專利名稱：Na的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是有關于一種丹參酚酸B鎂的異構物、前體、衍生物、其醫(yī)藥上可接受的鹽類或其組合物及其用途，特別是有關于其作為抑制負責細胞Na+/K+主動運輸?shù)腘a+/K+-ATP酶的用途。
背景技術：
傳統(tǒng)上，各種充血性心衰竭、心因性休克及心律不整的治療主要是利用烏本苷(ouabain)、地高辛(digoxin)等強心配醣體制劑來治療。這類強心劑的作用機轉為抑制心肌細胞Na+/K+-ATP酶的活性，進而抑制細胞的Na+/K+主動運輸需伴隨的磷酸根水解，減少鈉、鉀離子通過心肌細胞，使細胞內(nèi)的Na+濃度增高，導致升高鈉鈣交換效率并使內(nèi)流的鈣離子增多。因此，可加強心肌收縮，達到強心的作用，并且可降低傳導速率及延長房室結(AV node)的有效不反應期。
然而，由于強心配醣體具有抑制Na+/K+-ATP酶的功能，直接影響細胞的Na+/K+主動運輸，因此在急性過量投藥后會導致低血鉀癥，引發(fā)心率不齊、心搏過速及心室纖維顫動等癥狀。而毛地黃的藥物治療最主要的問題，在于其具非常狹小的治療劑量指數(shù)(therapeutic index)，因此藥物治療濃度與中毒時的藥物血中濃度并沒有明顯的界線，其治療劑量通常因人而異。其中，老年人、心臟病或腎功能不佳者，是中毒的高危險群。因此，使用強心配醣體藥物時必須找出最適當?shù)膭┝?，否則一不小心就會造成嚴重的中毒發(fā)生，甚至可能致命。
丹參為中國傳統(tǒng)的活血化瘀藥物，神農(nóng)本草經(jīng)中將丹參列為“上品”，其意為適合長期服用且無毒性作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)丹參中主要的有效成分的一為丹參酚酸B(Salvianolic acid B或magnesium lithospermate B、magnesium tanshinoate B)，為一種抗氧化劑，可促進新血管內(nèi)膜細胞的凋亡，防止內(nèi)膜增厚。此外，丹參亦具有增加血紅細胞膜表面電荷，防止血紅細胞聚集，降低血液粘滯度等保護心血管統(tǒng)的作用。因此，丹參目前被廣泛使用于一般保健及疾病治療上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種丹參酚酸B鎂(MLB)作為細胞Na+/K+-ATP酶抑制劑的新用途，解決傳統(tǒng)強心配醣體藥物的治療劑量指數(shù)狹小，容易造成中毒癥狀的問題。
依照本發(fā)明的較佳實施例，分別公開了利用大腦皮質及心肌細胞膜粗萃物來測試MLB抑制Na+/K+-ATP酶活性的結果。隨著丹參酚酸B鎂的劑量愈高，測量到的磷酸根濃度愈低，顯示其抑制ATP水解的能力與丹參酚酸B鎂的劑量成正比。根據(jù)此成比例的結果可推定丹參酚酸B鎂具有抑制細胞Na+/K+-ATP酶活性的作用，可作為Na+/K+-ATP酶抑制劑。
依照本發(fā)明的另一較佳實施例，公開了各濃度下烏本苷(ouabain)或丹參酚酸B鎂對Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差異。結果顯示，丹參酚酸B鎂與強心配醣體烏本苷對于細胞Na+/K+-ATP酶具有一致的抑制效應。即隨著Na+/K+-ATP酶抑制劑(丹參酚酸B鎂或烏本苷)劑量愈高，其抑制ATP水解的能力愈強。
由上述本發(fā)明較佳實施例可知，由丹參酚酸B鎂制成的保健食品或醫(yī)藥組合物可具有與強心配醣體等效的功能，在醫(yī)藥上可取代強心配醣體的強心、利尿的用途，卻不具有強心配醣體使用上的容易發(fā)生中毒的危險性。
