專利名稱：一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其制備方法，特別涉及一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，腫瘤對(duì)人體的危害極大，目前西醫(yī)尚無(wú)十分有效的治療方法。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)“腫瘤”的治療有豐富的經(jīng)驗(yàn)，積累了許多行之有效的驗(yàn)方，本發(fā)明藥物組合物對(duì)人體具備較好的保健功能，有抗突變、免疫調(diào)節(jié)的作用。是通過(guò)提高免疫鞏固正氣來(lái)抵制邪氣以達(dá)到治療的目的，從而達(dá)到抑制腫瘤的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于公開一種藥物組合物；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于公開該藥物組合物的制備方法。
本藥物組合物的原料組成為靈芝20-50重量份、蜂膠10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡蘿卜素0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10-6～10×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優(yōu)選為靈芝36重量份、蜂膠24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡蘿卜素0.2重量份、富硒酵母4×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優(yōu)選為靈芝25重量份、蜂膠35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡蘿卜素0.1重量份、富硒酵母2×10-6重量份。
本藥物組合物的原料組成優(yōu)選為靈芝45重量份、蜂膠15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡蘿卜素0.3重量份、富硒酵母8×10-6重量份。
本發(fā)明所述的β-胡蘿卜素為β-胡蘿卜素粉10％，可通過(guò)市售取得，例如可購(gòu)自但不限于北京嘉康源化工有限公司；富硒酵母中含硒量為1000PPM，可通過(guò)市售取得，例如可購(gòu)自但不限于北京嘉康源化工有限公司。取上述組合物原料，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的劑型，包括但不僅限于濃縮丸劑、膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑、緩釋劑、口服液體制劑或凍干粉針劑。
本發(fā)明所述的藥物組合物，貫徹了中醫(yī)學(xué)中扶正與驅(qū)邪雙重調(diào)節(jié)的思想在扶正方面，各組成成分都具有調(diào)節(jié)免疫的作用。從細(xì)胞水平、基因水平而言，靈芝、蜂膠、精氨酸等組成成分，都能有效的激活T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，刺激細(xì)胞免疫和體液免疫的應(yīng)答，從而達(dá)到固護(hù)正氣的目的；驅(qū)邪方面則表現(xiàn)為多靶向、全方位、各階段的每一種成分所具有的抗腫瘤功效。靈芝的提高免疫力，使免疫細(xì)胞在早期就能夠?qū)⒛[瘤殺死、吞噬；提高血小板纖維蛋白的形成能力，將腫瘤腫塊緊緊包裹，切斷其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源；蜂膠抗癌則體現(xiàn)在控制癌細(xì)胞增殖，防止正常細(xì)胞癌變和強(qiáng)化機(jī)體免疫；β-胡蘿卜素能消除那些具有高能量、高活性的自由基，減少致癌的危險(xiǎn)，并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化，降低其惡性程度和轉(zhuǎn)移能力；富硒酵母對(duì)不同部位都能起到全程、全方位、廣譜的預(yù)防癌癥的效果；精氨酸與蛋氨酸相配，可增加T細(xì)胞的有絲分裂，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)和外都能積極地殺傷腫瘤細(xì)胞。
經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明所述的藥物組合物能夠有效地提高特異性和非特異性細(xì)胞免疫；有輔助抑制腫瘤的功效。
(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂藥2周后，能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力；促進(jìn)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能；加速碳粒的清除；顯著提高自然殺傷細(xì)胞的抗瘤活性；增強(qiáng)機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫功能。本發(fā)明藥物組合物膠囊劑可顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，表明本發(fā)明藥物組合物膠囊劑，對(duì)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能也有顯著增強(qiáng)作用。在一定程度上，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑能夠有效地提高特異性和非特異性細(xì)胞免疫。
(2)輔助抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組與中劑量組都能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的平均生存時(shí)間，兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，中劑量組對(duì)小鼠生命延長(zhǎng)率分別為45.9％和47.1％，均超過(guò)30％，且兩次重復(fù)試驗(yàn)瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且抑瘤率均超過(guò)30％，符合衛(wèi)生部1999年公布的《抑制腫瘤作用評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)方法的規(guī)定》。本發(fā)明藥物組合物膠囊劑確有輔助抑制腫瘤的功效。
