專利名稱：肖菝葜屬植物提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肖菝葜屬植物提取物及其制備方法和應(yīng)用，具體地說，是含有酚苷、黃酮苷的肖菝葜屬植物提取物及其制備方法和應(yīng)用，以及含有該提取物的藥物組合物，本發(fā)明尤其指的是原植物為肖菝葜屬植物的白土苓藥材提取物。
背景技術(shù)：
土茯苓為常用中藥，來源為菝葜屬植物土茯苓?！侗静菥V目》記載“土茯苓有赤白兩種，入藥用白者良”。土茯苓為李時(shí)珍所指的赤者，也就是說，上述土茯苓中的赤者實(shí)質(zhì)上為真正土茯苓。藥理研究結(jié)果表明土茯苓及同屬植物的乙酸乙酯提取物對心血管系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用，水提取物具有免疫調(diào)節(jié)作用，此外土茯苓還有抗菌、抗腫瘤等多種功效；而白者其實(shí)為白土茯苓，民間習(xí)稱白土苓，在很多地區(qū)常作為土茯苓的代用品，白土苓來源可分為肖菝葜屬植物肖菝葜、短柱肖菝葜或華肖菝葜，或者是三個(gè)品種的混合物，相對土茯苓而言，針對白土苓開展的化學(xué)及藥理研究則顯得相對較少。
已有的化學(xué)成分研究表明，土茯苓中含有皂苷類、黃酮(苷)、苯丙素類、甾醇類等化合物，而對于白土茯苓，目前僅有對肖菝葜的脂溶性成分進(jìn)行的化學(xué)成分的研究報(bào)道。由于對白土苓的基礎(chǔ)研究較少，有些處方只是注明成分含有肖菝葜屬植物的白土苓，但也僅僅在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了對白土苓采用薄層色譜與對照藥材進(jìn)行對照的籠統(tǒng)的定性鑒別，缺少定量控制指標(biāo)，造成白土苓在用藥和制劑中化學(xué)成分復(fù)雜，不易進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)研究，得到了肖菝葜屬植物(肖菝葜、短柱肖菝葜或華肖菝葜)的有效部位，該提取物是肖菝葜屬植物粗提物經(jīng)過精制而制得，其中有效成分明確，含量較高，達(dá)到了明確肖菝葜屬植物(尤其是白土苓)有效部位的組成和含量、并可大輻降低服用量的目的，從而提高了生物利用度，并且研究了肖菝葜屬植物的抗腫瘤活性的藥理藥效。
本發(fā)明的目的在于提供一種肖菝葜屬植物提取物，其由常規(guī)提取以及有針對性的精制方法制得，該提取物成分明確，具有明顯的抗腫瘤的活性。
本發(fā)明的目的還在于提供肖菝葜屬植物提取物的制備方法，該方法包括提取精制過程，尤其是采用依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑萃取和大孔吸附樹脂進(jìn)行有效成分的富集等技術(shù)，使得肖菝葜屬植物提取物中有效成分明確、含量高、雜質(zhì)少，更有利于其在抗腫瘤制劑上的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種肖菝葜屬植物提取物，其中以該提取物的總重量計(jì)，其至少含有酚苷10％，黃酮苷10％，所述酚苷包括4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羥基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羥基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷等，所述黃酮苷包括芒果苷，橙皮苷，等色原酮，酮和二氫黃酮苷等。
其中用高效液相色譜法測得黃酮苷中橙皮苷的重量含量至少為0.5％，優(yōu)選1-5％。
經(jīng)過藥理試驗(yàn)測試，本發(fā)明的含有上述成分的提取物具有明顯的抗腫瘤活性，尤其對lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180均具有顯著的抑制作用。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，具有抑制腫瘤效果的提取物其由以下方法制得(1)將肖菝葜屬植物用至少2倍量的10-95％濃度醇提取，得到提取液；(2)提取液濃縮得濃縮液，加水使其混懸；(3)靜止，濾過，取濾液備用；(4)取上述濾液，上大孔樹脂柱，以水洗脫至洗脫液糖反應(yīng)為陰性，棄去水洗脫液；(5)以濃度不超過90％的醇洗脫，洗脫液濃縮，即得。
