專利名稱：：凋亡基因Caspase-4為靶標(biāo)的反義寡核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說涉及一種靶向凋亡基因Ca印ase-4為靶標(biāo)的反義寡核苷酸及其用途。
背景技術(shù)：
：機(jī)體的生理狀態(tài)是一種細(xì)胞內(nèi)分子信號傳導(dǎo)通路組成的分子相互作用動力學(xué)網(wǎng)絡(luò)的平衡。輻射作為一種細(xì)胞的物理刺激信號，可以引起多種細(xì)胞的病理反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路和網(wǎng)絡(luò)的異常并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、進(jìn)而引起多器官損傷，甚至功能衰竭和死亡。從這層意義上看放射病實(shí)際上是一種輻射引起的機(jī)體細(xì)胞凋亡等分子信號傳導(dǎo)通路組成的相互作用動力學(xué)網(wǎng)絡(luò)平衡的失調(diào)。大量研究己表明，輻射可以激活細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑和眾多基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞周期改變和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期改變和DNA的損傷修復(fù)與細(xì)胞放射敏感性之間具有明顯的相關(guān)性，于是，那些影響這些輻射反應(yīng)的基因，理所當(dāng)然會對細(xì)胞的放射敏感性產(chǎn)生不同程度的影響。大量研究表明它們不僅是腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的生物標(biāo)志，而且可以作為輻射防護(hù)和增敏藥物的潛在靶標(biāo)。針對這些潛在靶標(biāo)設(shè)計(jì)的藥物將成為新一代的輻射防護(hù)藥和增敏藥物。反義脫氧寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynuclecotide,AS0DN)是一段與mRNA或DNA特異性結(jié)合并阻斷其基因表達(dá)的人工合成的DNA分子。與傳統(tǒng)藥物相比，反義藥物具有更高的特異性、更優(yōu)的療效和更低的毒性。因此，反義藥物越來越成為人們研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。其中，反義藥物作為腫瘤輻射增敏劑已被大量研究。同樣如果反義序列靶向的是輻射敏感靶基因，反義寡核苷酸藥物便可以用于輻射防護(hù)。
發(fā)明內(nèi)容半光氨酸蛋白酶基因家族在細(xì)胞的凋亡中具有非常重要的作用。本發(fā)明的目的是選擇凋亡相關(guān)基因Caspase-4為靶標(biāo)，利用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)發(fā)明的反義寡核苷酸設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)5條反義寡核苷酸序列(表l),對這些序列進(jìn)行篩選獲得輻射防護(hù)藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。寡核苷酸序列采用PE公司產(chǎn)391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經(jīng)MicroPureII反向柱(SolidPhaseScience)純化后，以此產(chǎn)物作為輻射防護(hù)藥物。表l反義寡核苷酸序列及特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發(fā)明的主要內(nèi)容是選取了Caspase基因作為靶標(biāo)進(jìn)行輻射防護(hù)反義寡核苷酸的篩選和評價。Caspase-4是Caspase-1亞家族中的一員，該基因主要存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激時，該基因編碼的蛋白前體斷裂活化，活化的Caspase-4參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。抑制Caspase-4的表達(dá)能抑制細(xì)胞的凋亡。在針對Caspase-4基因的5條反義寡核苷酸中，Cas4-3的體外保護(hù)細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。在0.2yM給藥濃度時，2Gy照射后細(xì)胞的存活率與單純照射組相比，細(xì)胞存活率增加了21.1%。集落形成實(shí)驗(yàn)表明Cas4-3反義寡扼苷酸處理后的細(xì)胞輻射后集落形成能力與單純照射組相比也明顯增加，抑制細(xì)胞的凋亡。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明中所涉及的寡核苷酸或其修飾組成物具有輻射防護(hù)的作用，可用于腫瘤放射治療中的輻射防護(hù)。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明中針對Caspase-4基因輻射防護(hù)的優(yōu)選序列為A3。圖1為反義寡核苷酸(O.2uM)在細(xì)胞水平上的輻射防護(hù)作用；其中con為未照射細(xì)胞對照，IR為單獨(dú)照射組,IR+Lip為脂質(zhì)體對照組，其余為不同反義序列轉(zhuǎn)染后照射組。圖2和3為不同濃度反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后對輻射后24h和48h細(xì)胞的輻射防護(hù)作用其中control為未照射對照組，IR為照射對照組，Scramble為隨機(jī)序列對照組，caspase4-3為反義組。圖4為0.4uM反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上對靶基因mRNA表達(dá)的抑制作用；圖5為0.4uM反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上對靶基因蛋白表達(dá)的抑制作用；圖6為0.4uM反義寡核苷酸增強(qiáng)細(xì)胞輻射后的集落形成能力；圖7為0.4uM反義寡核苷酸抑制輻射后細(xì)胞R0S的產(chǎn)生；圖8為反義寡核苷酸抑制輻射后細(xì)胞的凋亡。其中A:為未照射細(xì)胞對照；B:為單獨(dú)照射組，IR;C:為轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列對照組；D:為轉(zhuǎn)染0.2uMcaspase4-3組；D:為轉(zhuǎn)染0.4uMcaspase4-3組。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一體外輻射防護(hù)活性ASODN的篩選和評價1.材料和方法1.1反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)本研究選取了Caspase4基因作為靶標(biāo)進(jìn)行輻射防護(hù)反義寡核苷酸的篩選和評價，基因序列由Genbank獲得。