(3)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑不僅可以有效延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，改善其生活質(zhì)量，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境也有一定改變。在對(duì)荷瘤小鼠腫瘤表面MHC分子影響的定量檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)H22荷瘤小鼠灌服本發(fā)明藥物組合物膠囊劑后，大劑量組和中劑量組移植瘤表面的MHCI類抗原即H-2Kk分子的表達(dá)，與模型組相比，有顯著差異，并且大劑量組與模型組之間有極顯著差異；環(huán)磷酰胺組同模型組也有極顯著差異。這種改變與本發(fā)明藥物組合物膠囊劑的服用劑量呈正相關(guān)。
下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1免疫功能調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH小鼠，6～8周齡。雌性，體重(20±2)g，由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供。(2)藥品試劑本發(fā)明藥物組合物膠囊劑。
實(shí)驗(yàn)方法(1)實(shí)驗(yàn)分組NIH小鼠120只，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組，中劑量組和小劑量組，每組小鼠30只。(2)給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據(jù)下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(shù)(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g·kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g·kg-1·d，對(duì)照組以生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)2周。于實(shí)驗(yàn)的第15天，每組分別取20只小鼠進(jìn)行細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用測(cè)試，其余10只動(dòng)物于第15天起停止給予本發(fā)明藥物組合物膠囊劑，正常喂養(yǎng)第28天后進(jìn)行細(xì)胞免疫功能測(cè)試。
實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(1)NK細(xì)胞活性測(cè)定采用乳酸脫氫酶法。分別取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μl加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中。靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl。各項(xiàng)均設(shè)復(fù)孔。于37度，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，加入LDH基質(zhì)液100μl，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值，計(jì)算NK細(xì)胞活性。
(2)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)稱取DNFB50mg，按1∶1加入5ml丙酮麻油溶液，混勻。鼠腹部皮膚脫毛，范圍3cm×3cm。用DNFB溶液均勻致敏涂抹。5天后，再用DNFB溶液10μl在小鼠左耳(雙面)均勻涂抹進(jìn)行攻擊。24h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，打孔器取直徑8mm的耳片，稱重備用。左右耳重量之差表示DTH的程度。
(3)小鼠碳廓清試驗(yàn)將染料印度墨汁用生理鹽水稀釋5倍。按每10g體重0.1ml計(jì)算，小鼠尾靜脈注稀釋的印度墨汁。注入墨汁后2、10min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，加到2mlNa2CO3溶液中，用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。處死小鼠，取臟器稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。
(4)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)配制生理鹽水、雞紅細(xì)胞懸液。小鼠腹腔注射20％雞紅細(xì)胞懸液1ml。間隔30min后，頸椎脫臼處死動(dòng)物。經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml。吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片載破片上，保持37℃置30min，以生理鹽水漂洗除去末貼片細(xì)胞。丙酮甲醇溶液固定。體積比4％磷酸緩沖液染色3min。漂洗晾干。以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
(5)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)無(wú)菌手術(shù)取脾，將脾撕碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hank’s液洗滌3次，調(diào)整濃度為2×106個(gè)/ml。加入培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加濃度為100μl/ml、50μlConA液，另一孔不加ConA作對(duì)照，置5％CO2，37℃培養(yǎng)72h。結(jié)束培養(yǎng)前4h，每孔吸去上清夜0.7ml，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5g/L)50μl/孔，培養(yǎng)4h后，加入1ml異丙醇，完全溶解結(jié)晶后，分裝到96孔板中。每孔裝4孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以570hm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。
統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)計(jì)量資料組間比較應(yīng)用成組T檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中劑量組小鼠NK活性顯著高于空白對(duì)照組，P＜0.05喂藥4周后，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。
表1本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠脾臟自然殺傷細(xì)胞活性的影響

