專利名稱：紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架在制備藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架在制備藥物中的用途，特別是在制備治療宮頸癌前病變的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
宮頸癌前病變是個(gè)臨床上較為疑難的婦科疾病，該病變既具有一定的自限性，同時(shí)又有惡變的趨勢(shì)。發(fā)展到宮頸癌需要長(zhǎng)達(dá)10年左右的過(guò)渡期。由于宮頸癌前病變是個(gè)漸變的漫長(zhǎng)過(guò)程，也給早期發(fā)現(xiàn)和早期治療提供了充足的時(shí)間和條件。特別是宮頸癌前病變較輕的病人，更有希望治愈。
宮頸癌前病變通常稱為宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SZL)或稱為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)。也細(xì)分為非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)和非典型腺性上皮細(xì)胞(AGUS)，以及低度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)和高度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)。通常應(yīng)用較多的還有將宮頸上皮內(nèi)病變分為三級(jí)，臨床上常稱之為CIN-I、CIN-II、CIN-III。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已查明，宮頸癌的發(fā)生主要與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關(guān)，以及與單純皰疹病毒感染、真菌感染相互作用更促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞的病理改變，并逐步導(dǎo)致上皮細(xì)胞組織發(fā)生病變直至完全癌變。
宮頸癌前病變是指宮頸上皮細(xì)胞和細(xì)胞組織發(fā)生了異常改變，但還沒(méi)有發(fā)生完全的癌變，宮頸癌有一系列的癌前病變，它的發(fā)生、發(fā)展是由量變到質(zhì)變，漸變到突變的過(guò)程。宮頸癌前病變的典型形式是宮頸上皮不典型增生，所以可以從細(xì)胞組織檢測(cè)中確定細(xì)胞組織病變程度。
全世界每年新發(fā)生宮頸癌為50萬(wàn)人，每年有20萬(wàn)人死于宮頸癌，我國(guó)每年新發(fā)生宮頸癌為15萬(wàn)人，每年約有8萬(wàn)人死于宮頸癌。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料還表明，宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中位居第二，在一些發(fā)展中國(guó)家甚至居于首位。進(jìn)入21世紀(jì)，宮頸癌正在成為影響全球婦女健康的重大疾病之一。
目前，對(duì)于宮頸癌前病變，世界上還沒(méi)有確切療效的治療藥物，在藥物治療宮頸癌前病變方面應(yīng)是空白。
而世界各國(guó)對(duì)于宮頸癌前病變，通常采取對(duì)適齡婦女廣泛篩查的辦法，通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，并配合細(xì)胞組織學(xué)檢測(cè)方法及HPV感染檢測(cè)，可有效檢查出是否患有宮頸癌前病變，對(duì)于患有宮頸癌前病變者，視病變程度采用宮頸表面破壞方法或?qū)m頸病變切除的方法。這一措施，可減少宮頸癌前病變進(jìn)一步向?qū)m頸癌發(fā)展的可能性。
當(dāng)前國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研發(fā)方向，一是進(jìn)一步完善檢測(cè)手段，使之更加準(zhǔn)確和更加簡(jiǎn)便易行。二是對(duì)物理療法和手術(shù)方法進(jìn)一步改進(jìn)和豐富，如激光、電切，錐切手術(shù)等的應(yīng)用。該領(lǐng)域的科研人員治療宮頸癌前病變的思路，主要集中在如何破壞宮頸表面和怎樣切除宮頸病變上面。三是也有個(gè)別研發(fā)藥物(化合物)進(jìn)行治療宮頸癌前病變?cè)囼?yàn)的報(bào)道。
而目前在國(guó)內(nèi)治療宮頸癌前病變中，治療較為混亂，由于恐癌心理，單純根據(jù)宮頸細(xì)胞學(xué)涂片結(jié)果處理病人，夸大宮頸癌前病變的性質(zhì)以及過(guò)度治療病人的現(xiàn)象十分普遍。所以，采用有效藥物治療的方法，無(wú)疑會(huì)促進(jìn)當(dāng)前一邊倒式的過(guò)度治療方式的改變，使之對(duì)宮頸癌前病變采取更科學(xué)更確切更人性化的治療方法。
能使宮頸癌前病變治療不再痛苦，并使婦女的生理功能得到最大限度的保護(hù)，這是婦科醫(yī)生及科研人員的最大追求。或者也可以說(shuō)，現(xiàn)行的物理手段為主的治療方法是對(duì)病變的宮頸進(jìn)行破壞和切除，而新發(fā)明的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑(Nr-cws)治療方法是對(duì)宮頸修復(fù)和保護(hù)。現(xiàn)行治療方法是對(duì)“病”治療，Nr-cws的治療方法是對(duì)“因”治療，應(yīng)該說(shuō)新方法更科學(xué)，技術(shù)更先進(jìn)，更體現(xiàn)人文關(guān)懷。這一新治療藥物若能推廣使用，將改變歐美領(lǐng)導(dǎo)該領(lǐng)域技術(shù)潮流的傳統(tǒng)局面，中國(guó)將成為引領(lǐng)者。
現(xiàn)有技術(shù)中，外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑(商品名，納可佳)是一種免疫調(diào)節(jié)劑，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑(Nr-cws)中含有胞壁酸、粘肽及阿拉伯半乳聚糖等，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性，并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生白介素、干擾素等細(xì)胞因子。目前，該外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑主要用來(lái)治療宮頸糜爛，并發(fā)現(xiàn)Nr-cws還可以治療單純皰疹病毒(HZV)感染、帶狀皰疹病毒(VZV)感染、人乳頭瘤病毒(HPV)感染以及真菌感染。