以提取物總重計(jì)，肖菝葜屬植物提取物中至少含有酚苷10％，黃酮苷10％。其中酚苷優(yōu)選為10％-90％，更優(yōu)選40-60％；黃酮苷優(yōu)選為10％-90％，更優(yōu)選為40-60％；所述的肖菝葜屬植物主要是指肖菝葜屬植物肖菝葜、短柱肖菝葜或華肖菝葜，尤其是指白土苓。
由于本發(fā)明的提取物中所含有的有效成分為混合物，其所含有的經(jīng)檢測已經(jīng)明確的有效化合物成分包括酚苷和黃酮苷等，至今沒有文獻(xiàn)公開報(bào)道肖菝葜屬植物(包括肖菝葜、短柱肖菝葜或華肖菝葜)在治療腫瘤方面有效成分的合理組成是什么，優(yōu)選治療量是多少，這樣勢必導(dǎo)致出現(xiàn)量效關(guān)系不容易把握、療效不穩(wěn)定等缺陷性特點(diǎn)，尤其對于適合治療腫瘤的中藥注射劑型來說，組成成分確切、含量準(zhǔn)確更易于把握制劑質(zhì)量。申請人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的制備方法得到的提取物中確切的療效化合物是(但不僅僅是)治療有效量的酚苷和黃酮苷，于是本發(fā)明進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果證實(shí)，肖菝葜屬植物提取物中黃酮苷的含量至少為10％，而且其中的橙皮苷的含量占黃酮苷總重的至少0.5％，其治療效果是最佳的。
本發(fā)明還提供了一種肖菝葜屬植物提取物的制備方法，其中包括將肖菝葜屬植物用至少2倍量的10-95％濃度醇，提取得到提取液；將其濃縮得濃縮液，加水使其混懸；靜置，濾過，取濾液備用；將上述濾液上大孔樹脂柱，所述的大孔吸附樹脂優(yōu)選為可以去除糖類成分的吸附樹脂，例如AB-8，D-101，HP-20等，優(yōu)選DIALON HP-20，以水洗脫至洗脫液糖反應(yīng)為陰性；以濃度不超過90％的醇洗脫即得。也可根據(jù)需要將洗脫液濃縮，減壓干燥，得到提取物干燥成品。
上述制備方法，其中提取用的醇優(yōu)選乙醇。
在大量的實(shí)驗(yàn)中，申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取用的醇濃度為10-75％時(shí)，所述制備方法中經(jīng)過大孔吸附樹脂的精制即可得到對腫瘤細(xì)胞有抑制作用初步的目標(biāo)提取物，而當(dāng)提取用醇的濃度超過70％，尤其是超過75％，則優(yōu)選在大孔樹脂吸附之前還包括用至少為0.5倍濾液重量的低極性溶劑、中等極性溶劑萃取除雜，所述的低極性溶劑為snyder參數(shù)ε0＜0.4的溶劑，中等極性溶劑為snyder參數(shù)0.4＜ε0＜0.6的溶劑，至少萃取一次，再用較高極性溶劑萃取有效成分，所述較高極性溶劑為snyder參數(shù)ε0＞0.6的溶劑，將較高極性溶劑的萃取液上大孔樹脂柱。將較高極性的溶劑例如正丁醇的萃取液上大孔樹脂柱，得到的提取物富集了對lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180均具有明顯抑制作用的活性成分，該提取物可以稱為有效部位或有效成分的總和。
所述的低極性的溶劑為可以去除脂肪族成分的溶劑，優(yōu)選snyder參數(shù)ε0＜0.4的低極性溶劑，其選自石油醚、乙醚、丙酮和異丙醇中至少一種；中等極性的溶劑為可以去除甾醇、萜類成分的溶劑，優(yōu)選snyder參數(shù)0.4＜ε0＜0.6的中等極性溶劑，其為氯仿和/或乙酸乙酯；所述的較高極性的溶劑優(yōu)選其snyder參數(shù)ε0＞0.6，主要為正丁醇。
上述制備方法中洗脫用醇的濃度為90％，收集的是90％以下濃度醇洗脫的成分(不包括水洗脫下來的成分)，但從盡可能去粗存精的的角度衡量，優(yōu)選洗脫用醇的濃度為60％，收集60％以及濃度60％以下的醇洗脫的成分，更優(yōu)選收集10％～60％的醇的洗脫液。