注*與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05(2)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，中、小劑量組遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)顯著高于空白對(duì)照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。
表2本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響(mg，

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注*與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05**與對(duì)照組比較有極顯著差異，P＜0.01
(3)小鼠碳廓清能力的影響實(shí)驗(yàn)繩索果如表3所示，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，小劑量組碳廓清能力反應(yīng)顯著高于空白對(duì)照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。
表3本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠碳廓清能力的影響(

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注*與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05(4)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中、小三個(gè)劑量組巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著高于空白對(duì)照組，P＜0.05；喂藥4周后，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。
表4本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(

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注*與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05(5)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂飼小鼠2周后，大、中、小三個(gè)劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著高于空白對(duì)照組，P＜0.05；喂藥4周后，該試驗(yàn)結(jié)果與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。
表5本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ挠绊?

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注*與對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.05本實(shí)驗(yàn)例1研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑喂藥2周后，能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力.促進(jìn)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能；加速碳粒的清除；顯著提高自然殺傷細(xì)胞的抗瘤活性增強(qiáng)機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫功能。本發(fā)明藥物組合物膠囊劑可顯著增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，表明本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能也有顯著增強(qiáng)作用。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)移植性S180肉瘤小鼠生命延長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物及瘤株健康昆明種小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
小鼠S180肉瘤，經(jīng)小鼠腹腔傳代保種，由廣安門中醫(yī)院腫瘤研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。
(2)藥品試劑本發(fā)明藥物組合物膠囊劑(簡(jiǎn)寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術(shù)有限公司和太原市晉康源生物王程有限公司提供。陽(yáng)性對(duì)照藥選用上海華聯(lián)制藥有限公司提供的的環(huán)磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產(chǎn)批號(hào)040607。
(3)儀器離心機(jī)LD25-2北京醫(yī)用離心機(jī)實(shí)驗(yàn)方法(1)動(dòng)物分組健康昆明種小鼠50只，雌性，體重(16±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，稱重，隨機(jī)分為五組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺組、模型對(duì)照組，每組10只。分籠飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據(jù)下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(shù)(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g·kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g·kg-1·d，環(huán)磷酰胺組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細(xì)胞懸液的制備S180腹水癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無(wú)菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調(diào)細(xì)胞濃度2.0×106/ml，全程無(wú)菌操作，冰浴上進(jìn)行。
腫瘤動(dòng)物造模將細(xì)胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長(zhǎng)出，造模成功。
造模后給藥接種后第二天，環(huán)磷酰胺組小鼠灌胃CTX為30mg/kg·d。其余各組繼續(xù)灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動(dòng)物存活天數(shù)，以平均存活時(shí)間計(jì)算生命延長(zhǎng)率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。
實(shí)驗(yàn)指標(biāo)一般觀察觀察動(dòng)物體重、進(jìn)食量、飲水量、活動(dòng)度、皮毛光澤度、始出現(xiàn)腫瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)速度和動(dòng)物存活時(shí)間。
生命延長(zhǎng)率計(jì)算方法為生命延長(zhǎng)率(％)(治療組平均存活時(shí)間一陰性對(duì)照組平均存活時(shí)間)/陰性對(duì)照組平均存活時(shí)間×100％。
統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)計(jì)量資料組間比較應(yīng)用成組T檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)一般觀察模型對(duì)照組小鼠腫瘤出現(xiàn)早，生長(zhǎng)迅速，局部腫脹，淋巴回流障礙，壓迫癥狀明顯，右前肢功能廢退。與對(duì)照組比較，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑中劑量組小鼠飲食、毛發(fā)等正常，較活躍，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，局部壓迫癥狀不明顯。環(huán)磷酰胺組形體較中劑量組瘦小，有被毛脫落等現(xiàn)象，腫瘤生長(zhǎng)也較緩慢。本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組體重與腫瘤生長(zhǎng)速度均較快，動(dòng)物解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腹壁脂肪層較厚，小劑量組體重生長(zhǎng)速度較均勻，腫瘤組織生長(zhǎng)也較慢。
(2)生命延長(zhǎng)率(Increase life Span，ILS)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6和7，SBX中劑量治療組的平均存活時(shí)間較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，P＜0.01；生命延長(zhǎng)率為45.9％，與陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺治療組平均存活時(shí)間相比較，差異不顯著。
表6本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠(S180)肉瘤ILS的影響(

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注*與對(duì)照組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與對(duì)照組比較有極顯著差異，(P＜0.01)表7本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠(S180)肉瘤ILS的影響(