為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加容易了解，在下文中配合附圖及文字敘述，說明本發(fā)明的實施例。


為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，所附圖式的詳細說明如下圖1顯示不同濃度的丹參酚酸B鎂對大鼠大腦皮質細胞的Na+/K+-ATP酶活性抑制效果；圖2為比較各濃度下烏本苷(ouabain)或丹參酚酸B鎂對Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差異；圖3是丹參酚酸B鎂與強心配醣體類的分子結構的比較；
圖4是利用大腦皮質細胞膜粗萃物來測試丹參酚酸B鎂抑制Na+/K+-ATP酶活性的結果；圖5是利用心肌細胞膜粗萃物來測試丹參酚酸B鎂抑制Na+/K+-ATP酶活性的結果。
具體實施例方式
本發(fā)明公開了丹參酚酸B鎂可作為細胞的Na+/K+-ATP酶抑制劑的新用途。圖1顯示不同濃度的丹參酚酸B鎂對大鼠心肌細胞的Na+/K+-ATP酶活性抑制效果，其實驗操作步驟如下以三個月齡的公大鼠(Spraque-Dawley；NarllSD)為實驗動物，并飼養(yǎng)于不含病原體的環(huán)境下。飼養(yǎng)期間除提供實驗動物專用的飼料(RodentLaboratory Chow 5001，Purina，MO)及自來水飲用外，并給予人道的對待。最后，犧牲實驗動物，并于完全除血后直接取得其大腦皮質(brain cortex)及心肌組織。
接下來，于4℃下分離大鼠的腦及心肌細胞膜樣本。再將大鼠腦細胞或心肌細胞懸浮于10到20倍體積的0.32M蔗糖溶液中(含有5mM4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)及1.0mMEDTA，pH7.5)進行均質化。然后，此大腦皮質細胞均質物或心肌細胞均質物在離心力17000×g下離心30分鐘，以得到細胞膜粗萃物。
接著，清洗細胞膜粗萃物二次，并再懸浮于0.32M蔗糖溶液中，用以進行由0.3、0.8及1.0mM所組成的連續(xù)蔗糖濃度梯度離心，并在離心力63000×g下離心1小時。最后收集介于濃度梯度0.8與1.0mM的區(qū)間的細胞膜，并于2小時內(nèi)進行Na+/K+-ATP酶的酵素活性分析。
細胞的Na+/K+-ATP酶活性量測借助量測ATP水解產(chǎn)生的無機磷酸根(Pi)的數(shù)量來測量細胞的Na+/K+-ATP酶活性。
首先，將商品化的Na+/K+-ATP酶(購自Sigma公司；來源為豬大腦皮質)或自行純化的Na+/K+-ATP酶(來源為大鼠大腦皮質或心肌細胞膜)分別混入反應混合物(3mM ATP，5mM MgCl2，80mM NaCl，20mM KCl，40mM Tris-HCl，pH7.4)中。經(jīng)過15分鐘后，以200微升(μl)的30％(W/V)三氯醋酸(trichloroacetic acid)終止反應。
接著，依照Goldberg等人所述的方法，于6000轉數(shù)(rpm)下離心約15分鐘后，取500μl的上清液，以分光光度計來量測磷酸根(Pi)數(shù)量。Na+/K+-ATP酶的活性以每小時中每毫克Na+/K+-ATP酶作用下所產(chǎn)生的磷酸根的微摩爾(μmol)來表示。
蛋白質含量以一購自Sigma公司的Bradford protein assay kit來定量。不同濃度下烏本苷(ouabain)或丹參酚酸MLB對Na+/K+-ATP酶的抑制效率，在商品化的Na+/K+-ATP酶或自行純化的大鼠細胞Na+/K+-ATP酶混入反應混合物前10分鐘，于37℃條件下觀察。
