺激T細胞表位或破傷風類毒素(TT)外源刺激T細胞表位。
5.權利要求1中將一段HCV復合多價抗原基因在可食性植物宿主系統(tǒng)中表達,是采用超強根部特異表達。
全文摘要
本發(fā)明是一種丙型肝炎病毒(HCV)復合多表位轉基因可食性植物疫苗。所述的HCV疫苗是將HCV復合多表位抗原基因在植物表達宿主系統(tǒng)中表達獲得的,且所述的植物表達宿主是可食性的。本發(fā)明提供了一種高效價廉的針對不同型、不同HCV分離株都能提供交叉保護作用的有效的HCV疫苗。
文檔編號A61P1/16GK101070544SQ20061007804
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月8日 優(yōu)先權日2006年5月8日
發(fā)明者劉均洪, 李鳳梅, 石琰景, 張媛媛, 蘇忠亮, 李俊峰, 呂輝 申請人:青島科技大學