本發(fā)明方法中對肖菝葜屬植物的乙醇(尤其是較高濃度的乙醇)提取物采用依次以石油醚、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑或溶劑組合萃取至少一次的好處在于，最大程度地除去脂溶性成分，尤其是70～95％濃度醇提取物，其中含有一些對抑制腫瘤來說屬于雜質(zhì)的脂溶性成分，更優(yōu)選采用極性小的有機(jī)溶劑將其除去，綜合考慮工業(yè)上生產(chǎn)的條件和設(shè)備要求，可以選擇一些適用的有機(jī)溶劑，例如石油醚、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等分別進(jìn)行萃??；而最終的試驗(yàn)證明，正丁醇萃取液中含有的是本發(fā)明欲得到的對lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180等均具有明顯抑制作用的有效成分，其效果優(yōu)于不經(jīng)過上述溶劑萃取得到的提取物的活性。
上述方法中的萃取用各溶劑的用量優(yōu)選為被萃取液重量的3-5倍。
為了進(jìn)一步得到更加精制的提取物，本發(fā)明還優(yōu)選將上述得到的正丁醇萃取液濃縮后加水溶解，上大孔吸附樹脂柱，先以水沖洗，除去糖類成分，再以30％乙醇洗脫，目的是將吸附于樹脂柱的有效成分洗脫下來，所述的大孔吸附樹脂為可以除去糖類物質(zhì)的本領(lǐng)域公知的樹脂，例如AB-8，D-101，HP-20等，優(yōu)選DIALON HP-20。
本發(fā)明的提取精制方法與現(xiàn)有技術(shù)公開的土茯苓的提取方法相比，富集了包括白土苓藥材在內(nèi)的肖菝葜屬植物提取物的有效部位，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于土茯苓的提取多是制備總皂苷，保留的是正丁醇萃取部位的成分。而本發(fā)明的目的和創(chuàng)新之處在于同時(shí)保留酚苷和黃酮苷，通過有機(jī)溶劑萃取和大孔樹脂吸附，盡可能除去糖類和脂溶性成分，得到的提取物可以直接制備成藥物制劑用于治療和抑制腫瘤，對lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180等均具有明顯抑制作用，其抑制率分別為39.2％、30.9％和40％，其功效和安全性得到了最大限度的保證。
本發(fā)明以白土苓為例，其經(jīng)過上述方法得到的有效部位的含量測定方法為分光光度法(例如紫外分光光度)法，操作步驟為標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取橙皮苷對照品50mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密量取1，2，3，4，5，6ml，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。按照紫外分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄V A)，在320nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法取本品10mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。在320nm處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含黃酮苷(以橙皮苷計(jì))的重量，計(jì)算，即得黃酮苷含量。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其含有臨床治療有效量的肖菝葜屬植物提取物和藥物輔料，該藥物臨床推薦有效劑量為10-500mg/日，優(yōu)選30-50mg/日。
上述藥物組合物包括口服劑型和注射劑型。在上述藥物中，以注射劑型為例，作為與有效部位配合使用的輔助成分，根據(jù)不同的具體注射劑，建議選用甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷或氯化鈉中的至少一種。例如，對于凍干粉針劑，可采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水為溶媒，取提取物加入適量支架劑凍干而成，建議選用甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷中的至少一種作為輔助的支架劑，與所說的提取物共同組成；其中優(yōu)選甘露醇作為支架劑。對于可供直接使用的輸液制劑形式的藥物，則可以選用甘露醇、葡萄糖、氯化鈉中的至少一種作為輔助成分；其中尤以采用氯化鈉作為輔助成分為優(yōu)選。對于制備小針劑注射液和大輸液制劑時(shí)，可加入抗氧劑，抗氧劑可以是抗壞血酸、抗壞血酸鈉、硫代硫酸鈉和焦亞硫酸鈉中的一種或幾種，也可以加入金屬螯合劑，如EDTA?？诜苿┌ㄆ瑒?普通片劑、分散片、緩釋、控釋片、泡騰片、口崩片)、膠囊劑(硬膠囊、軟膠囊、緩釋、控釋膠囊)、顆粒劑、滴丸、口服液、栓劑，均可選用常規(guī)輔料。
