專利名稱：用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移的真核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及構(gòu)建含有Bikunin的真核細(xì)胞表達(dá)載體，以表達(dá)含有Bikunin的融合蛋白，用于治療惡性腫瘤。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是引起人類死亡的主要疾病之一。傳統(tǒng)的治療方法主要包括手術(shù)、化療和放療。經(jīng)過幾十年卓有成效的努力，腫瘤患者生存期得到延長，生存質(zhì)量得到提高。但目前惡性腫瘤仍然是威脅人類健康的主要疾病之一，尤其是針對晚期伴有轉(zhuǎn)移的患者，療效不佳，預(yù)后不良。這就迫使人們尋找新的治療方法。伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物治療應(yīng)運而生。
生物治療是用生物制劑對疾病進(jìn)行治療。它具有特異性高、副作用小、療效可靠，因此，近年來發(fā)展迅猛。
腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜、多步驟的腫瘤細(xì)胞與宿主之間相互作用的過程。它涉及原發(fā)腫瘤組織上異質(zhì)細(xì)胞亞群的選擇，腫瘤細(xì)胞黏附和運動性、血管生成等多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。
Bikunin是含有Kunitz結(jié)構(gòu)的蛋白酶抑制劑，它能抑制胰蛋白酶(trypsin)和血漿纖維蛋白溶酶(plasmin)活性，也能通過抑制前炎癥細(xì)胞因子以抑制炎癥的應(yīng)答反應(yīng)(Fries，E.et al.(2000)Int.J.Biochem.Cell Biol.32，125-137.Nakamura，H.et al.(1997)Iht.Arch.Allergy Immunol.112，157-162)。除此之外，它能通過抑制尿激酶型血漿酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator，uPA)及其受體的表達(dá)，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。在卵巢癌細(xì)胞中，無論是過表達(dá)還是加入外源Bikunin，都能有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Hiroshi Kobayashiet al(2002)Eur.J.Biochem.269，3945-3957.Hiroshi Kobayashi et al(2004)JBC.279，6371-6379.Hiroshi Kobayashi et al(2003)JBC.278，7790-7799)。因此，Bikunin可作為治療腫瘤轉(zhuǎn)移的生物制劑。
人源生物制劑不易引發(fā)免疫反應(yīng)，也不易產(chǎn)生耐藥性，帶有標(biāo)簽的融合蛋白易于檢測和純化。因此，我們構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)載體pSecTag2B-Bikunin，以表達(dá)分泌的、帶有Myc和組氨酸的Bikunin融合蛋白，為治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的生物制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建Bikunin的真核細(xì)胞表達(dá)載體，以表達(dá)含有Bikunin的融合蛋白，用于治療惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案本發(fā)明所述構(gòu)建Bikunin的真核細(xì)胞表達(dá)載體，以表達(dá)含有Bikunin的融合蛋白。具體為1.目的基因的獲得常規(guī)從人肝細(xì)胞系L02中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR括增Bikunin。
2.pMD18-T-Bikunin載體的構(gòu)建用常規(guī)的分子生物學(xué)方法構(gòu)建pMD18-T-Bikunin載體，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，對插入序列進(jìn)行測序證實插入片段為目的基因Bikunin。
3.pSecTag2B-Bikunin的構(gòu)建將pMD18-T-Bikunin酶切產(chǎn)物亞克隆到pSecTag2B中，酶切和PCR鑒定構(gòu)建含有Bikunin的真核表達(dá)載體pSecTag2B-Bikunin。
4.pSecTag2B-Bikunin在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)用磷酸鈣沉淀法將pSecTag2B-Bikunin轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后24小時的細(xì)胞培養(yǎng)上清，有融合蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的有益效果是為治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的生物制劑。該基因克隆于人肝細(xì)胞系L02，且應(yīng)用真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)分泌型帶有標(biāo)簽-Myc和組氨酸的Bikunin融合蛋白。因此，既具有克服了異源蛋白的免疫原性，又具有能進(jìn)行翻譯后的糖基化，易于分離純化的優(yōu)點?？勺鳛橹苽渲委煇盒阅[瘤的藥物。
四

圖1.PCR擴增Bikunin的1.5％瓊脂糖電泳結(jié)果1DNA marker.2PCR產(chǎn)物(箭頭所指為Bikunin)圖2.pMD18-T-Bikunin經(jīng)BamHI和HandIII雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果1DNA marker；2，3，4為不同克隆的雙酶切結(jié)果(箭頭所指為釋放的Bikunin片段)圖3.pMD18-T-Bikunin為模板的BikuninPCR產(chǎn)物電泳圖1DNA marker；2，3，4，5，6為不同克隆的PCR結(jié)果(箭頭所指為Bikunin)；7，8為不含Bikunin載體作為陰性對照。
圖4.pSecTag2B-Bikunin PCR擴增Bikunin和BamHI、HandIII雙酶切產(chǎn)物電泳圖1DNA marker；2，3為不同克隆的Bikunin PCR產(chǎn)物；4，5為雙酶切結(jié)果(箭頭所指為Bikunin)
圖5.Western blot檢測融合蛋白Bikunin的表達(dá)1磷酸鈣轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清(在約50kD處見有陽性條帶)；2陰性對照五具體實施方式
本發(fā)明應(yīng)用RT-PCR方法，從人肝細(xì)胞系L02擴增Bikunin，將其克隆于pMD18-T Simple Vector中構(gòu)建pMD18-T-Bikunin，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后，將Bikunin亞克隆至真核表達(dá)載體pSecTag2B中，經(jīng)酶切及PCR鑒定，證明構(gòu)建成功含有Bikunin的真核表達(dá)載體pSecTag2B-Bikunin。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，24小時后，Western blot檢測濃縮25倍的細(xì)胞培養(yǎng)上清，證明有融合蛋白的表達(dá)。