令人驚奇的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑可用來(lái)治療宮頸癌前病變，解決了當(dāng)前臨床上對(duì)于宮頸癌前病變能夠檢測(cè)但缺少有效治療藥物的尷尬狀況，使得宮頸癌前病變的治療更加人性化。同時(shí)使得宮頸癌不但能早發(fā)現(xiàn)而且還能早治療。對(duì)宮頸癌前病變治療上更主動(dòng)更簡(jiǎn)便，更利于將宮頸癌扼殺在萌芽狀態(tài)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架在制備治療宮頸癌前病變的藥物中的用途。所述宮頸癌前病變?yōu)榉堑湫枉[狀上皮細(xì)胞、非典型腺性上皮細(xì)胞、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變、宮頸上皮不典型增生。其中，所述藥物的藥劑形式為軟膏劑、乳膏劑、硬膏劑、凝膠劑、洗劑、酊劑、搽劑、油劑、糊劑、氣霧劑、栓劑、泡騰片等，并且可以將所述藥物直接施用在病變部位。用生理鹽水將本發(fā)明藥物配制成一定濃度的溶液使用。本發(fā)明藥物的使用濃度為0.3ug/ml至1402ug/ml。優(yōu)選為30ug/ml至240ug/ml。
使用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑(Nr-cws)制備的藥物在治療宮頸癌前病變中有如下特點(diǎn)1、安全性好在治療過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用，以及不適的感覺(jué)。
2、對(duì)應(yīng)性好局部用藥治療局部病癥，避免了全身用藥的身體不良反應(yīng)。
3、針對(duì)性強(qiáng)病癥表現(xiàn)在上皮和黏膜處，而發(fā)明藥物又在上皮和黏膜處有良好的增強(qiáng)免疫作用，所以更顯示針對(duì)性。
4、非特異性臨床觀察中，對(duì)非典型鱗狀上皮細(xì)胞、非典型腺上皮細(xì)胞以及鱗狀上皮內(nèi)病變等宮頸癌前病變均有療效。
5、有效性好在觀察治療病例中，有效率達(dá)80％，治愈率達(dá)70％。
6、使用方便治療時(shí)，只需簡(jiǎn)單的一次性簡(jiǎn)便醫(yī)療器具即可。
7、立足早字符合國(guó)家治療宮頸癌的方針，從篩查宮頸癌前病變?nèi)胧?，不僅可以做到早發(fā)現(xiàn)，而且還可以實(shí)現(xiàn)早治療。
8、利于推廣治療過(guò)程中無(wú)損傷，不破壞宮頸上皮組織，安全性高，易于患者接受，便于推廣。
本發(fā)明的藥物的藥效主要體現(xiàn)在其免疫調(diào)節(jié)功能上。由于正確地針對(duì)病因在關(guān)鍵的病變部位用藥，使之免疫功能低下的病變部位免疫系統(tǒng)被激活，重新恢復(fù)和增強(qiáng)了病人的免疫功能，這是確保療效的重要原因。
宮頸癌前病變是個(gè)可逆性的病變，通常存在一部分病人自身恢復(fù)痊愈，一部分病人維持原狀，還有一部分病人繼續(xù)深度病變直至發(fā)生惡變。在這里主導(dǎo)病變變化的關(guān)鍵因素是人自身免疫能力是否正常。從而也說(shuō)明，人體正常的自身免疫功能有能力清除宮頸上皮病變細(xì)胞，并逐步修復(fù)受損的宮頸上皮細(xì)胞組織。這一客觀事實(shí)為Nr-cws免疫治療宮頸癌前病變提供了理論上的支持。
本發(fā)明藥物作用病變部位后，可迅速激活人體的免疫系統(tǒng)，調(diào)動(dòng)大量的免疫細(xì)胞向病變處聚集，明顯活化巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞殺滅和吞噬病原體和病變細(xì)胞的能力。同時(shí)還誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、白介素等細(xì)胞因子，能夠有效阻滯被病毒感染細(xì)胞的增殖，中止受損或有缺陷的細(xì)胞DNA合成，因而阻斷了宮頸上皮細(xì)胞組織癌變的進(jìn)程，防止了宮頸癌的發(fā)生。
用生理鹽水將本發(fā)明藥物配制成一定濃度的溶液使用。本發(fā)明藥物的使用濃度為0.3ug/ml至1402ug/ml。優(yōu)選為30ug/ml至240ug/ml。
為了說(shuō)明本發(fā)明的藥物的作用效果，申請(qǐng)人使用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑分別進(jìn)行了體外細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物模型和臨床觀察等不同階段的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑治療宮頸癌前病變的療效是確切的。


圖1A為流式細(xì)胞儀分析時(shí)對(duì)照組Hela細(xì)胞周期情況，其中靜止期(G0-G1)細(xì)胞比例為44.44％，增殖期(S+G2-M)細(xì)胞比例為56.56％。
圖1B為使用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑組Hela細(xì)胞周期情況，其中靜止期(G0-G1)細(xì)胞比例為74.61％，增殖期(S+G2-M)細(xì)胞比例為25.39％。
圖2為Hela細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
以下將結(jié)合具體實(shí)施例和附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)人員將被HPV感染的宮頸癌細(xì)胞系——Hela細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，在加入紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑的實(shí)驗(yàn)組和空白的對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)綜合分析MTT檢測(cè)細(xì)胞的活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示兩組在不同時(shí)間點(diǎn)OD490光吸收值有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受阻，而對(duì)照組Hela細(xì)胞則異常生長(zhǎng)，說(shuō)明紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑具有阻滯Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