本發(fā)明還提供了上述含有肖菝葜屬植物提取物的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明肖菝葜屬植物提取物藥效試驗(yàn)結(jié)果如下(肖菝葜屬植物提取物以白土苓為例)，經(jīng)過本發(fā)明的上述提取方法得到的白土苓提取物用X表示，常規(guī)不經(jīng)過除去糖等雜質(zhì)的白土苓醇水提取物以Y表示，其中Y含有糖類成分約80％，含有酚苷約2-5％、黃酮苷約2-5％和少量其他成分(雜質(zhì))如甾醇、萜類等。
對小鼠H-22肝癌生長的抑制作用樣品X，褐色粘稠狀，無明顯氣味，溶于水。
實(shí)驗(yàn)動物II級KM小鼠，雌，體重21～23g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。
瘤原，H-22，單位傳代保存。
動物飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)，溫度22～27℃，相對濕度50～70％，自由攝取基礎(chǔ)飼料，飲用純凈水。每周換窩兩次，五只一籠。
試劑與設(shè)備注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號04053121；天平。
劑量設(shè)計(jì)環(huán)磷酰胺重復(fù)原設(shè)計(jì)100mg/kg；X.由于樣品量微，未做LD50(最大耐受量)，故以5∶1設(shè)lg/kg，0.2g/kg，0.04g/kg，0.008g/kg四組。
方法選擇腫瘤生長旺盛、無潰破、健康良好的荷瘤小鼠，脫臼處死，無菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理鹽水，制成細(xì)胞懸液，于左腋窩皮下接種0.2ml。
72只小鼠隨機(jī)分為6組，空白對照組、陽性對照組、X1g組、X0.2g組、X0.04g組和X0.008g組，每組12只，雌雄各半。
接種24h后給藥?？瞻讓φ战M每天以生理鹽水0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)10天；X的1g組每天以0.02g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)10天；0.2g組每天以0.004g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)10天；0.04g組每天以0.008g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)10天；0.008g組每天以0.0016g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)10天。環(huán)磷酰胺組于接種24h后以100mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔給藥。
申請人同時(shí)也對常規(guī)提取方法得到的，即不經(jīng)過除去糖等雜質(zhì)的白土苓醇水提取物Y按照上述方法做以相同試驗(yàn)條件的藥理實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證未經(jīng)除雜的提取物對小鼠H-22肝癌的生長抑制作用，結(jié)果表明，在等劑量下，含有多糖等成分的常規(guī)白土苓提取物對小鼠H-22肝癌的生長抑制幾乎沒有明顯的作用，對比的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未提供在上表中。
討論1.空白對照組平均瘤重1.4g，大于1g；最小瘤重1.1g，均大于0.4g。移植瘤生長良好，試驗(yàn)成立。
2.通常使用環(huán)磷酰胺做陽性對照藥的劑量是50mg/kg體重，腹腔注射，濃度為0.2ml/20g體重。對H-22的抑制率一般在50～60％。