請參照圖1，橫軸為加入反應混合物的丹參酚酸B鎂的濃度，縱軸為磷酸根(Pi)的濃度。如圖1所示，隨著加入的丹參酚酸B鎂劑量增加(由0mg到10mg)，所量測到的磷酸根(Pi)濃度持續(xù)減少，顯示丹參酚酸B鎂劑量愈高，其抑制ATP水解的能力愈強。由該成比例的結果可推定丹參酚酸B鎂具有抑制Na+/K+-ATP酶活性的作用，可作為Na+/K+-ATP酶抑制劑。
由圖1的結果發(fā)現(xiàn)，丹參酚酸B鎂具有與強心配醣體類似的作用機制，即抑制Na+/K+-ATP酶活性。因此，圖2為比較各濃度下烏本苷(ouabain)或丹參酚酸MLB對Na+/K+-ATP酶的抑制效率的差異。結果顯示，丹參酚酸B鎂具有與強心配醣體烏本苷一致的抑制效應，即隨著Na+/K+-ATP酶抑制劑(丹參酚酸B鎂或烏本苷)劑量愈高，其抑制ATP水解的能力愈強。
請參照圖3，繪示丹參酚酸B鎂與強心配醣體類的分子結構。強心配醣體310的結構以固醇類的環(huán)戊氫菲環(huán)化合物及至少一個糖基所構成。丹參酚酸B鎂320的結構為以金屬離子(M)為中心的結構。根據(jù)圖2的結果，顯示丹參酚酸B鎂對于Na+/K+-ATP酶活性具有與強心配醣體烏本苷一致的抑制效應，鑒于酵素的活化借助鑰匙/鎖模式(key and lock)，推定丹參酚酸的結構在Na+/K+-ATP酶水解ATP的機制中扮演與強心配醣體結構相同的角色，即利用形成相似的構形或借助分子間的引力使Na+/K+-ATP酶不活化。
依照本發(fā)明的較佳實施例，丹參酚酸B鎂320的中心離子M可為金屬離子，其中以二價金屬離子為較佳，例如鎂、鐵、錳、鈣、鋅、銅或鈷離子。此外丹參酚酸B鎂320的官能基支鏈R可以為-H、-OH、烷基或上述的任意組合。
請參照圖4及圖5，利用不同器官的細胞膜粗萃物來測試丹參酚酸B鎂抑制Na+/K+-ATP酶活性的效果。圖4利用大腦皮質細胞膜粗萃物來測試丹參酚酸B鎂抑制Na+/K+-ATP酶活性的結果，其中橫軸為加入反應混合物的丹參酚酸B鎂的濃度，縱軸為磷酸根(Pi)的濃度。結果如圖4所示，隨著Na+/K+-ATP酶抑制劑(丹參酚酸B鎂)劑量愈高，磷酸根的濃度愈低，顯示其抑制ATP水解的能力與丹參酚酸B鎂的劑量成正比。因此，丹參酚酸B鎂具有抑制大腦皮質細胞膜的Na+/K+-ATP酶的能力。
圖5利用心肌細胞膜粗萃物來測試丹參酚酸B鎂抑制Na+/K+-ATP酶活性的結果，其中橫軸為加入反應混合物的丹參酚酸B鎂的濃度，縱軸為磷酸根(Pi)的濃度。結果呈現(xiàn)與圖4一致的結果，隨著Na+/K+-ATP酶抑制劑(丹參酚酸B鎂)劑量愈高，磷酸根的濃度愈低，顯示其抑制ATP水解的能力與丹參酚酸B鎂的劑量成正比。因此，丹參酚酸B鎂具有抑制心肌細胞膜的Na+/K+-ATP酶的能力。
根據(jù)上述實驗結果，證明丹參酚酸B鎂具有抑制心肌細胞膜Na+/K+-ATP酶活性的作用，因而會產(chǎn)生減少鈉、鉀離子通過心肌細胞，并使內(nèi)流的鈣離子增多的生理效應。因此，丹參酚酸B鎂具有與強心配醣體相同的作用機轉及效果，即加強心肌收縮，達到強心、利尿的用途。
依照本發(fā)明的較佳實施例，丹參酚酸B鎂可用于治療下列的疾病，例如充血性心臟衰弱、心率不齊、心房纖維顫動心房撲動、陣發(fā)性上心室搏動過速高血壓、水腫以及與上述疾病進展有關的病癥。
此外，本發(fā)明公開丹參酚酸B鎂具有與強心配醣體等效的用途，可于有效劑量下達到強心、利尿的用途，因此可提供取代強心配醣體的另一選擇，發(fā)展為保健食品或藥物。
依照本發(fā)明的較佳實施例，丹參酚酸B鎂及其衍生物的結構可取代強心配醣體或其它固醇類藥物的環(huán)戊氫菲環(huán)化合物結構，達到等效的作用。其中，丹參酚酸B鎂及其衍生物包含其前體或其衍生物、前體的異構物，及其醫(yī)藥上可接受的鹽類。