材料與來源試劑，Trizol和pSecTag2B為Invitrogen公司產(chǎn)品；引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；pMD18-T Simple vector及應(yīng)用的酶類和試劑盒，除特殊標(biāo)明外，均購于大連寶生物工程有限公司；序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)完成。
實施例1.目的基因的獲得常規(guī)從人肝細(xì)胞系L02中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為RNA 1μg，5X AMV buffer 4μl，dNTP 1mM，RNase Inhibitor 20U，Oligo(dT)18Primer 50pmol，AMV Reverse Transcriptase 5U，DEPC H2O加至20μl。混勻，42℃反應(yīng)1小時，冰上放置2分鐘。PCR反應(yīng)引物上游引物5’-cca taagct tag agt ccg gag ggc tgt gct acc cca aga a-3’，下游引物5’-att tggatc cca gtt gga gaa gcg cag cag ctc ctc atc-3’，分別含有Hand III和Bam HI酶切位點(下畫線部分)。反應(yīng)體系為cDNA 1μl，5X Prime STAR buffer6.0μl，dNTP 0.2mM，Prime STAR DNA polymerase 0.3μl，Primer 50pmol，反應(yīng)體積為30μl。反應(yīng)條件為95℃變性5分鐘，95℃30秒，66℃30秒，72℃30秒，35個循環(huán)，72℃延伸10分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖電泳鑒定。
2.pMD18-T-Bikunin載體的構(gòu)建應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0試劑盒(按說明書操作)切膠回收目的片段，然后應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa DNA A-Tailing Kit試劑盒進(jìn)行3’端加A反應(yīng)(按說明書操作)。加A后的產(chǎn)物與pMD18-T Simple vector連接(應(yīng)用Takara DNA Ligation Kit)，反應(yīng)體系為pMD18-T Simple vector1μl，上述PCR加A產(chǎn)物0.2pmol，加H2O至5μl后加入等量(5μl)LigationMix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時，取適量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說明書操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對序列進(jìn)行測定證實插入片段為目的基因Bikunin。pMD18-T-Bikunin載體的構(gòu)建成功。
3.pSecTag2B-Bikunin的構(gòu)建用Hand III和Bam HI分別對pMD1B-T-Bikunin和pSecTag2B進(jìn)行雙酶切，用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0試劑盒(按說明書操作)切膠回收目的片段，按載體∶酶切產(chǎn)物(1∶5)混合(總體積5μl)，加入等量(5μl)LigationMix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時，取適量菌液涂布含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。挑取菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說明書操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定構(gòu)建的載體。
4.pSecTag2B-Bikunin在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)磷酸鈣沉淀法20μg pSecTag2B-Bikunin用去離子水稀釋至100μl，同時將50μl 2.5M CaCl2加入到350μl的去離子水中。100μl稀釋的20μgpSecTag2B-Bikunin逐滴滴入稀釋的CaCl2中。將上述DNA/CaCl2混合液逐滴加入500μl 2X HeBS，邊加入，邊吹打混合，隨即在旋渦混合儀上振蕩5秒。室溫靜置20分鐘以形成沉淀。將沉淀逐滴均勻加入細(xì)胞中，輕輕晃動。標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)12小時，換液。培養(yǎng)24-48小時收集培養(yǎng)上清。培養(yǎng)上清濃縮20-25倍，行Westen blot檢測。證明有融合蛋白Bikunin的表達(dá)。見附圖。
權(quán)利要求
1.一種Bikunin真核細(xì)胞表達(dá)載體，其特征是該載體表達(dá)產(chǎn)物為含有Myc和組氨酸標(biāo)簽的Bikunin融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述Bikunin真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于Bikunin克隆于人肝細(xì)胞系L02，將其克隆于pMD18-T Simple Vector中，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后，再亞克隆至真核表達(dá)載體pSecTag2B中，構(gòu)建含有Bikunin的真核表達(dá)載體pSecTag2B-Bikunin，用磷酸鈣沉淀法將pSecTag2B-Bikunin轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，表達(dá)了融合蛋白Bikunin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白Bikunin在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生制藥技術(shù)領(lǐng)域，所述構(gòu)建含有Bikunin的真核表達(dá)載體pSecTag2B－Bikunin所表達(dá)的產(chǎn)物為帶有Myc和組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。本發(fā)明應(yīng)用RT－PCR方法，從人肝細(xì)胞系L02擴增Bikunin，將其克隆于pMD18－T SimpleVector中構(gòu)建pMD18－T－Bikunin，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后，將Bikunin亞克隆至真核表達(dá)載體pSecTag 2B中，經(jīng)酶切及PCR鑒定，證明構(gòu)建成功含有Bikunin的真核表達(dá)載體pSecTag2B－Bikunin。用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，24小時后，Western blot檢測濃縮25倍的細(xì)胞培養(yǎng)上清，證明有融合蛋白的表達(dá)。該蛋白作為生物制劑可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的治療。
文檔編號A61P35/00GK1884554SQ20061008544
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者孫國勛, 張辰宇, 李朝軍, 項陽 申請人:南京大學(xué)