3.X1g組，無論是抑瘤率還是t檢驗(yàn)均表明該藥對H-22有一定療效。X0.2g組在給藥四次后動物有中毒表現(xiàn)，隨后停藥。X0.04g組和X0.008g組均給藥10次，其中X0.04g組抑瘤率為30％，與空白對照組比較(t檢驗(yàn))，P＝0.09，有顯著性差異。
對小鼠Lewis肺癌的生長抑制作用樣品X，褐色粘稠狀，無明顯氣味，溶于水。
實(shí)驗(yàn)動物II級C57小鼠，雌雄各半，體重18～23g，由中國醫(yī)科院血研所動物室提供，許可證號scxk(津)2004-0001；動物飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)，溫度20～22℃，相對濕度40～58％，自由攝取基礎(chǔ)飼料飲用純凈水。每周換窩兩次，五只一籠。瘤原Lewis肺癌，中國醫(yī)科院腫瘤所試驗(yàn)中心提供。
試劑與設(shè)備1.注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號04053121。
2.電子天平，T500型，d＝0.1g，美國雙杰兄弟(集團(tuán))公司常州常熟雙杰測試儀器廠生產(chǎn)。
劑量設(shè)計(jì)1.環(huán)磷酰胺按傳統(tǒng)劑量50mg/kg。
2.由于在X對小鼠H-22抑瘤試驗(yàn)中，0.04g/kg體重組有效，0.008mg/kg體重組無效，1g/kg及0.2g/kg兩組均出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，故設(shè)0.08g/kg，0.04g/kg，0.02g/kg，三個(gè)劑量組。
方法選擇腫瘤生長旺盛、無潰破、健康良好的荷瘤小鼠，脫臼處死，無菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理鹽水，制成細(xì)胞懸液，于左腋窩皮下接種0.2ml。
60只C57小鼠 隨機(jī)分為5組，空白對照組、陽性對照組，X0.08g/kg組、X0.04g/kg組和X0.02g/kg組，每組12只，雌雄各半。
接種24h后給藥?？瞻讓φ战M每天以生理鹽水0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)8天；X0.08g/kg組每天以X0.016g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)8天；X0.04g/kg組每天以F0.008g/0.4ml/20。體重灌胃連續(xù)8天；X0.02g/kg組每天以F0.004g/0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)8天。環(huán)磷酰胺組于接種24h后以50mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔給藥。
討論1.空白對照組平均瘤重1.76g，大于1g；最小瘤重1.22g，均大于0.4g。移植瘤生長良好，移植瘤模型成功。
2.環(huán)磷酰胺做陽性對照藥的劑量是50mg/kg體重，腹腔注射，濃度為0.2ml/20g體重。對Lewis肺癌的抑制率為62.5％，與以往試驗(yàn)結(jié)果相近。
3.關(guān)于X0.08、0.04、0.02g/kg三個(gè)劑量組給藥8天后均顯示對Lewis肺癌有很好的抑制作用，與空白組比較均有顯著性差異，而且抑瘤率均大于30％。
對小鼠S-180的生長抑制作用樣品X，褐色粘稠狀，無明顯氣味，溶于水。
實(shí)驗(yàn)動物II級C57小鼠，雌雄各半，體重18～23g，由中國醫(yī)科院血研所動物室提供，許可證號scxk(津)2004-0001，動物飼養(yǎng)在IVC系統(tǒng)，溫度20～22℃，相對濕度40～58％，自由攝取基礎(chǔ)飼料飲用純凈水。每周換窩兩次，五只一籠。瘤原Lewis肺癌，中國醫(yī)科院腫瘤所試驗(yàn)中心提供。
試劑與設(shè)備1.注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號04053121。
2.電子天平，T500型，d＝0.1g，美國雙杰兄弟(集團(tuán))公司常州常熟雙杰測試儀器廠生產(chǎn)。
劑量設(shè)計(jì)1.環(huán)磷酰胺按我所傳統(tǒng)劑量50mg/kg。
2.設(shè)0.2g/kg，0.04g/kg，0.008g/kg三個(gè)劑量組。