依照本發(fā)明的較佳實施例，組合物可以丹參酚酸B鎂為其有效成分，用于抑制Na+/K+-ATP酶活性的用途。丹參酚酸B鎂于此組合物中的形式可包含其醫(yī)藥可接受的鹽類、溶劑化物、其鹽類的溶劑化物、多晶形或前藥。此外，以丹參酚酸B鎂為有效成分制成的組合物可搭配食品或醫(yī)藥上容許的載體，例如醫(yī)藥可接受性輔劑、稀釋劑、賦形劑或上述的任意組合。
由上述本發(fā)明較佳實施例可知，由丹參酚酸B鎂制成的保健食品或醫(yī)藥組合物可具有與強心配醣體等效的功能，可于有效劑量下達到抑制細胞Na+/K+ATP酶活性的作用，在醫(yī)藥上可取代強心配醣體的強心、利尿的用途，卻不具有強心配醣體使用上的容易發(fā)生中毒的危險性。
雖然本發(fā)明已以一較佳實施例公開如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的構思和范圍內(nèi)，當可作各種的改變與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當以權利要求所界定者為準。
權利要求
1.一種丹參酚酸B鎂的異構物、前體、衍生物或其醫(yī)藥上可接受的鹽類作為Na+/K+-ATP酶抑制劑的用途，其特征在于可抑制磷酸根水解，以抑制細胞內(nèi)外的Na+/K+交換，并使細胞內(nèi)的鈣離子增加。
2.一種細胞膜的Na+/K+-ATP酶抑制劑，以及其衍生物、前體和衍生物、前體的異構物，其具有如下的基本結構 其中該R為-H、-OH、烷基或上述的任意組合；該M為金屬離子。
3.一種抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，以具有權利要求2所述的結構的化合物或其前體、衍生物或上述的衍生物、前體的異構物的其中之一為有效成分。
4.如權利要求3所述的抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，其中該有效成分包含其醫(yī)藥可接受的鹽類、溶劑化物、該鹽類的溶劑化物、多晶形或前藥。
5.如權利要求3所述的抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，進一步包含食品或醫(yī)藥上容許的載體，該載體至少包含醫(yī)藥可接受的輔劑、稀釋劑、賦形劑或上述的任意組合。
6.如權利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，其中該組合物為醫(yī)藥組合物或保健食品。
7.如權利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，其用于制備強心藥。
8.如權利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，其用于制備利尿藥。
9.如權利要求3所述抑制Na+/K+-ATP酶活性的組合物，其用于制備治療下列疾病的藥物a)充血性心臟衰弱；b)心率不齊，包含心房纖維顫動、心房撲動、陣發(fā)性心室搏動過速；c)高血壓；d)水腫；e)冠心病，包含心絞痛、心肌梗塞；以及與上述疾病進展有關的病癥。
10.一種利用環(huán)戊氫菲環(huán)化合物性質的藥物的衍生結構，其特征在于用如權利要求2所示的化合物來取代具有環(huán)戊氫菲環(huán)化合物性質的藥物的環(huán)戊氫菲環(huán)結構。
全文摘要
一種丹參酚酸B鎂(magnesium lithospermate B；MLB)的異構物、前體、衍生物、其醫(yī)藥上可接受的鹽類或其組合物作為Na
文檔編號A61P9/04GK101084887SQ20061009157
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權日2006年6月8日
發(fā)明者靳子蓉, 陳怡菁, 曾志正 申請人:杰升國際科技股份有限公司