在采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞處于周期各時(shí)相的比例的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞被阻滯在靜止期(G0-G1)多于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在增殖期(S+G2-M)細(xì)胞明顯少于對(duì)照組。說(shuō)明紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑具有抑制宮頸癌細(xì)胞核有絲分裂的作用，可將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，延緩細(xì)胞周期由G1期向S期的進(jìn)程，為受損的細(xì)胞提供一次修復(fù)的機(jī)會(huì)，阻止受損細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，防止DNA合成產(chǎn)生缺陷，最終防止癌癥的發(fā)生。
在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組小白鼠體內(nèi)腫塊生長(zhǎng)被明顯抑制，對(duì)照組小白鼠體內(nèi)腫塊則異常生長(zhǎng)，兩組有明顯差異，說(shuō)明紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑具有良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。
關(guān)于臨床病例觀察，我們針對(duì)分別患有非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)和非典型腺性上皮細(xì)胞(AGUS)，以及宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變病人進(jìn)行臨床使用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑治療。經(jīng)過(guò)治療后取得初步的理想治療效果，說(shuō)明臨床上紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑具有良好的治療宮頸癌前病變的療效。
按規(guī)范進(jìn)行紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)以及對(duì)病毒感染細(xì)胞的藥效實(shí)驗(yàn)。在這里我們選擇了非洲綠猴腎細(xì)胞及人胚肺二倍體細(xì)胞為試驗(yàn)細(xì)胞，我們同時(shí)選擇了單純皰疹病毒和帶狀皰疹病毒為試驗(yàn)病毒。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出Nr-cws藥液的TD0和MIC。
實(shí)驗(yàn)例1.檢測(cè)抗腫瘤藥物-紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用方法MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))法檢測(cè)細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
(1)主要材料和試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)、胰蛋白酶(Sigma分裝，USA)、MTT(Sigma分裝，USA)、胎牛血清(Hyclone，USA)、二甲基亞砜(Sigma，USA)、96孔板(Corning公司)(2)MTT的配制以PBS配制成5mg/ml貯存液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃避光可以保存一周。
(3)紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑的制備Nr-cws由沈陽(yáng)勝寶康生物制藥有限公司提供，將收集的Nr-cws配置成一定濃度的混懸液后，在0.07MPa下滅菌15min，并置于4℃保存。步驟細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與細(xì)胞活力測(cè)定1)HeLa細(xì)胞培養(yǎng)以胰蛋白酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，0.1ml/孔，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5孔，其中實(shí)驗(yàn)組加入紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑(商品名納可佳，沈陽(yáng)勝寶康生物制藥有限公司生產(chǎn))之終濃度值至30μl/ml，置于含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃)培養(yǎng)24-120h，每隔2日更換培養(yǎng)液，于培養(yǎng)的24h、48h、72h、96h、120h用MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)差異。
2)細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)按文獻(xiàn)報(bào)道的MTT法，分別于每個(gè)待檢測(cè)點(diǎn)(24h、48h、72h、96h、120h)加入MTT溶液(5mg/ml貯存液)20μl/孔，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，然后去上清，每孔加入DMSO 150μl/孔，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，待MTT完全溶解后，用ELISA測(cè)定儀590nm波長(zhǎng)測(cè)定沒(méi)孔的光吸收值。
3)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制取各時(shí)間點(diǎn)光吸收值相近數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。