根據(jù)靶基因的mRNA序列，利用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的基于多預(yù)測結(jié)構(gòu)的反義核酸設(shè)計(jì)軟件(軟件登記號2005SR12155)設(shè)計(jì)反義核酸序列(表1).1.2反義寡核苷酸的合成根據(jù)設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸序列，合成5條(Cas4-1-Cas4-5)反義序列(具體序列見表l)。反義硫代寡聚核苷酸為無色粉末狀，合成后濃氨水55'C脫保護(hù)15小時，然后用反向柱(購自solidphasescience公司)層析純化。體外實(shí)驗(yàn)用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基配制，保存于-2CTC。1.3細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及輻射防護(hù)活性測定人細(xì)胞株(A549)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所保存。用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37'C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液100uL，含4乂103細(xì)胞。待40-60%的細(xì)胞融合后，吸去培養(yǎng)液，用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗2次，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(GIBCO,lmg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染。反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染濃度為0.2MM，每個濃度重復(fù)3個孔，并設(shè)細(xì)胞和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6小時后，換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)行2Gy照射，照射后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時，每孔加20WMTS(CellTiter96Aqueousonesolutioncellproliferationassay,Promega)并繼續(xù)避光培養(yǎng)90min，在多標(biāo)記酶聯(lián)免疫檢測儀(VICTORWallac1420MultilabelCounter,Wallac)上測定490nm處吸光值A(chǔ),計(jì)算細(xì)胞存活率。1.4反義寡核苷酸在體外對靶基因mRNA表達(dá)的影響選取細(xì)胞水平輻射防護(hù)效果較好的A3硫代反義寡核苷酸，檢測其對靶mRNA表達(dá)的抑制作用。A549細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。將細(xì)胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL,含1.5X10S細(xì)胞。待40_60%的細(xì)胞融合后，吸去培養(yǎng)液，進(jìn)行硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度分別為0.l幽、0.2幽、0.4MM，并設(shè)細(xì)胞對照和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6h，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，TRIZ0L法(Gibco)提細(xì)胞總RNA,紫外定量并將各組提取物調(diào)至相同濃度。采用Reversetranscriptionsystem(P，ega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，及PCR擴(kuò)增耙基因mRNA。以看家基因NADPH作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙重PCR，設(shè)不加模板的空白對照。NADPH擴(kuò)增片段317bp，靶基因Caspase4擴(kuò)增片段為200bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠(Sigma)電泳檢査。1.5反義寡核苷酸在體外對靶基因蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。將A549細(xì)胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含1.5X1()5細(xì)胞。硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度為0.4MM，設(shè)細(xì)胞對照和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6h后，換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，RIPA-PICT(Pharmacia)提細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔5(Htg總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，并進(jìn)行Westernbloting觀察靶基因蛋白表達(dá)情況。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1反義寡核苷酸作用靶位的篩選圖1結(jié)果表明，5條反義序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)2Gy的照射，除cas-l和cas-5序列外，其余3條序列均能不同程度地提高細(xì)胞的存活率，其中0.2umol/LCas4-3反義轉(zhuǎn)染組與單獨(dú)照射組相比，細(xì)胞的存活率提高了21.1%,因此選擇Caas4-3進(jìn)行進(jìn)一步的分子水平分析。為了進(jìn)一步證實(shí)Cas4-3的輻射防護(hù)作用，又進(jìn)一步檢測了不同濃度反義藥物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的輻射防護(hù)作用。同時為了證明反義序列作用的特異性，同時還設(shè)計(jì)合成了一條隨機(jī)序列同時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從圖2和圖3可以看出，不同濃度Cas4-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞經(jīng)2Gy照射后24小時和48小時細(xì)胞的存活率均比單獨(dú)照射組提高，且有一定的劑量依賴關(guān)系，而轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列(Scramble)組細(xì)胞的存活率則與單獨(dú)照射組相似。表明Cas4-3的作用是序列特異的。