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注*與對(duì)照組比較有非常顯著差異，(P＜0.05)**與對(duì)照組比較有極顯著差異，(P＜0.01)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)防和治療給藥，觀察本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)S180荷瘤小鼠生存率的影響，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組與中劑量組都能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的平均生存時(shí)間，且兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，中劑量組對(duì)小鼠生命延長(zhǎng)率分別為45.9％和47.1％，均超過(guò)30％，符合衛(wèi)生部1999年公布的《抑制腫瘤作用評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)方法的規(guī)定》。
實(shí)驗(yàn)例3對(duì)H22肝癌小鼠移植瘤輔助抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料
(1)動(dòng)物及瘤株健康ICR小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
小鼠H22肝腹水瘤，經(jīng)小鼠腹腔傳代保種，由北京醫(yī)科大學(xué)提供。
(2)藥品試劑“本發(fā)明藥物組合物膠囊劑”(簡(jiǎn)寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術(shù)有限公司和太原市晉康源生物工程有限公司提供。
陽(yáng)性對(duì)照藥選用上海華聯(lián)制藥有限公司提供的的環(huán)磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產(chǎn)批號(hào)040607實(shí)驗(yàn)方法(1)動(dòng)物分組健康ICR小鼠60只，雌性，體重(16±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，稱重，隨機(jī)分為六組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺組、模型對(duì)照組、空白組每組10只。分籠飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據(jù)下列公式給出小鼠給藥劑量dB＝dA×(KB/KA)；其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(shù)(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g.kg-1·d，SBX中劑量為1.0g·kg-1·d，SBX小劑量為0.3g。kg-1·d，環(huán)磷酰胺組、模型對(duì)照組以及空白組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細(xì)胞懸液的制備H一22腹水細(xì)胞在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無(wú)菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調(diào)細(xì)胞濃度2.0×106/ml，全程無(wú)菌操作，冰浴上進(jìn)行。
腫瘤動(dòng)物造模將細(xì)胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長(zhǎng)出，造模成功。
造模后給藥接種后第二天起，環(huán)磷酰胺組小鼠開始灌胃CTX為30mg/kg。d。其余各組繼續(xù)灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動(dòng)物。12天時(shí)處死動(dòng)物，剝離腫瘤、肝、睥及胸腺并稱重。
實(shí)驗(yàn)指標(biāo)(1)一般情況觀察主要觀察荷瘤小鼠進(jìn)食量、活動(dòng)、皮毛光澤。
(2)記錄小鼠體重的變化曲線每日記錄小鼠體重(3)抑瘤率計(jì)算方法抑瘤率＝1-治療組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量(4)臟器/體重比值測(cè)定取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計(jì)算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。
(5)光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化石蠟切片準(zhǔn)備取各組小鼠腫瘤組織，10％甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為6μm，置于56度溫箱中烤片24小時(shí)，室溫下保存?zhèn)溆谩?br> 組織切片的HE染色主要步驟為1)、切片脫蠟至水，2)、入蘇木精染色液中3分鐘，蒸餾水沖洗，3)、加入1％鹽酸水溶液分色，蒸餾水沖洗，4)、1％氨水反藍(lán)，蒸餾水沖洗，5)、加入1％伊紅染液中3分鐘，蒸餾水沖洗，4)、逐級(jí)脫水，透明，光學(xué)樹脂封片。
統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)計(jì)量資料組間比較應(yīng)用成組T檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)一般生理情況觀察SBX大劑量組小鼠體重較其他各組增長(zhǎng)均快，被毛有些疏松，行動(dòng)較遲緩。小鼠腋下第三天出現(xiàn)蓬隆，體重與瘤重均增長(zhǎng)較快。
SBX中劑量組小鼠體重增長(zhǎng)速度適中，飲食運(yùn)動(dòng)均良好，被毛順滑，有光澤。接種后SBX第三天開始出現(xiàn)輕微蓬隆，且瘤塊生長(zhǎng)較大劑量組慢。
SBX小劑量組小鼠體重增長(zhǎng)較空白對(duì)照組不顯，飲食行動(dòng)尚可，被毛較順滑。接種后第四天開始出現(xiàn)輕微蓬隆。
陽(yáng)性對(duì)照藥小鼠服用CTX后，呆臥少動(dòng)，被毛疏松，精神差，飲食減少，與對(duì)照組比較體重增加緩慢，腋下荷瘤目測(cè)體積明顯小于對(duì)照組。
模型對(duì)照組小鼠接種后第3天開始出現(xiàn)黃豆樣隆起。小鼠飲食、飲水量減少，被毛疏松，精神較差，呆臥少動(dòng)。
(2)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)各組小鼠體重生長(zhǎng)曲線的影響如下圖所示，造模前給藥7天后本發(fā)明藥物組合物膠囊劑三個(gè)劑量組小鼠體重都高于環(huán)磷酰胺組、正常組和模型對(duì)照組，給藥后第十二天，各組小鼠體重從高到低依次是模型組，大劑量組，小劑量組，中劑量組，環(huán)磷酰胺組，正常組.
(3)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠H22腫瘤抑瘤的作用兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明藥物組合物膠囊劑中劑量組的平均瘤重分別為0.96g和0.91g，與模型組相比較有顯著差異，P＜0.05，中劑量組抑瘤率為43.2％和48.3％，顯示出明顯的抑瘤活性.
表8重復(fù)SBX膠囊對(duì)荷瘤小鼠(H22)的抑瘤作用(