結(jié)果表1為不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞OD490光吸收值，表2為采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析結(jié)果，p＜0.05表明兩組數(shù)據(jù)具有明顯差異。結(jié)合Hela細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖2可以看出實(shí)驗(yàn)組(加藥組)與對(duì)照組明顯不同，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑明顯抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩。
表1.HeLa細(xì)胞OD490光吸收值

表2.配對(duì)T檢驗(yàn)

流式細(xì)胞儀測(cè)定1)細(xì)胞培養(yǎng)含10％血清的DMEM培養(yǎng)HeLa細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25％的胰酶消化后，以5000個(gè)細(xì)胞每孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，0.1ml/孔，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各3孔，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌兩次，再以無(wú)血清培養(yǎng)培養(yǎng)12h使細(xì)胞同步化，更換10％血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其中實(shí)驗(yàn)組加入Nr-cws至終濃度值30μg/ml，置于含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃)培養(yǎng)，每隔2日更換培養(yǎng)液，于加藥一周后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞DNA合成差異。
2)細(xì)胞制備以0.25％的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗兩遍，離心，去掉上清液，留0.5ml細(xì)胞懸液，用震蕩器使之分散，用注射器將細(xì)胞迅速注入4℃70％冷乙醇中，4℃保存，至少18h。離心收集細(xì)胞，加入RNA酶(終濃度為50μg/ml)，內(nèi)含0.1％ Triton X-100，37℃水浴30min后，放入冰浴中，停止RNA酶的作用，PBS洗兩次，加入碘化丙啶(PI)，終濃度為50μg/ml，保存在冰浴中暗處至少30min，上機(jī)前用孔徑40μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾。
3)結(jié)果比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞DNA合成差異，實(shí)驗(yàn)組處于靜止期細(xì)胞比例明顯多于對(duì)照組。而在增殖期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組明顯少于對(duì)照組。說(shuō)明紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑具有抑制宮頸腫瘤細(xì)胞作用。(數(shù)據(jù)見(jiàn)下表)Hela細(xì)胞增殖各期比例分析 2.紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制 細(xì)胞接種密度為106/只，一周以后(8-9天)呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)腫塊。按臨床劑量開(kāi)始在腫瘤部位注射藥物(濃度為30ug/ml)，2次/周，四周后處死小鼠，量取瘤組織長(zhǎng)、寬及瘤體重量，結(jié)果見(jiàn)上表。實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩。實(shí)驗(yàn)組平均瘤重為0.62g，明顯小于對(duì)照組2.54g，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3.紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)臨床病人進(jìn)行局部治療的效果。
紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)十例宮頸病變患者的治療效果見(jiàn)(表3)。十例病人的藥使用濃度分別為30ug/ml、60ug/ml、120ug/ml和240ug/ml。其中，28歲-35歲6人，35歲以上3人，26歲1人，其中3例發(fā)現(xiàn)伴有HPV感染。經(jīng)過(guò)不同療程，不同用藥量Nr-cws治療，有7人完全治愈，1人病癥減輕，2人炎癥減輕，關(guān)于這三例未痊愈病人，經(jīng)分析主要是病情較重且有并發(fā)癥，用藥療程不夠所致。但其中3例HPV感染者轉(zhuǎn)陰。以宮頸癌前病變?yōu)橹饕^察對(duì)象，其痊愈率為70％，有效率為80％。因此，紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)非典型鱗狀上皮細(xì)胞病變和非典型腺性上皮細(xì)胞病變及宮頸不典型增生均有較好的治療作用。通過(guò)Nr-cws的治療，使得宮頸病變上皮細(xì)胞被清除，受損的宮頸上皮組織被修復(fù)，同時(shí)還使HPV感染轉(zhuǎn)陰。
表3治療宮頸癌前病變病例觀察表

注*該患者同時(shí)HPV感染
4.紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架制劑對(duì)病毒感染細(xì)胞的藥效試驗(yàn)。
1)Nr-cws對(duì)細(xì)胞的毒性作用由沈陽(yáng)勝寶康生物制藥有限公司提供的Nr-cws溶液，在VERO細(xì)胞和2BS細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)觀察其對(duì)細(xì)胞的毒性。
(1)Nr-cws溶液對(duì)2BS細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果(以下試驗(yàn)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法最大無(wú)毒濃度(TD0)為625ug/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為1667ug/ml。MTT法最大無(wú)毒濃度(TD0)為625ug/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為1417ug/ml。