方法選擇腫瘤生長旺盛、無潰破、健康良好的荷瘤小鼠，脫臼處死，無菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理鹽水，制成細(xì)胞懸液，于左腋窩皮下接種0.2ml。
60只C57小鼠 隨機(jī)分為5組，空白對照組、陽性對照組，X0.08g/kg組、X0.04g/kg組和X0.02g/kg組，每組12只，雌雄各半。
接種24h后給藥?？瞻讓φ战M每天以生理鹽水0.4ml/20g體重灌胃連續(xù)8天；給藥組灌胃連續(xù)8天。環(huán)磷酰胺組于接種24h后以100mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔給藥。
討論1.空白對照組平均瘤重1.76g，大于1g；最小瘤重1.22g，均大于0.4g。移植瘤生長良好，移植瘤模型成功。
2.環(huán)磷酰胺做陽性對照藥的劑量是100mg/kg體重，腹腔注射，濃度為0.2ml/20g體重。對Lewis肺癌的抑制率為92.9％，與以往試驗(yàn)結(jié)果相近。
3.從各表中數(shù)據(jù)可以看出本發(fā)明的提取物具有抑制腫瘤的活性，并且與環(huán)磷酰胺比較其副作用顯著降低，具有可開發(fā)的前景。
關(guān)于0.2、0.04兩個(gè)劑量組給藥8天后均顯示對S-180肉瘤有很好的抑制作用，與空白對照組比較均有極顯著性差異，而且抑瘤率均大于30％，尤其是X0.2組的抑瘤率大于40％。
本發(fā)明的藥理實(shí)驗(yàn)中涉及的提取物按照實(shí)施例1的方法制得。


圖1本發(fā)明提取物中分離的橙皮苷的氫—核磁共振圖譜；圖2本發(fā)明提取物中分離的橙皮苷的碳—核磁共振圖譜。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明，并非對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實(shí)施例1肖菝葜屬植物提取物取短柱肖菝葜的干燥根莖，切片，用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水適量使混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，分別回收溶劑，得正丁醇部位(提取率約為原生藥量的1％)；正丁醇部位的浸膏加水溶解，上大孔樹脂柱(DIALON HP-20)，先以水沖洗，再以60％乙醇洗脫至洗脫液無色，即可(即，藥理學(xué)研究中的X)。
經(jīng)檢測，該提取物中酚苷約為50％，黃酮苷約為50％；其中用高效液相色譜法測定，經(jīng)過對圖譜吸收峰的計(jì)算，得到黃酮苷中橙皮苷的重量含量約為2％。
經(jīng)過化合物的分離和純化，并且通過理化反應(yīng)及波譜分析等方法，證實(shí)了上述酚苷包括4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羥基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羥基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷，所述黃酮苷包括芒果苷，橙皮苷，等色原酮，酮同和二氫黃酮苷。
分離和純化方法如下取肖菝葜屬植物(例如短柱肖菝葜)的干燥根莖飲片，用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水適量使混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，回收溶劑，分別得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。
正丁醇部位經(jīng)大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱色譜，分別用水，10％，30％60％的乙醇梯度洗脫。按洗脫順序分成四部分。