2.2反義寡核苷酸對靶基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的影響反義藥物是通過抑制其靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)藥效作用，同時觀察靶基因的表達(dá)情況也是評價和衡量反義藥物作用特異性的一個重要指標(biāo)。由圖4可以看出，Cas4-3反義序列能抑制靶基因mRNA的表達(dá)且具有一定的量效關(guān)系，而隨機(jī)序列和脂質(zhì)體對照則均不能抑制靶基因的表達(dá)。進(jìn)一步檢測了反義寡核苷酸對靶基因蛋白表達(dá)的影響。由圖4可見，0.4umol/L濃度的Cas4-3可顯著抑制耙基因蛋白的表達(dá)，而隨機(jī)序列則無抑制作用。實(shí)施例二集落形成實(shí)驗(yàn)評價ASODN的輻射防護(hù)活性1.材料和方法1.1A549細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時，將細(xì)胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含2.0X10S細(xì)胞。待40-60%的細(xì)胞融合后，吸去培養(yǎng)液，進(jìn)行硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度為0.2幽，并設(shè)細(xì)胞對照和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6h，換含l(^胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)行2Gy、4Gy和6Gy的照射，照射完后，將細(xì)胞種植在直徑為30mm的平皿上，每個平皿含100個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，計(jì)算每個平皿中含50個以上細(xì)胞的集落數(shù)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.10.2umol/LCas4-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能提高輻射后細(xì)胞集落形成能力，其中2Gy照射后細(xì)胞集落形成率從67%提高到了89%，對4Gy和6Gy照射后細(xì)胞的集落形成能力也有不同程度的提高(圖5)。實(shí)施例三、氧自由基實(shí)驗(yàn)評價ASODN的輻射防護(hù)作用1.材料和方法1.1A549培養(yǎng)在96孔板上，反義藥物的轉(zhuǎn)染條件和方法同前面。反義寡核苷酸的濃度為0.2MM,并設(shè)隨機(jī)序列對照。轉(zhuǎn)染6h,換含l(^胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)行2Gy的照射，分別于照射后2，4，8和24小時檢測氧自由基(ROS)的產(chǎn)生。ROS的檢測采用DCFH-DA法進(jìn)行測定，細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，加入100ul含DCFH-DA溶液，置37度30min，細(xì)胞用PBS洗三次后，在488和525nm波長處進(jìn)行測定。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1從圖6可以看出，0.2umol/LCas4-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能抑制輻射后24h細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而在輻射后2，4，8h對R0S的產(chǎn)生則沒有明顯的抑制作用。表明Cas4-3的輻射防護(hù)作用部分是通過抑制ROS的產(chǎn)生而起作用的。實(shí)施例四細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評價ASODN的輻射防護(hù)作用1.材料和方法1.1A549細(xì)胞的培養(yǎng)和反義藥物的轉(zhuǎn)染條件和方法同上。反義寡核苷酸的濃度為0.2剛，并設(shè)細(xì)胞對照和隨機(jī)序列對照。轉(zhuǎn)染6h，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞進(jìn)行2Gy的照射，分別于照射后24h和48h檢測細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞的凋亡用AnnexV凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1從圖7可以看出，0.2umol/L和0.4umol/L的Cas4-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能抑制輻射后引起的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的凋亡率由原來照射后的4.3%分別降低到2.9%和1.8%，而隨機(jī)序列則沒有相應(yīng)的保護(hù)作用。核苷酸序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>凋亡基因Caspase-4為靶標(biāo)的反義寡核苷酸及其用途<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGTTGCGGTTGTTGAATAT20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3TTCCTCTAGGTGGCAGCACC20權(quán)利要求1.一種與凋亡基因Caspase45’和3’基因互補(bǔ)的反義寡核苷酸，其特征為寡核苷酸序列選自下列之一1)CAGTTGCGGTTGTTGAATAT2)TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA3)TTCCTCTAGGTGGCAGCACC。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸，其特征為組成寡核苷酸的磷酸二酯鍵部分的單鍵氧位置選自氧、甲基或硫。3.權(quán)利要求1或2所述任一寡核苷酸或其組合在制備輻射防護(hù)藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途，具體地說是根據(jù)凋亡相關(guān)基因(Caspase4)設(shè)計(jì)并制備的反義寡核苷酸。采用人細(xì)胞株(A549)，對所設(shè)計(jì)、制備的5條反義寡核苷酸進(jìn)行篩選及評價。體外實(shí)驗(yàn)可提高輻射后細(xì)胞的存活率，增加細(xì)胞輻射后的集落形成率，抑制輻射后細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并阻斷該基因表達(dá)。文檔編號A61K48/00GK101104632SQ20061009103公開日2008年1月16日申請日期2006年7月12日優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日發(fā)明者伯曉晨,婁紹科,林汝仙,王升啟申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所