(2)Nr-cws溶液對(duì)VERO細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果(以下試驗(yàn)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法最大無(wú)毒濃度(TD0)為1042ug/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為2220ug/ml。MTT法最大無(wú)毒濃度(TD0)為958ug/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為2376ug/ml。
2)Nr-cws對(duì)感染細(xì)胞的抑制作用(1)Nr-cws溶液對(duì)HSV-I型病毒的抑制作用(以下試驗(yàn)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)①一次給藥組驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.145ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.313ug/ml，治療指數(shù)(TI)為1997。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.124ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.30ug/ml，治療指數(shù)(TI)為2111。
②三次給藥組驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.116ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.3ug/ml，治療指數(shù)(TI)為1997。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.11ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.313ug/ml，治療指數(shù)(TI)為1997。
(2)Nr-cws溶液對(duì)VZV病毒的抑制試驗(yàn)結(jié)果(以下試驗(yàn)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)
①一次給藥組驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.583ug/ml，最小有效濃度(MIC)為1.25ug/ml，治療指數(shù)(TI)為500。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.456ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.846ug/ml，治療指數(shù)(TI)為779。
②三次給藥組驗(yàn)證藥物Nr-cws溶液CPE法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.308ug/ml，最小有效濃度(MIC)為1.25ug/ml，治療指數(shù)(TI)為500。MTT法藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為0.25ug/ml，最小有效濃度(MIC)為0.342ug/ml，治療指數(shù)(TI)為1827。
綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果①Nr-cws對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞TD0為VERO 1042±360ug/ml，2BS 625±0ug/ml。
Nr-cws對(duì)感染細(xì)胞抑制作用MIC為一次給藥組0.3±0ug/ml，三次給藥組0.313±0ug/ml。結(jié)果見(jiàn)表4。
②表4Nr-cws溶液對(duì)VERO和2BS細(xì)胞的毒性測(cè)定結(jié)果

表5 Nr-cws溶液抗單純皰疹病毒I型和水痘-帶狀皰疹病毒藥效試驗(yàn)


注IC50和MIC單位為ug/ml，此表為三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值。
權(quán)利要求
1.紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架在制備治療宮頸癌前病變藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的抗人乳頭瘤病毒藥物包括藥物有效劑量的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架和藥學(xué)上可接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的載體包括賦形劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的賦形劑是右旋糖酐。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物為局部用藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的局部用藥物包括軟膏劑、乳膏劑、硬膏劑、凝膠劑、洗劑、酊劑、搽劑、油劑、糊劑、氣霧劑、栓劑、泡騰片等。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的局部用藥物為洗劑或者搽劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述藥物是每1毫升或者每毫克藥物中含有0.3-1402微克所述的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架在制備治療宮頸癌前病變的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K9/00GK101073583SQ20061008262
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者張策, 張軼, 洪曉明, 張國(guó)英, 趙健 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)勝寶康生物制藥有限公司