第一部分上LH-20凝膠柱，以水-甲醇梯度洗脫，于水洗脫流分中分別得到4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(180mg)和4-羥基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(250mg)；10％甲醇洗脫流分中得到4-羥基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷(350mg)、4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(220mg)；30％甲醇洗脫流分中得到一色原酮苷(120mg，結(jié)構(gòu)待定)、甲醇洗脫流分中得到3，5，7，4’-四羥基-二氫黃酮-6-C-鼠李糖(1-4)葡萄糖苷(300mg)；第二部分上LH-20凝膠柱，以水-甲醇梯度洗脫，于90％甲醇洗脫流分中得到芒果苷(320mg)、甲醇洗脫流分中得到一酮苷，即1，3，6，7-四羥基酮-3-O-葡萄糖苷(200mg)；第三部分上LH-20凝膠柱，以水-甲醇梯度洗脫，于50％甲醇洗脫流分中得到橙皮苷(300mg)，將橙皮苷溶于二甲亞砜(DMSO)溶液中，經(jīng)核磁共振的氫譜和碳譜分析(儀器的型號為INOVA-5001H-NMR和INOVA-50013C-NMR，譜圖見圖1和圖2)，并與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振圖譜對照，證明測定的成分即為橙皮苷。
第一部位富集成分均屬于酚苷和黃酮苷類，計(jì)算其含量為占提取物總重的50％；第二、三部分富集的成分屬于黃酮苷，計(jì)算其含量占提取物總重50％。
實(shí)施例2肖菝葜屬植物提取物取肖菝葜的干燥根莖(10千克)，切片，用8倍量90％乙醇回流提取4次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水適量使混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇1倍量，各萃取3次，分別回收溶劑。得正丁醇部位，正丁醇部位的浸膏加水溶解，上大孔樹脂柱(DIALON HP-20)，先以水沖洗，再以60％乙醇洗脫至洗脫液無色，即可(即，藥理學(xué)研究中的X)。
經(jīng)檢測，該提取物中酚苷含量約為45％，黃酮苷含量約為55％。其中用高效液相色譜法測定，得到黃酮苷中橙皮苷的重量含量約為3％。
實(shí)施例3肖菝葜屬植物提取物取華肖菝葜的干燥根莖，切片，用8倍量40％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水適量使混懸，靜置24小時(shí)；濾過，濾液上大孔樹脂柱(DIALON HP-20)，先以水沖洗，再以60％乙醇洗脫至洗脫液無色，回收溶劑即可。
經(jīng)檢測，該提取物中酚苷含量約為50％，黃酮苷含量約為50％。
其中用高效液相色譜法測定，得到黃酮苷中橙皮苷的重量含量約為3.5％。
實(shí)施例4肖菝葜屬植物提取物凍干粉針的制備稱取310g右旋糖苷，溶于4500毫升注射用水中，再稱取按本發(fā)明方法制備的提取物350g，溶于上述溶液中。用20％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。加入配制量的0.1％針用活性炭加熱攪拌15分鐘，抽濾，濾液補(bǔ)充加入注射用水至5000毫升。精濾，中間體檢查，灌裝，凍干，壓蓋，成品檢查，包裝。
實(shí)施例5大輸液的制備取按上述方法制得的提取物50g，加入834.7g氯化鈉和90L的注射用水，攪拌溶解，加0.1mol/L NaOH適量，調(diào)pH約為7.0，補(bǔ)充注射用水至足量，再加入液量0.15％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘，抽濾除碳，測定含量、pH值合格后，再精濾分裝，(105℃)熱壓滅菌，即得。
實(shí)施例6小水針的制備取按上述方法制得的提取物300g，加入80.0g氯化鈉和10L的注射用水，攪拌溶解，加0.1mol/L NaOH適量，調(diào)pH約為7.0，加入10g抗氧劑硫代硫酸鈉，補(bǔ)充注射用水至足量，再加入液量0.1％的針用活性炭，攪拌15分鐘，抽濾除碳，測定含量、pH值合格后，再精濾分裝，(105℃)熱壓滅菌，即得。
實(shí)施例7 口服液的制備取按上述方法制得的提取物250g，葡萄糖50g，加水1L，攪拌溶解，加入10g抗氧劑硫代硫酸鈉，補(bǔ)充水至10L，混勻，濾過，分裝，熱壓滅菌，即得。
實(shí)施例8 分散片的制備取按上述方法制得的提取物25g，微晶纖維素35g，淀粉10g，羧甲基淀粉5g，以5％PVP溶液為粘合劑制粒，壓片，即得。
實(shí)施例9 滴丸的制備取PEG-6000 50-100g，加熱融化，加入按上述方法制得的提取物25g，滴成滴丸，即得。