)

注*與模型組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與模型比較有極顯著差異，(P＜0.01)(4)本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)小鼠H22腫瘤免疫器官的影響本發(fā)明藥物組合物膠囊劑各劑量組脾臟指數(shù)均較正常組高，但差異不顯著；本發(fā)明藥物組合物膠囊劑各組胸腺指數(shù)較模型組有顯著差異(P＜0.05)，模型組小鼠胸腺指數(shù)較正常組為低，差異不顯著.
表9本發(fā)明藥物組合物膠囊劑對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的比較(

)

注*與模型組比較有顯著差異，(P＜0.05)**與模型比較有極顯著差異，(P＜0.01)實(shí)驗(yàn)例4對(duì)荷瘤小鼠腫瘤表面MHC I類分子影響的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康ICR小鼠，雌性，體重(16±2)g，二級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
(2)瘤株小鼠H-22肝腹水瘤，經(jīng)小鼠腹腔傳代保種，由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
(3)藥品試劑本發(fā)明藥物組合物膠囊劑(簡(jiǎn)寫為SBX)主要由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母等組成，由上海高能生物技術(shù)有限公司和太原市晉康源生物工程有限公司提供。
陽(yáng)性對(duì)照藥選用上海華聯(lián)制藥有限公司提供的的環(huán)磷酰胺(CTX)，200mg/支，生產(chǎn)批號(hào)040607異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠一H2KK，購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司，陰性對(duì)照PBS液。
(4)儀器離心機(jī)LD25-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。
電子勻漿器DY89-II型電動(dòng)剝離勻漿器，寧波新芝生物科技股份有限公司。
流式細(xì)胞儀(BECTOM TACSCalibur DICKINSON)系美國(guó)BD公司產(chǎn)品，北京東直門醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
實(shí)驗(yàn)方法(1)動(dòng)物分組健康ICR小鼠50只，雌性，體重(16±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，稱重，隨機(jī)分為六組SBX膠囊大劑量組、SBX膠囊中劑量組、SBX膠囊小劑量組、陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺組、空白模型組10只。分籠飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫24-26℃。
(2)造模前給藥各組小鼠等體積灌胃0.2ml/天。根據(jù)下列公式給出小鼠給藥劑量dBdA×(KB/KA)其中，dB為20g小鼠日給藥劑量(g/kg)，dA為正常成人日給藥劑量(g/kg)，K折算系數(shù)(KA0.11，KB1)SBX大劑量為3.0g.kg-1·d，SBX中劑量為1.0g.kg-1·d，SBX小劑量為0.3g.kg-1·d，環(huán)磷酰胺組、模型對(duì)照組以及空白組灌胃生理鹽水。灌胃10天。
(3)造模腫瘤細(xì)胞懸液的制備H22肝腹水癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后，抽取腹水，呈乳白色，無(wú)菌生理鹽水1000rm×5min，洗滌離心3次后，調(diào)細(xì)胞濃度2.0×106/ml，全程無(wú)菌操作，冰浴上進(jìn)行。
腫瘤動(dòng)物造模將細(xì)胞懸液注射至各組昆明種小鼠右腋皮下，制作腫瘤模型小鼠，每鼠注射0.2ml，至每只小鼠都有瘤塊長(zhǎng)出，造模成功。
(4)造模后給藥接種后第二天，環(huán)磷酰胺組小鼠灌胃CTX為30mg/kg·d。其余各組繼續(xù)灌胃給藥，劑量如前。灌胃7天后，停藥觀察動(dòng)物。
(5)制取單細(xì)胞懸液造模后第12天，小鼠脫頸處死，剝離腫瘤。取腫瘤組織約0.2～1.0g，置于電子勻漿器，加入PBS液研磨成單細(xì)胞懸液。將該懸液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾沖洗至小試管中，1500轉(zhuǎn)離心5min，棄上液，加適量PBS液，繼續(xù)離心，1000轉(zhuǎn)5min，棄上液，加PBS液，光學(xué)顯微鏡下調(diào)濃度為106/ml，備用。
(6)結(jié)合抗體將細(xì)胞懸液分兩管，每管100μl，其中1管加相應(yīng)FITC標(biāo)記抗小鼠H一2KK單抗20μl，室溫避光反應(yīng)30min，2000轉(zhuǎn)離心5min，棄上清液，以除去未結(jié)合熒光抗體，另一管做陰性對(duì)照，加20μlPBS液，與細(xì)胞反應(yīng)，步驟如上。
(7)FCM檢測(cè)光源488nm的氬離子激光，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光。以標(biāo)準(zhǔn)球調(diào)整儀器，使變異系數(shù)在2％以內(nèi)。備用樣本以300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。上機(jī)后計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)放大，光散射數(shù)據(jù)存軟盤，測(cè)試完后用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用Student T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果H-2KK抗原在各組荷瘤小鼠腫瘤組織表面表達(dá)特點(diǎn)由表中可以看出，荷瘤小鼠腫瘤組織表面H-2KK在本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組、中劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)磷酰胺)組中的表達(dá)均高于模型組，并且差異顯著(P＜0.01)。
表10 H-2KK抗原在各組荷瘤小鼠腫瘤組織表面表達(dá)Tabel Expression ofH-2KK on tumor cells (