實(shí)施例10 滴丸的制備取PEG-4000 60-100g，加熱融化，加入按上述方法制得的提取物25g，滴成滴丸，即得。
實(shí)施例11膠囊的制備取按上述方法制得的提取物250g，淀粉100g，以20％乙醇為粘合劑制粒，裝膠囊，即得。
實(shí)施例12顆粒劑的制備取按上述方法制得的提取物250g，葡萄糖100g，糊精200g，以稀淀粉糊為粘合劑制粒，分裝，即得。
實(shí)施例13片劑的制備取按上述方法制得的提取物25g，加淀粉50g，混勻，以淀粉漿為粘合劑，制粒，烘干，整粒，壓片，即得。
實(shí)施例14片劑的制備取按上述方法制得的提取物25g，加淀粉40g，糊精10g，混勻，以淀粉漿為粘合劑，制粒，烘干，整粒，壓片，即得。
實(shí)施例15軟膠囊的制備取按實(shí)施例1的方法制得的提取物250g，加植物油550g，蜂蠟50g，加熱混勻，裝入囊材中，制成軟膠囊即得。
權(quán)利要求
1.一種肖菝葜屬植物提取物，以該提取物總重計(jì)，其中至少含有酚苷10％，黃酮苷10％。
2.如權(quán)利要求1所述的肖菝葜屬植物提取物，其中該提取物中含有的酚苷為10％-90％、黃酮苷為10％-90％。
3.如權(quán)利要求1所述的肖菝葜屬植物提取物，其由以下方法制得(1)肖菝葜屬植物用至少2倍量的10-95％濃度醇，提取得到提取液；(2)提取液濃縮得濃縮液，加水使其混懸；(3)靜置，濾過，取濾液備用；(4)取上述濾液，上大孔樹脂柱，以水洗脫至洗脫液糖反應(yīng)為陰性，棄去水洗脫液；(5)以濃度不超過90％的醇洗脫，洗脫液濃縮，即得到肖菝葜屬植物提取物；以該提取物總重計(jì)，所述的肖菝葜屬植物提取物中至少含有酚苷10％，黃酮苷10％。
4.權(quán)利要求1所述的肖菝葜屬植物提取物的制備方法，其中包括(1)肖菝葜屬植物用至少2倍量的10-95％濃度醇，提取得到提取液；(2)提取液濃縮得濃縮液，加水使其混懸；(3)靜置，濾過，取濾液備用；(4)取上述濾液，上大孔樹脂柱，以水洗脫至洗脫液糖反應(yīng)為陰性，棄去水洗脫液；(5)以濃度不超過90％的醇洗脫，即得。
5.權(quán)利要求4所述的制備方法，其中步驟(1)中提取用的醇濃度為70-95％。
6.權(quán)利要求4或5所述的制備方法，在步驟(3)之后還包括依次用至少為0.5倍濾液重量的低極性溶劑、中等極性溶劑萃取除雜，所述的低極性溶劑為snyder參數(shù)ε0＜0.4的溶劑，中等極性溶劑為snyder參數(shù)0.4＜ε0＜0.6的溶劑，至少萃取一次，再用較高極性溶劑萃取有效成分，所述較高極性溶劑為snyder參數(shù)ε0＞0.6的溶劑，將較高極性溶劑的萃取液上大孔樹脂柱。
7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其中snyder參數(shù)ε0＜0.4的低極性溶劑選自石油醚、乙醚、丙酮和異丙醇中至少一種，snyder參數(shù)0.4＜ε0＜0.6的中等極性溶劑為氯仿和/或乙酸乙酯，snyder參數(shù)ε0＞0.6的較高極性溶劑為正丁醇。
8.權(quán)利要求4所述的制備方法，其中洗脫用醇的濃度為60％。
9.一種藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的肖菝葜屬植物提取物和藥學(xué)可接受的輔料。
10.權(quán)利要求1所述的肖菝葜屬植物提取物在制備治療抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肖菝葜屬植物提取物及其制備方法，該提取物至少含酚苷10％，黃酮苷10％；提取方法包括用高濃度醇回流提取藥材，濃縮至無醇味，加水使混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，或其它有機(jī)溶劑，或含有機(jī)溶劑的組合依次萃取，分別回收溶劑，得正丁醇提取物；或以稀醇提取，提取液回收溶劑得提取物，以該提取物加水分散后上大孔樹脂柱，以水洗脫至洗脫液不含糖，再以含醇水溶液洗脫，洗脫液回收溶劑，得提取物；該提取物具有抗腫瘤的活性。
文檔編號A61P35/00GK1903340SQ20061008905
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者林瑞超, 王鋼力, 戴忠, 姚令文, 秦文潔 申請人:中國藥品生物制品標(biāo)準(zhǔn)化研究中心