)

注*與對(duì)照組比較，有顯著差異，P＜0.05**與對(duì)照比較，有極顯著差異，P＜0.01通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H22荷瘤小鼠灌服本發(fā)明藥物組合物膠囊劑后，大劑量組和中劑量組移植瘤表面的MHCI類抗原即H-2KK分子的表達(dá)，與模型組相比有顯著差異，并且大劑量組與模型組之間有極顯著差異；環(huán)磷酰胺組同模型組也有極顯著差異。這種改變與本發(fā)明藥物組合物膠囊劑的服用劑量呈正相關(guān)。本發(fā)明藥物組合物膠囊劑大劑量組H-2KK抗原表達(dá)量與環(huán)磷酰胺組接近，中劑量組與小劑量組依次遞減。
下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1凍干粉針劑的制備靈芝36kg、蜂膠24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kg β-胡蘿卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成凍干粉針劑。
實(shí)施例2口服液的制備靈芝25kg、蜂膠35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kg β－胡蘿卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成口服液。
實(shí)施例3合劑的制備靈芝45kg、蜂膠15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kg β-胡蘿卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成合劑。
實(shí)施例4膠囊劑的制備靈芝36kg、蜂膠24kg、精氨酸24kg、蛋氨酸15.8kg、0.2kg β-胡蘿卜素粉10％、4mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成膠囊劑。
實(shí)施例5顆粒劑的制備靈芝25kg、蜂膠35kg、精氨酸15kg、蛋氨酸20kg、0.1kgβ-胡蘿卜素粉10％、2mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成顆粒劑。
實(shí)施例6片劑的制備靈芝45kg、蜂膠15kg、精氨酸35kg、蛋氨酸10kg、0.3kgβ-胡蘿卜素粉10％、8mg富硒酵母(含硒量1000PPM)以上藥物組合物加入常規(guī)輔料，經(jīng)常規(guī)工藝。制成片劑。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝20-50重量份、蜂膠10-40重量份、精氨酸10-40重量份、蛋氨酸5-25重量份、β-胡蘿卜素0.1-0.3重量份、富硒酵母1×10-6～10×10-6重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝36重量份、蜂膠24重量份、精氨酸24重量份、蛋氨酸15.8重量份、β-胡蘿卜素0.2重量份、富硒酵母4×10-6重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝25重量份、蜂膠35重量份、精氨酸15重量份、蛋氨酸20重量份、β-胡蘿卜素0.1重量份、富硒酵母2×10-6重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由如下原料組成靈芝45重量份、蜂膠15重量份、精氨酸35重量份、蛋氨酸10重量份、β-胡蘿卜素0.3重量份、富硒酵母8×10-6重量份。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為取該藥物組合物的原料，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床可接受的濃縮丸劑、膠囊劑、滴丸劑、顆粒劑、片劑、軟膠囊劑、緩釋劑、口服液體制劑或凍干粉針劑。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的藥物組合物，其特征在于其中的β-胡蘿卜素為β-胡蘿卜素10％；富硒酵母中含硒量為1000PPM。
7.如權(quán)利要求1-4任一所述的藥物組合物在制備治療提高特異性和非特異性細(xì)胞免疫的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1-4任一所述的藥物組合物在制備治療抑制腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β－胡蘿卜素、富硒酵母組成。本發(fā)明藥物組合物能有效提高小鼠的非特異性和特異性細(xì)胞免疫功能，抗突變，在免疫調(diào)節(jié)方面有重要作用，可用于輔助抑制腫瘤。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101084933SQ20061008313
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月5日
發(fā)明者藥建明 申請(qǐng)人:太原市晉康源生物工程有限公司